一种嵌合病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种乙脑病毒感染性克隆，它是包含乙脑病毒减毒株SA14-14-2基因组全长cDNA的重组载体；本发明还公开了一种嵌合病毒，以及该嵌合病毒的用途；以及一种SEQ ID NO.1所示的细菌人工染色体。本发明嵌合病毒能在多种人用疫苗生产用细胞上生长繁殖，并且生长特性类似，可以用于四个血清型登革疫苗的生产，并且，免疫原性强，产生的抗体滴度高，具有良好的应用前景，有较强的工业应用价值。

权利要求

1.嵌合病毒，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8～11任意一项所示。

2.权利要求1所述的嵌合病毒在制备登革热疫苗中的用途。

说明书

一种嵌合病毒及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种嵌合病毒，特别涉及一种嵌合了登革病毒保护性抗原的乙脑病毒感染性克隆。

背景技术

[0002] 登革热是被WHO喻为危害最为严重的被忽视的热带和亚热带传染病之一。据WHO统计，自1955年发现该病以来，WHO报告的登革病例增长了约30倍。目前，全球有近一半人口（35亿）生活在登革热的流行区域，每年发病例大约为5000万，但是目前全球还没有疫苗可供使用。

[0003] 登革疫苗研发的关键难点是登革病毒按血清型分为四种，即登革1型、登革2型、登革3型、登革4型，并在流行区域交替出现。四个血清型之间虽然有交叉反应，但没有交叉保护或交叉保护很弱，持续时间很短，仅有数月。当感染某种血清型的登革病毒后，一般仅表现症状较弱的临床症状或无症状，如再被另一种血清型登革病毒感染，会出现抗体依赖的病理增强作用，表现为潜伏期短，临床症状明显加重，可能出现严重的出血、休克或死亡。因此必须研发能同时保护4个血清型登革病毒的四价登革疫苗。由于4个血清型登革病毒生长特性差别大、免疫应答能力各异，要维持4个型登革疫苗之间一定的免疫反应水平的平衡具有一定的技术难度。因此，迄今没有安全有效疫苗上市。

[0004] 申请号：200910085231.6，发明名称：乙脑/登革嵌合病毒及其应用的专利申请是利用乙脑减毒疫苗株SA14-14-2为基因骨架，将登革2型病毒NGC株抗原基因prM-E替换乙脑疫苗株相应基因区域构建而成。由于该专利产品仅能在蚊子细胞C6/36上繁殖，该细胞不能用于人用疫苗的生产，且仅为乙脑/登革2型一种嵌合病毒，无法进行疫苗生产，存在很大缺陷。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的乙脑病毒感染性克隆，以该乙脑病毒感染性克隆为骨架的登革嵌合病毒，以及登革疫苗和新的细菌人工染色体。

[0006] 本发明乙脑病毒感染性克隆，其是包含乙脑病毒减毒株SA14-14-2基因组全长cDNA的重组载体。

[0007] 其中，所述重组载体是重组pACNR质粒或者重组细菌人工染色体，细菌人工染色体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 其中，所述全长cDNA的5’端具有原核启动子。所述启动子为SP6。

[0009] 所述全长cDNA的3’端的转录终止位点为限制性内切酶酶切位点。所述限制性内切酶酶切位点为XhoI或SalI。

[0010] 优选地，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示。

[0011] 本发明嵌合病毒，它由前述乙脑病毒感染性克隆构建而成，其中prM-E基因为登革病毒prM-E基因。

[0012] 其中，所述登革病毒是登革病毒1、2、3或4型。

[0013] 其中，所述登革病毒1型为登革病毒ThD0008-81株；所述登革病毒2型为登革病毒PUO-218株；所述登革病毒3型为登革病毒PaH881-88株；所述登革病毒4型为登革病毒814669株。

[0014] 其中，所述登革病毒prM-E基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4~7所示。

[0015] 所述嵌合病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8~11任意一项所示。

[0016] 前述嵌合病毒在制备登革热疫苗中的用途。

[0017] 本发明还提供了一种登革热疫苗，它是由前述的嵌合病毒制备而成。

[0018] 本发明还提供给了一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的细菌人工染色体。

[0019] 本发明利用乙脑减毒疫苗株SA14-14-2和本发明细菌人工染色体，成功地构建了乙脑病毒感染性克隆，并以该感染性克隆为基因骨架，成功构建了含有登革1型、登革2型、登革3型或者登革4型病毒抗原基因prM-E的乙脑/登革嵌合病毒，这些嵌合病毒能在多种人用疫苗生产用细胞上生长繁殖，并且生长特性类似，可以用于四个血清型登革疫苗的生产，免疫原性强，产生的抗体的滴度高，具有良好的应用前景。

[0020] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0021] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0022] 图1 BAC载体改造（BAC53）后HindⅢ&Kpn Ⅰ双酶切验证图，泳道1、2、3、4为挑选的4个克隆，M为DNA分子量标准DL15000)；

[0023] 图2 JEV 5′半分子质粒pJEV5′构建的酶切鉴定结果，其中第1泳道是DNA marker(DL15000);第2泳道是质粒载体pACNR;第3泳道是将F1片段插入到载体pACNR后的pACNR-F1克隆;第4泳道是将F1片段和F3片段插入到载体pACNR后的pACNR-F13;第5泳道是将F1、F2和F3片段插入到载体pACNR后的5′半分子质粒pJEV5′;第6泳道是对5′半分子质粒pJEV5′用限制内切酶AscI和KasI进行酶切验证的结果，第7泳道是对
5′半分子质粒pJEV5′用限制内切酶BglII和KasI进行酶切验证的结果，第8泳道是对
5′半分子质粒pJEV5′用限制内切酶BglII和BspEI进行酶切验证的结果，第9泳道是对
5′半分子质粒pJEV5′用限制内切酶AscI和Xhol进行酶切验证的结果，第10泳道是DNA marker(DL2000)；

[0024] 图3 pJFC全长质粒结构示意图,红色的箭头表示人为加入的启动子序列，AscI酶切位点为人为加入用于克隆构建，蓝色部分表示乙脑减毒疫苗株SA14-14-2全长cDNA；

[0025] 图4 pJFC全长质粒酶切鉴定结果，其中泳道1为DNA marker DL15000；泳道2为pJFC全长质粒；泳道3为pJFC经HindIII酶切的电泳图谱；泳道4为pJFC经BglII酶切的电泳图谱；泳道5为DNA marker DL2000；

[0026] 图5 BAC53-JFC全长质粒酶切鉴定结果，其中泳道1为BAC53-JFC经NotI和XhoI酶切的电泳图谱；泳道2为DNA marker DL2000；M为DNA markerDL15000；

[0027] 图6 RT-PCR检测rJEV的电泳结果。泳道1为DNAmarker(λDNA/HindIII)，泳道2为DNA marker(DL2000)，泳道3为PCR扩增F123片段,泳道4为PCR扩增F45片段，泳道5为PCR扩增F67片段泳道6为PCR扩增F89片段,泳道7为PCR扩增F10片段,泳道
8为PCR扩增F11片段；

[0028] 图7间接免疫荧光检测rJEV结果。其中A、B分别是减毒株JEV感染细胞后用JEV E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；C、D分别是恢复病毒rJEV感染细胞后用JEV E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；E、F分别是未感染的细胞对照用JEV E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；

[0029] 图8 rJEV与乙脑疫苗株JEV的蚀斑形态比较；

[0030] 图9乙脑/登革1型嵌合的5’半分子克隆pJD1-5’质粒电泳图；

[0031] 图10乙脑/登革1型嵌合的5’半分子克隆pJD1-5’质粒用NotI和BglII双酶切的电泳图；

[0032] 图11乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒pJD1FC电泳图；

[0033] 图12乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒pJD1FC用NotI和XhoI双酶切的电泳图；

[0034] 图13乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒pJD1FC分别用BamHI和XhoI单酶切的电泳图；

[0035] 图14乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒pJD1FC体外转录产物的电泳图；

[0036] 图15乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒pJD1FC体外转录产物转染细胞BHK21后的细胞病变，左边图为未转染的细胞对照，右边为转染后的细胞病变；

[0037] 图16嵌合病毒JD1在原代地鼠肾细胞上传代后的病变结果，左边为未感染的细胞对照，右边为感染后的细胞病变；

[0038] 图17嵌合病毒JD1的RT-PCR检定的电泳图，扩增片段1、2、3都和预期一致；

[0039] 图18乙脑/登革1型嵌合病毒JD1的蚀斑检测结果；

[0040] 图19乙脑/登革1型嵌合病毒JD1中登革病毒1型E蛋白表达Westernblot检测结果；

[0041] 图20乙脑/登革1型嵌合病毒JD1在原代地鼠肾细胞PHK上的生长特性检测结果；

[0042] 图21乙脑/登革1型嵌合病毒JD1的免疫原性检测结果；

[0043] 图22乙脑/登革2型嵌合全长克隆pJD2FC酶切鉴定。1为DNAmarker(DL15000);2为pJD2FC质粒;3为pJD2FC质粒HindIII酶切图谱;4为pJD2FC质粒BglII酶切图谱;5为pJD2FC质粒双酶切图谱（AscI+Xhol);6为pJD2FC质粒双酶切图谱(BspEI+Xhol);7为DNA marker(DL2000)；

[0044] 图23乙脑/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠肾细胞上的细胞病变，左边为未感染对照细胞，右边为JD2感染PHK细胞后的细胞病变；

[0045] 图24 RT-PCR检测嵌合病毒JD2的电泳图。1为DNA marker(DL15000);2为PCR扩增片段F123;3为PCR扩增片段F45;4为PCR扩增片段F67;5为PCR扩增片段F89;6为PCR扩增片段F10;7为PCR扩增片段F11；

[0046] 图25间接免疫荧光检测乙脑/登革2型嵌合病毒JD2的实验结果。其中A、B、C是登革2型病毒感染细胞后分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；D、E、F是嵌合病毒JD2分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；G、H、I是乙脑恢复病毒rJEV分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEVNS1单克隆抗体检测的结果；J、K、L是未感染病毒的细胞分别用登革2型单克隆抗体、JEV的E单克隆抗体和JEV NS1单克隆抗体检测的结果；

[0047] 图26乙脑/登革2型嵌合病毒JD2蚀斑形态及大小；

[0048] 图27乙脑/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠肾细胞上的生长曲线；

[0049] 图28乙脑/登革2型嵌合病毒JD2的免疫原性检测结果；

[0050] 图29有8个碱基缺失的乙脑/登革3型嵌合5’半分子pJD3-5’双酶切(Kas Ⅰ/Bgl Ⅱ)鉴定电泳图；

[0051] 图30融合PCR扩增1-3446片段，消除缺失的8个碱基；

[0052] 图31乙脑/登革3型嵌合5’半分子BAC53JD3-5’双酶切鉴定电泳图，泳道1为BamH Ⅰ单酶切，泳道2为Asc Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切；

[0053] 图32用于构建含有SalI酶切位点的JEV 3’半分子pJEV-3’（Sal Ⅰ）的JEV-F11片段PCR扩增电泳图；

[0054] 图33含SalI酶切位点的JEV3’半分子pJEV3’(Sal I)酶切鉴定电泳图，泳道1是Xho Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切，泳道2为SalI/XbaI双酶切；

[0055] 图34乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53JD3FC质粒用HindIII限制内切酶进行酶切鉴定的电泳图，泳道1为pJD3质粒，M1为分子量标准DL 15,000,M2为分子量标准DL2,000；

[0056] 图35乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53JD3FC质粒用XhoI限制内切酶进行酶切鉴定的电泳图，泳道1为pJD3质粒，M为分子量标准DL15,000；

[0057] 图36乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53-JD3FC体外转录RNA电泳图，1为体外转录RNA，M1为分子量标准DL15,000,M2为分子量标准DL2，000；

[0058] 图37 PHK细胞的病变情况，与对照细胞相比（左），感染了乙脑/登革3型嵌合病毒的细胞（右）出现明显CPE；

[0059] 图38乙脑/登革3型嵌合病毒采用登革1~登革4型特异检测引物的RT-PCR鉴定结果，只有登革3型检测引物扩增出长度为615bp的片段；

[0060] 图39乙脑/登革3型嵌合病毒的蚀斑检测结果，根据蚀斑计数得到的病毒滴度为5.93lgPFU/ml；

[0061] 图40乙脑/登革3型嵌合病毒生长曲线，根据结果MOI为0.001为最佳感染剂量；

[0062] 图41乙脑/登革3型嵌合病毒的Western blot鉴定。结果显示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相应位置可观察到清晰条带，乙脑病毒未见条带；

[0063] 图42乙脑/登革3型嵌合病毒JD3的免疫原性测定结果；

[0064] 图43乙脑/登革4型5’半分子克隆pJD4-5’质粒的电泳图谱。pJD4-5’half质粒大小为6.3kb；

[0065] 图44乙脑/登革4型5’半分子克隆pJD4-5’质粒的酶切鉴定图谱。pJD4-5’质粒经KasI和BglII双酶切为4.1kb和2.2kb片段；

[0066] 图45乙脑/登革4型全长克隆pJD4FC质粒的电泳图谱。pJD4FC质粒大小为13.6kb；

[0067] 图46乙脑/登革4型全长克隆pJD4FC质粒的酶切鉴定图谱。pJD4FC质粒经BspEI和MluI双酶切为8.9kb和4.7kb片段；

[0068] 图47 pJD4FC体外转录产物的电泳图谱；

[0069] 图48 BHK21细胞的病变情况，与对照细胞相比（左），转染了pJD4FC体外转录物的细胞（右）出现明显CPE；

[0070] 图49 PHK细胞的病变情况，与对照细胞相比（左），感染了乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的细胞（右）出现明显CPE；

[0071] 图50乙脑/登革4型嵌合病毒的RT-PCR鉴定结果，采用4对引物分别扩增出长度为2078bp、2155bp、820bp和1608bp的片段；

[0072] 图51乙脑/登革4型嵌合病毒的蚀斑检测结果，根据蚀斑计数得到的病毒滴度为5.99lgPFU/ml；

[0073] 图52乙脑/登革嵌合病毒在PHK细胞中的生长曲线；

[0074] 图53乙脑/登革嵌合病毒的Western blot鉴定。结果显示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相应位置可观察到清晰条带，乙脑病毒未见条带；

[0075] 图54乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的免疫原性检测结果。

[0076] 具体实施实例

[0077] 实施例1：含JEV疫苗株SA14-14-2全长感染性全长cDNA克隆的构建、鉴定及重组病毒的恢复

[0078] 一、载体的改造

[0079] （1）低拷贝质粒pACNR的改造

[0080] 分别溶解引物Oligo-1（5'-CGCGCCATTAGGCGCCTTATAGATCTAATGTCCGGATTATGGATCCTGATTGATCATTATTCTAGAATTAC-3',下划线处依次为KasI、BglII、BspEI、BamHI、BclI、XbaI识别位点，人工合成）和Oligo-2（5'-TCGAGTAATTCTAGAATAATGATCAATCAGGATCCATAATCCGGACATTAGATCTATAAGGCGCCTAATGG-3'，与Oligo-1形成互补双链后，5'和3'端分别形成Ascl和Xhol酶切后粘端，人工合成）于100μl灭菌双蒸水中，各取10μl混合，加热到100℃后自然冷却，取2μl与用AscI和Xhol双酶切的pACNR于4℃连接过夜，转化感受态细胞TOP10（天根生化科技（北京）有限公司），挑取氨苄青霉素抗性克隆抽提质粒做测序鉴定（上海英潍捷基生物技术有限公司）。

[0081] 测序结果表明：酶切位点被植入质粒的多克隆区，得到多克隆区位点经改造的pACNR质粒。

[0082] （2）BAC53载体的改造

[0083] 首先以载体pBAC53e3.6序列为模板设计如下三对引物：

[0084] BAC53F1：

[0085] 5-GAAGCTTGGATCCGCATGCGTCGACCTCGAGCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3（划线部分为加入的部分多克隆酶切位点，依次为HindⅢ，BamH Ⅰ，Bsiw Ⅰ，Sal Ⅰ和Xho Ⅰ）[0086] BAC53R1：

[0087] 5-TTGGTACCTCTAGAACGCGTGGCTTCGCCCTGTCGCTCG-3（划线部分为限制内切酶酶切位点，Kpn Ⅰ和Mlu Ⅰ，其中MluI为引入的酶切位点）

[0088] BAC53F2：5-GGACGCGTTGAGCGAGGAAGCACCAGGGAAC-3（划线部分为人为加入的限制内切酶酶切位点Mlu Ⅰ）

[0089] BAC53R2：5-TGAATATGAAGATCTGGTACCCATCCGTGA-3（划线部分为限制内切酶酶切位点Kpn I）

[0090] BAC53F3：5-GGACGCGTCCTCAATGTATCACGGATGGGTACCAGATCT-3（划线部分为限制内切酶酶切位点，Mlu Ⅰ和Kpn I，其中其中MluI为引入的酶切位点）

[0091] BAC53R3：

[0092] 5-GGAAGCTTGGCGCCGGCGCGCCGCTAGCGCGGCCGCAGCGACACACTTGCATCGGATGC-3（划 线部分为加入的部分多克隆酶切位点，依次为HindⅢ，Kas Ⅰ，Asc Ⅰ和Not Ⅰ）[0093] 取2μl pBAC53e3.6质粒DNA为模板，分别用引物BAC53F1和BAC53R1、BAC53F2和BAC53R2、BAC53F3和BAC53R3配对扩增相应的PCR片段，分别命名为BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3。所用DNA聚合酶为美国NEB公司的 超保真DNA聚合酶，扩增条件为：98℃2min预变性；98℃10sec，58℃15sec，72℃1.5min，30循环；72℃10min。扩增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA进行加A反应：10×LA buffer 1μl,dNTP1μl,DNA
7.5μl,LA 0.5μl，72℃30min.反应结束，直接与PROMEGA公司的pGEM-T easy载体进行连接反应。2×Rapid ligation buffer 5μl,pGEM-T easy1μl,加A的PCR产物3μl，T4DNA ligase 1μl,4℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞TOP10,铺于含有100ug/ml的氨苄青霉素LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行测序鉴定。

[0094] 将测序正确的上述三个片段的克隆分别用限制内切酶HindIII和MluI、MluI和KpnI、KpnI和HindIII酶切消化，回收片段BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3，T4DNA ligase1μl,4℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH10B,铺于含有25ug/ml氯霉素的LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行测序鉴定，命名为BAC53，经测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。

[0095] 用限制内切酶HindⅢ和Kpn Ⅰ进行酶切验证，如图1所示，酶切图谱和理论一致。

[0096] 二、JEV减毒株SA14-14-2病毒cDNA的制备

[0097] （1）JEV减毒株SA14-14-2病毒RNA的抽提

[0098] JEV疫苗病毒（SA14-14-2株）由成都生物制品研究所有限责任公司生产，按说明书复溶，取400μl病毒液用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒（Highpure viral RNA kit）进行RNA的抽提（按说明书进行），RNA保存于-80℃备用。

[0099] （2）病毒cDNA的逆转录

[0100] 将提取的病毒 RNA（分别取 11μl） 分别用两条引物RR5(5'-GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3') 和 RR13(5'-AGATCCTGTGTTCTTCCT
CACCACCAGCTACA-3')逆转录病毒cDNA,所用试剂盒为Invitrogen公司SuperS criptTM III Reverse Transcriptase，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，方法参照试剂盒说明书进行。

[0101] （3）病毒cDNA片段的PCR扩增及测序

[0102] 取病毒cDNA 2μl为模板，分别引物F1和R1、F2和R3、F4和R4、F5和R6、F7和R8、F9和R10、F11和R11配对扩增相应的cDNA片段（引物信息见表1），所用DNA聚合酶为TaKaRa公司的PrimeSTAR，用降落PCR(Touch-down PCR)进行扩增，扩增条件为：98℃2min；98℃10sec，58.5℃→53.5℃10sec 72℃kb/min，10循环；98℃10sec 53.5℃10sec，
72℃kb/min，20循环；72℃10min。扩增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA进行加A反应：10×LAbuffer1μl,dNTP 1μl,DNA 7.5μl,LA 0.5μl，72℃30min.反应结束，直接与TaKaRa公司的T载体pMD19-T进行连接反应。2×ligation buffer 5μl,pMD19-T1μl,加A的PCR产物3μl，ligase1μl,4℃连接过夜。连接产物铺于含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行酶切和测序鉴定。

[0103] 表1克隆所用引物

[0104]

[0105]

[0106] 结果显示：以cDNA为模板，扩增出了与理论大小相应的7个DNA片段，大小分别为0.5kb，2.2kb，0.8kb，2.1kb，1.5kb，2.1kb，1.8kb。并且，7个片段都成功克隆到pMD19-T，测序结果表明：除了片段1和2人为引入的沉默突变以外，所有片段均无碱基突变、插入和缺失。

[0107] 三、含有JEV 5′半分子（碱基1-3450）质粒、含有JEV 3′半分子(3445-10977)质粒以及含JEV病毒全长cDNA载体的构建

[0108] （1）含有JEV 5′半分子（碱基1-3450）质粒的构建及酶切鉴定

[0109] 按图1的程序把5′端的3个扩增片段（大小分别为0.5kb，2.2kb，0.8kb）分别用AscI和KasI、KasI和BglII、BglII和BspEI依次克隆到步骤一制备得到的pACNR中，得到含有JEV 5′半分子质粒pJEV5′。

[0110] 结果表明：3个大小不同的DNA片段被成功克隆到低拷贝质粒中，见图2。

[0111] （2）含JEV病毒全长cDNA的构建及鉴定

[0112] 按图3所述方法把所扩增的3′端的4个DNA片段拼接并克隆到pJEV5′中相应酶切位点，得到含有JEV全长cDNA的质粒，命名为pJFC，其结构示意图见图3。

[0113] 同时用限制性内切酶NotI和XhoI将pJFC上的乙脑全长cDNA切下，插入到细菌人工染色体（BAC53）中,构建成JEV全长克隆BAC53-JFC。

[0114] 用QIAGEN公司的大提试剂盒（QIAfilter Plasmid Maxi Kit）大量提取质粒，送上海英潍捷基生物技术有限公司测序，并同时用限制性内切酶对质粒进行酶切鉴定。

[0115] 结果表明：酶切结果与理论相吻合（见图4，5）；根据测序图谱，可读出pJFC与该BAC53-JFC的序列分别如SEQ ID NO.2和3所示，除人为引入的C蛋白基因第378个核苷酸的沉默突变以外，JEV病毒其余各部分无碱基突变、插入和缺失。

[0116] （3）含有JEV 3′半分子(3445-10977)质粒的构建及鉴定

[0117] 用BspEI和Xhol双酶切质粒pJFC，回收7.5kb大小的DNA片段，与用相同酶切的低拷贝质粒pACNR连接，筛选鉴定重组子，命名为pJEV3′。

[0118] 酶切和测序结果表明：含有JEV 3′半分子（碱基3445-10977）质粒构建成功。

[0119] 四、JEV全长感染性cDNA克隆的体外转录、转染及JEV恢复病毒（rJEV）的拯救及传代

[0120] 于37℃用Xhol消化pJFC约3h后，加入绿豆核酸酶于30℃作用30min，加入终浓度为1g/L的SDS灭活绿豆核酸酶，PCR产物回收试剂盒回收线性化的酶切片段，以回收片段为模板，用美国Promega公司体外转录试剂盒(Promega RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-SP6)体外转录RNA,电转染BHK21细胞，37℃、5%的CO2培养5d，至出现明显细胞病变，用冻融法收集培养液上清，命名为rJEV。取第一代（P1）病毒上清于BHK21细胞做病毒滴度测定。并用上清接种BHK21细胞，收获上清的方法进行病毒传代。

[0121] 结果显示：转染BHK21细胞5天，可见细胞出现病变。病毒滴度约为6.0lgPFU/ml,在原代地鼠肾细胞上传代rJEV恢复病毒滴度可达7.5lgPFU/ml，与疫苗株相似。

[0122] 五、重组病毒rJEV的鉴定

[0123] （1）RT-PCR鉴定

[0124] 取第三代（P3）病毒上清，用罗氏公司高纯度病毒RNA抽提试剂盒(HighPure Viral RNA Kit)抽提rJEV病毒RNA,用引物

[0125] RR5(5'-GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3')

[0126] 和RR 13(5'-AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTA CA-3′)逆转录病毒cDNA，以此为模板，分别用引物F1和R3、F4和R5、F6和R7、F8和R9、F10和R10、F11和R11配对进行PCR扩增，所得PCR片段纯化后送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测定。

[0127] 结果表明：PCR片段大小与理论相吻合（大小分别为2.6kb，2.1kb，1.8kb，1.7kb，1.0kb，1.8kb），见图6，测序结果表明C蛋白基因第378位碱基含有人为引入的沉默突变（A→C），其余各处未发现碱基突变。

[0128] （2）免疫荧光鉴定恢复病毒

[0129] 接种3×104个LLC-MK2细胞到96孔板中，次日，待细胞长成单层，按103PFU/孔接种P3病毒到孔中，于37℃、5%的CO2培养2天，吸去培养液，PBS洗涤1次细胞，加入甲醇室温固定20min，弃去甲醇，PBS洗涤3次，加入0.2%Tritonx-100室温透膜10min，PBS洗涤1次，加入抗JEV E蛋白单克隆抗体（1:10，美国Abcam公司），37℃孵育1h，PBS洗涤3次，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗（1:100，美国Santa Crus公司），37℃孵育1h，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察并拍照，见图7。

[0130] （3）rJEV在BHK21细胞上蚀斑形成

[0131] 在六孔板中培养BHK21细胞，待细胞融合度达80%-90%左右，接种P3重组病毒和疫苗株，37℃吸附1h，覆盖物用终浓度为10g/L的低熔点琼脂糖，于37℃、5%CO2培养5d后用10g/L的结晶紫染色检测病毒滴度、蚀斑形态和大小。

[0132] 结果表明：rJEV和JEV疫苗株SA14-14-2在BHK21细胞上可以形成大小形态相似的蚀斑，见图8。

[0133] （4）rJEV神经毒力的检测

[0134] 分别用恢复病毒接种4周龄BALB/c小鼠，0.03ml（含病毒3.5lgPFU）/只，和3-5天BALB/c乳鼠，0.02ml（含病毒3.3lgPFU）/只，各10只，饲养14天，观察病毒神经毒力。

[0135] 实验结果见表2

[0136] 表2恢复病毒神经毒力检测

[0137]

[0138] 实验结果表明，本发明成功构建了含有JEV全长cDNA的乙脑病毒感染性克隆：pJFC与BAC53-JFC，使用该感染性克隆可以获得恢复病毒，恢复病毒可以在BHK21细胞上生长，可以作为基因骨架。

[0139] 实施例2：乙脑/登革1型嵌合病毒的制备和鉴定

[0140] 一、乙脑/登革1型嵌合病毒的制备

[0141] 1、登革病毒1型抗原基因prM-E片段的合成

[0142] 取登革病毒1型ThD1000881株编码E蛋白的基因片段prME（如SEQID NO.4所示），将该片段中编码E蛋白羧基端蛋白的9个核苷酸用乙脑病毒SA14-14-2株的相应位点的核苷酸替换后，与乙脑病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因氨基端的204个核苷酸融合。

[0143] 然后将该片段插入到pcDNA3.1载体，获得登革病毒1型抗原基因prM-E的质粒克隆pcDNA3.1-D1PrME。

[0144] 2、乙脑/登革1型5’半分子的构建

[0145] 将上述含有登革病毒1型抗原基因prM-E的pcDNA3.1-D1prM-E质粒以BglII单酶切，去除pcDNA3.1-D1prM-E质粒两个BglII酶切位点之间的部分（BglII 13-BglII900）,采用QIAGEN公司的Qiaquick Gel extraction kit回收6.7kb片段，再用美国NEB公司的T4DNA ligase使该片段自连和转化TOP10感受态细胞，挑选克隆用QIAGEN公司的Qiaprep spin miniprep kit进行质粒小量提取连接并进行酶切验证，所得到的质粒命名为pcDNA3.1-D 1prM-E(MOD)。

[0146] 用限制内切酶NotI和KasI分别双酶切pJEV-5’质粒和pcDNA3.1-D1prM-E(MOD)质粒，胶回收pJEV-5’质粒酶切后的728bp的片段，将其和NotI和KasI双酶切后的pcDNA3.1-D1prM-E(MOD)质粒连接，命名为pJD1-2650。

[0147] 然后再用BglII单酶切pJEV-5’质粒和pJD1-2650质粒，其中回收BglII单酶切pJFC质粒的1241bp的短片段，将其插入到经BglII单酶切的pJD1-2650质粒中，酶切验证1241片段正向插入的质粒，从而获得乙脑/登革1型嵌合的5’半分子克隆，命名为pJD1-5’（图9和10）。

[0148] 3、乙脑/登革1型全长克隆的构建

[0149] 用限制性内切酶NotI和BspEI双酶切上述pJD1-5’，回收3.7kb片段，用BspEI和XhoI双酶切含有乙脑全长cDNA的质粒克隆pJFC，回收7.5kb片段，用T4DNA ligase对两个片段进行体外连接，胶回收连接产物(11.2kb)。

[0150] 用NotI和XhoI双酶切回收的连接产物并再次回收，同时用NotI和XhoI双酶切BAC53质粒，回收6.4kb片段，用T4DNA ligase连接两个片段，转化TOP10感受态细胞，小量提取质粒进行酶切鉴定和测序，获得含有乙脑/登革1型嵌合全长克隆的质粒，命名为pJD1FC。

[0151] 酶切结果如图11、12和13所示，根据测序图谱，可读出pJD1FC序列如SEQIDNO.8所示。

[0152] 4、乙脑/登革1型嵌合病毒体外转录物RNA的制备

[0153] 将pJD1FC质粒用XhoI限制性内切酶线性化，用Invitrogen的PureLinkPCR purification kit纯化线性化产物，然后采用Promega公司的Ribomax largescale RNA production system-SP6进行体外转录。40μl反应体系包括：5×transcript buffer8μl、rATP（100mM）2μl、rCTP（100mM）2μl、rUTP（100mM）2μl、rGTP（100mM）0.7μl、m7G cap analog（40mM）3μl、enzyme mix 4μl、线性化产物18.3μl。反应体系于37℃孵育4h后，加入2μl RNase-free DNase于37℃消化模板30min，然后用QIAGEN公司的Rnease Mini kit纯化RNA产物，于-70℃保存备用（图14）。

[0154] 5、乙脑/登革1型嵌合病毒的拯救

[0155] 用胰酶分散BHK21细胞，800rpm离心5min，用预冷PBS洗涤细胞2次，用160μl PBS重悬细胞，加入5-10μg上述RNA（对照细胞加入相同体积的PBS），混匀，以电压140V、脉冲时间25ms、脉冲1次，用Bio-Rad的Genepulser Xcell进行电转。然后将细胞置于冰上6min，再转入MEM生长液中，37℃培养。次日将培养液更换为MEM维持液，继续培养4～6天，实验组BHK21细胞出现明显CPE，对照细胞无病变（图15）。将病变细胞及上清液反复冻融3次，4000rpm离心10min，收获上清液，分装后于-70℃保存，获得的第一代嵌合病毒命名为JD1（P1）。

[0156] 6、乙脑/登革1型嵌合病毒的传代培养

[0157] 取上述嵌合病毒JD10.5ml接种原代地鼠肾细胞（PHK细胞），于37℃吸附1h后，加入MEM培养基，培养至细胞出现CPE。吸取上清液，4000rpm离心10min，收获的上清液为第二代嵌合病毒JD1（P2），分装后于-70℃保存。按照相同方法将JD1在PHK细胞上传至第10代，其间对嵌合病毒进行各项鉴定（图16）。

[0158] 二、乙脑/登革1型嵌合病毒的鉴别

[0159] 1、乙脑/登革1型嵌合病毒的RT-PCR鉴定

[0160] 用Roche的High pure viral RNA kit提取第二代嵌合病毒JD1（P2）RNA，并用Invitrogen的Super III Reverse Transcriptase将嵌合病毒RNA逆转录为cDNA。以该cDNA为模板，用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA polymerase进行PCR扩增。引物序列如下：第一对：上游引物5'-ACCAACATTGGACATTGAACTCT-3'，下游引物5'-GGTCCGGACCAGTCTAGTGACAGATCTGACTC-3'，产物长度1570bp；第二对：上游引物5'-GTGAGGACACAATGACTTAC-3'，下游引物5'-GGTCCGGACCAGTCTAGTGACAGATCTGACTC-3'，产物长度2048bp；第三对：上游引 物 5'-TTGGCGCGCCATTTAGGTGACACTATAGAGAAGTTTATCTGTGTGAACTTCTT-3'，下 游 引 物
5'-GTTGGCTGTTATCACTCTCC-3'，产物长度2067bp。扩增产物均符合预期（图17）。

[0161] 2、乙脑/登革1型嵌合病毒的蚀斑检测

[0162] 将BHK21细胞接种至六孔板，进行蚀斑检测。以MEM培养液作为稀释液，分别对各代次嵌合病毒进行10倍稀释。分别加入各稀释度的病毒液400μl，于37℃吸附60min。在每孔中加入1%低熔点琼脂糖2ml，待凝固后于37℃培养。5天后每孔加入4%多聚甲醛2ml固定60min，用结晶紫染液染色，观察蚀斑形态并根据蚀斑数量计算病毒滴度（图18）。

[0163] 3、乙脑/登革1型嵌合病毒的Western blot鉴定

[0164] 第三代嵌合病毒JD1（P3）80μl中加入20μl 5×protein loading buffer，混匀后沸水煮10min，10000rpm离心1min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1h，然后用登革病毒1型E蛋白多克隆抗体于4℃孵育过夜。PBS洗膜，然后用AP标记的羊抗兔IgG室温孵育1.5h。PBS洗膜后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（上海碧云天）显色。结果显示嵌合病毒在55kD处可观察到清晰条带，与登革病毒E蛋白大小一致，结果符合预期（图19）。

[0165] 4、乙脑/登革1型嵌合病毒的生长特性分析

[0166] 用MEM维持液将JD1（P2）病毒液稀释，以MOI为0.1、0.01、0.001感染，PHK细胞，于37℃吸附120min。加入MEM维持液20ml，于37℃培养。每隔12小时抽取0.5ml上清液，-70℃备用，以0.5ml MEM维持液补足体积，样品采集至接种后96小时。蚀斑法测定不同MOI的各时间点样品的病毒滴度，绘制JD1病毒在PHK细胞中的生长曲线（图20）。

[0167] 结果显示0.001-0.01MOI为病毒的最佳感染剂量之间，可收获最高病毒滴度的病毒液。

[0168] 5、乙脑/登革1型嵌合病毒的免疫原性实验

[0169] （1）免疫原制备

[0170] PHK细胞培养的第三代乙脑/登革1型嵌合病毒用作免疫原。用MEM培养液（Gibco）将病毒量调整至5logPFU/ml备用。

[0171] （2）实验动物及分组

[0172] 60只雌性4周龄BALB/c小鼠由成都生物制品研究所有限责任公司提供。将小鼠随机分为2组，每组30只：（1）JD1嵌合病毒免疫组；（2）阴性对照组（MEM基础培养基）。

[0173] （3）免疫方案

[0174] 取上述病毒液和MEN培养液，充分混匀后，分别通过腹腔免疫小鼠，500μl/只。初次免疫后2周以相同途径和剂量加强接种一次。初次免疫3周后开始采血，此后每2周
1次至第13周结束，每次5只，共计6次。分离血清，用PBS稀释10倍后56℃灭活30分钟，-20℃保存备用。

[0175] （4）免疫血清中和抗体效价的检查

[0176] 将上述血清样品（1:10）用血清稀释液（PBS）按照1:2进行倍比稀释至1:640，分别取每稀释度样品200ul与同体积含有50-100个登革病毒1型混合，37℃中和1小时，加入到长满BHK21细胞的六孔板上，37℃培养5天后，以结晶紫染色。以未加抗血清的MEM培养基做阴性对照。以减少50%病毒蚀斑数的最高稀释度的血清浓度作为中和抗体效价。

[0177] 结果表明，乙脑/登革1型嵌合病毒免疫小鼠后，能产生特异的抗同型登革病毒的中和抗体，抗体效价可达1:34.82（见图21）。

[0178] 实验结果说明，本发明成功地构建得到了乙脑/登革1型嵌合病毒，该嵌合病毒可以大量复制，能在BHK21细胞上生长，产生的中和抗体效价高，可制备成为登革疫苗。

[0179] 实施例3乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA质粒的构建、病毒恢复及重要生物学特性鉴定

[0180] 一、乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA质粒的构建

[0181] 1、DEN2prM/E蛋白编码基因的合成

[0182] 取DEN2PUO-218株编码E蛋白的基因片段prM-E（如SEQ ID NO.5所示），将该片段中编码E蛋白羧基端蛋白的9个核苷酸用乙脑病毒SA14-14-2株的相应位点的核苷酸替换后，与乙脑病毒SA14-14-2NS1蛋白基因5′端的204个核苷酸融合，插入到载体pMD18-T中，用于嵌合全长克隆的构建。

[0183] 2、乙脑/登革2型嵌合片段5′半分子质粒pJE/DEN2-5′的构建

[0184] 将合成的基因片段prM/E（包含编码JEV NS1氨基端的204个核苷酸）用限制内切酶KasI和BglII酶切，回收2.1kb的DNA片段，同时用相同的两个限制内切酶切割5′半分子克隆pJEV5′，并回收大片段（4.0kb），将两个片段连接并转化感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆并进行酶切和测序鉴定，并命名为pJD2-5′。

[0185] 3、乙脑/登革2型全长cDNA质粒的构建及鉴定

[0186] 将构建的乙脑/登革2型5′半分子质粒pJE/DEN2-5′和乙脑3′半分子质粒pJEV3′同时用限制内切酶BspEI和XhoI酶切，分别回收大小为6.1kb和7.5kb的DNA片段，连接并转化感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆进行质粒提取、酶切验证和全长测序鉴定，命名为pJD2FC。

[0187] 酶切结果如图22所示，根据测序图谱，可读出pJD2FC的序列如SEQ IDNO.9所示。

[0188] 4、病毒RNA的体外转录、转染及嵌合病毒的获得及传代

[0189] 于37℃用Xhol消化pJD2FC 3h后，加入绿豆核酸酶于30℃作用30min，加入终浓度为1g/L的SDS灭活绿豆核酸酶，PCR产物回收试剂盒回收线性化的酶切片段，以回收片段为模板，用体外转录试剂盒体外转录RNA,并用RNA回收试剂盒回收RNA,电转染BHK21细胞（电转染条件为140伏电压）后，转移至T-25培养瓶中，于37℃、5%的CO2培养5d，用反复冻融的方法收集培养液上清，命名为JD2。用蚀斑检测法检测上清中的病毒，并用0.5ml上清接种PHK细胞进行病毒传代。

[0190] 结果显示：转染BHK21细胞5天，未见细胞出现病变。但上清中可检测到病毒，病毒滴度约为3log10PFU/ml。用上清接种PHK细胞，在30h左右可以使PHK细胞出现细胞病变效应（图23）。

[0191] 二、乙脑/登革2型嵌合病毒的鉴定

[0192] 1、乙脑/登革2型嵌合病毒的RT-PCR鉴定

[0193] 取p3代病毒上清，用高纯度病毒RNA抽提试剂盒抽提嵌合病毒RNA,用引物RR5(5'-GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3 ′ ) 和 RR13(5'-AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3′)逆转录病毒cDNA，以此为模板，分别用引物F1和R3、F4和R5、F6和R7、F8和R9、F10和R10、F11和R11配对进行PCR扩增，所得PCR片段纯化后送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测定。

[0194] 结果表明：PCR片段大小与理论相吻合（分别为2.6kb，2.1kb，1.8kb，1.7kb，1.0kb，1.8kb）（见图24），测序结果表明C蛋白基因第378位碱基具有人为引入的沉默突变（A→C），其余各处未发现碱基突变。

[0195] 2、免疫荧光鉴定嵌合病毒JD2

[0196] 接种3×104个vero细胞到96孔板中，次日，待细胞长成单层，按103PFU/孔接种p3代病毒到孔中，于37℃、5%的CO2培养2天，吸去培养液，PBS洗涤1次细胞，加入甲醇室温固定20min，弃去甲醇，PBS洗涤3次，加入0.2%Tritonx-100室温透膜10min，PBS洗涤1次，加入抗JEV E蛋白单克隆抗体（Abcam公司产品，1:10稀释），37℃孵育1h，PBS洗涤3次，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司产品，1:100稀释），37℃孵育1h，PBS洗涤3次，倒置荧光显微镜（Olympus公司产品）观察并拍照，结果见图25。

[0197] 3、JD2在BHK21细胞上蚀斑形成及在PHK细胞生长情况

[0198] 消化BHK21细胞，待细胞融合度达80%-90%左右，接种p3代重组病毒和疫苗株，37℃吸附1h，覆盖物用终浓度为10g/L的低熔点琼脂糖，于37℃、5%CO2培养5d后用10g/L的结晶紫染色检测病毒滴度、蚀斑形态和大小（见图26）。用不同m.o.i.接种PHK细胞，每隔12小时收集病毒上清，检测病毒滴度，绘制生长曲线（图27）。

[0199] 结果表明:DEN2能在BHK21细胞上形成较小的蚀斑，而rJEV和JEVSA14-14-2形成大小相似的蚀斑，而JD2形成的蚀斑与rJEV相似。

[0200] 在PHK细胞的生长曲线表明：接种较低的m.o.i.更利于收集到更高滴度的病毒液，而较高的m.o.i.接种PHK,病毒的高峰出现在大约24h,并且病毒滴度也较低,下降也较快。

[0201] 4、JD2的免疫原性的检测

[0202] 用0.5ml病毒液（含有4.4log10PFU）腹腔接种4周龄昆明小鼠30只,两周后用同样地计量加强免疫一次（同时用MEM做对照），从第4周开始，每隔2周处死5只小鼠，收集血清，用蚀斑减少中和实验（plaque reductionneutralization test,PRNT)检测抗DEN2中和抗体滴度。首先对倍稀释抗血清（从1:10开始），接着每管加入100PFU病毒于37℃中和1h，接种病毒与抗血清混合液到单层BHK21细胞吸附1h，弃去上清，加入含有10g/L低熔点琼脂糖和2%新生牛血清的维持液于37℃、5%的CO2培养5d，蚀斑染色，计数各孔的蚀斑数，计算中和滴度，取50%中和能力的最高稀释倍数作为抗血清的中和效价，其中和抗体效价可达1:92（见图28）。

[0203] 5、JD2免疫对小鼠免疫保护作用研究

[0204] 用0.5ml p3病毒液（含有4.4log10PFU）腹腔免疫4周龄昆明小鼠，分别于免疫第2周和第4周用DEN2（NGC）脑内适应株用脑腔注射的方攻击,同时用MEM做对照，攻击后观察14天，统计小鼠的死亡率（结果见表4）。

[0205] 表4JD2免疫效果

[0206]

[0207] 结果表明JD2嵌合病毒免疫后，小鼠发病率远远小于对照组的发病率。

[0208] 实验结果说明，本发明成功构建得到了乙脑/登革2型嵌合病毒，其可以在PHK细胞中大量复制，能产生登革病毒的中和抗体，产生登革病毒的中和抗体的滴度高达1:92，主动免疫保护作用强，可制备成为登革疫苗。

[0209] 实施例4乙脑/登革3型嵌合病毒的制备和鉴定

[0210] 一、乙脑/登革3型嵌合病毒的制备

[0211] 1、登革病毒3型抗原基因prM-E片段的合成

[0212] 取登革病毒3型PaH881-88株编码E蛋白的基因片段prM-E（如SEQ IDNO.6所示），将该片段中编码E蛋白羧基端蛋白的9个核苷酸用乙脑病毒SA14-14-2株的相应位点的核苷酸替换后，与乙脑病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因氨基端的204个核苷酸融合，将该片段插入到pMD18-T载体，获得登革病毒3型抗原基因prM-E的质粒克隆pMD-D3prM-E。

[0213] 2、乙脑/登革3型5’半分子的构建

[0214] 将pMD-D3prM-E经NEB公司Kas Ⅰ和BglⅡ双酶切后，采用Qiagen的Qiaquick Gel extraction kit回收小片段（2.1kb），同时对乙脑5’半分子克隆pJEV-5’用限制性内切酶KasI和BglII进行双酶切，并回收大片段（4.0kb），将两个片段用NEB的T4DNA ligase连接和转化TOP10感受态细胞，挑选克隆用Qiagen的Qiaprep spin miniprep kit进行质粒小量提取，并对质粒进行酶切验证和测序，命名为pJD3-5’，测序后发现在E基因1440-1448处缺失了8个碱基(图29)。以pJD3-5’质粒为模板采用融合PCR方法对缺失的8个碱基进行修复，用Invitrogen的PureLink PCR purification kit纯化PCR产物（约3.5kb）（图30），用NEB Asc Ⅰ和BspE Ⅰ双酶切后回收片段，与pJEV-3’质粒经BspE Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收的小片段（约2.1kb），用NEB的T4DNA ligase连接，用Qiagen的Qiaquick Gel extraction kit回收大片段（5.7kb），再将此回收片段与经NEB Asc Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的BAC53载体回收片段（约6.4kb）连接，转化DH10B感受态细胞，挑选克隆用Qiagen的Qiaprep spin miniprep kit进行质粒小量提取，并对质粒进行酶切验证和测序，获得乙脑/登革3型5’半分子克隆，命名为BAC53JD3-5’（图31）。

[0215] 3、pJEV-3’half（Sal Ⅰ）半分子的构建

[0216] 采用PCR方法从乙脑疫苗株（SA14-14-2）中扩增Xba Ⅰ到3’末端序列（片段F11），在3’末端引入Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。将PCR产物用NEB Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后回收片段，与用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pMDJEV-3’half后回收的载体片段部分，用NEB的T4DNA ligase连接后，转化TOP10感受态细胞，挑选克隆用Qiagen的Qiaprep spin miniprep kit进行质粒小量提取，并对质粒进行酶切验证和测序，获得乙脑/登革3型5’半分子克隆，命名为pJEV-3’half（Sal Ⅰ）（图32、33）。

[0217] 4、乙脑/登革3型嵌合全长克隆的构建

[0218] 将上述构建的乙脑/登革3型5’半分子克隆BAC53JD3-5’和JEV3’半分子pJEV-3’（Sal Ⅰ）用限制内切酶BamH Ⅰ和SalI进行双酶切，分别回收大片段（分别约为12kb和5.4kb），进行连接和转化DH10B感受态细胞，挑选克隆进行质粒小量提取、酶切验证和全长测序，获得乙脑/登革3型全长cDNA克隆，命名为pJD3FC。

[0219] pJD3FC酶切结果如图34和图35所示，与预期完全一致；根据测序图谱，可读出pJD3FC的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0220] 5、乙脑/登革3型嵌合病毒体外转录物RNA的制备

[0221] 将BAC53JD3FC用限制性内切酶Sal I线性化，用Invitrogen的PureLinkPCR purification kit纯化线性化产物，然后采用Promega的Ribomax large scaleRNA production system-SP6进行体外转录。40μl反应体系包括：5×transcriptbuffer8μl、rATP（100mM）2μl、rCTP（100mM）2μl、rUTP（100mM）2μl、rGTP（100mM）0.7μl、m7G cap analog（40mM）3μl、enzyme mix 4μl、线性化产物18.3μl。反应体系于37℃孵育4h后，加入2μl RNase-free DNase于37℃消化模板30min，然后用Qiagen的Rnease Mini kit纯化RNA产物，于-70℃保存备用（图36）。

[0222] 6、乙脑/登革3型嵌合病毒的拯救

[0223] 将贴壁生长的BHK21细胞用胰酶消化，用含10%小牛血清的MEM培养基（Gibco）吹打细胞，800rpm离心5min，用无菌预冷PBS洗涤细胞2次，用160μl PBS重悬细胞，加入5-10μg上述纯化的体外转录产物RNA（对照细胞加入相同体积的PBS），混匀后按照电压
140V、脉冲时间25ms、脉冲1次的实验参数用Biorad的Gene pulser Xcell进行电转。然后将细胞置于冰上6min，再转入含10%小牛血清的MEM培养基中37℃培养。次日将培养基更换为含2%小牛血清的MEM培养基，继续培养至第5～7天至出现细胞病变。将转染细胞及上清液反复冻融3次，4000rpm离心10min，收获上清液，分装后于-70℃保存，获得的第一次嵌合病毒命名为JD3（P1）。

[0224] 7、乙脑/登革3型嵌合病毒的传代培养

[0225] 取上述获得的第一代嵌合病毒JD30.5ml接种贴壁生长的原代地鼠肾细胞（PHK细胞），于37℃吸附1h后，加入含2%小牛血清的MEM培养基，继续培养至细胞出现CPE。吸取上清液，4000rpm离心10min，收获的上清液为第二代嵌合病毒JD3（P2），分装后于-70℃保存。按照相同方法将JD3在PHK细胞上传至第15代，其间对嵌合病毒进行各项鉴定（图37）。

[0226] 二、乙脑/登革3型嵌合病毒的鉴定

[0227] 1、乙脑/登革3型嵌合病毒的RT-PCR鉴定和测序

[0228] 用Roche公司的High pure viral RNA kit提取第三代嵌合病毒JD3（P3）RNA，并用Invitrogen的Super III Reverse Transcriptase将嵌合病毒RNA逆转录为cDNA。以该cDNA为模板，用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNApolymerase进行PCR扩增。所用引物为登革病毒4种血清型的prM/E检测引物，引物序列如下D1：上游引物5'-ACCAACATTGGACATTGAACTCT-3′，下游引物5'-AGGTGGTTCTGCCTCAATGT-3′，产 物 长 度 1026bp；D2： 上 游 引 物 5'-TCGCTCCTTCAATGACAAT-3'， 下 游引 物 5'-CCTGTGAGTGCTGTGTGC-3'， 产 物 长 度 814bp；D3：上 游 引 物
5'-CCACGGACAGGTTTGGATT-3′，下游引物5'-GAACATCTTCCCAATCGAGCT-3'，产物长度615bp；
D4：上游引物5'-CACAGCATGGGACAACAGTG-3'，下游引物5'-CGTGCCAATCCACAACACT-3'，产物长度461bp。

[0229] 结果显示只有D3引物能扩增出目的条带（图38）。对PCR产物进行测序，与嵌合病毒预期序列一致。

[0230] 2、乙脑/登革3型嵌合病毒的蚀斑检测

[0231] 将BHK21细胞接种至六孔板，待细胞融合度达70-80%时进行蚀斑检测。以无血清MEM培养基作为稀释液，分别对各代次嵌合病毒进行10倍梯度稀释。吸去BHK21细胞的培养基，分别在各孔中加入400μl稀释后的病毒液，于37℃吸附60min，每20min轻柔振摇一次。吸附完成后吸去病毒液，在每孔中加入2ml 1%低熔点琼脂糖（含2%小牛血清），待凝固后于37℃培养。5天后每孔加入2ml 4%多聚甲醛固定60min，然后用结晶紫染液染色，观察蚀斑形态并根据蚀斑数量计算病毒滴度（图39）。

[0232] 3、乙脑/登革3型嵌合病毒生长曲线的绘制

[0233] 用含2%小牛血清的MEM维持液（Gibco）将JD3（P3）病毒液分别稀释至感染复数（MOI）为0.1、0.01、0.001，接种T75瓶中贴壁生长的PHK细胞，于37℃吸附120min，每20min轻柔振摇一次。吸附完成后吸去病毒液，加入20ml含2%小牛血清的MEM维持液（Gibco），于37℃培养。每隔12小时抽取0.5ml上清液，-70℃保存待测，以0.5ml MEM维持液补足体积，样品采集至接种后96小时。按照蚀斑法对不同MOI的各时间点样品进行滴度测定，绘制JD3病毒在PHK细胞中的生长曲线（图40）。结果显示不同MOI接种量的病毒滴度在接种后迅速上升，在接种后48-60h达到最高，此后迅速下降。高MOI接种量的病毒滴度出现峰值较早，MOI为0.001接种量的病毒滴度出现峰值较晚，滴度最高。

[0234] 4、乙脑/登革3型嵌合病毒的Western blot鉴定

[0235] 在80μl第三代嵌合病毒JD3（P3）中加入20μl 5×protein loading buffer，混匀后沸水煮10min，10000rpm离心1min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1h，然后用登革病毒3型E蛋白多克隆抗体（稀释度1:40，自行制备）于4℃孵育过夜。PBS洗膜，然后用AP标记的羊抗兔IgG（稀释度1:5000，上海碧云天）室温孵育1.5h。PBS洗膜后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（上海碧云天）显色。按照相同条件对乙脑病毒JEV(P3)进行检测，作为对照。

[0236] 结果显示乙脑病毒未见条带，嵌合病毒在55kD处可观察到清晰条带，与登革病毒E蛋白位置相对应，结果符合预期（图41）。

[0237] 5、乙脑/登革3型嵌合病毒的免疫原性实验

[0238] （1）免疫原制备

[0239] 收获自PHK细胞中培养的第三代乙脑/登革3型嵌合病毒JD3上清，经蚀斑法测定病毒滴度后，用MEM基础培养基（Gibco）将病毒滴度调整至105/ml备用。

[0240] （2）实验动物及分组

[0241] 60只健康雌性4周龄BALB/c小鼠由成都生物制品研究所有限责任公司提供。将实验动物随机分为2组，每组30只：（1）JD3嵌合病毒免疫组；（2）阴性对照组（MEM基础培养基）。

[0242] （3）免疫方案

[0243] 取上述病毒液和阴性对照液，充分混匀后通过腹腔注射途径接种小鼠，500ul/只。初次免疫后2周以相同途径和剂量加强接种一次。初次免疫3周后开始采血，此后每2周
1次至第13周结束，每次5只，共计6次。分离血清，用PBS稀释10倍后56℃灭活30分钟，-20℃保存备用。

[0244] （4）免疫血清中和抗体效价的检查

[0245] 将上述血清样品（1:10）用血清稀释液（PBS）按照1:2进行倍比稀释至1:640，每浓度样品分别取200ul与同体积含有50-100PFU登革病毒4型混合，混匀后于37℃孵育1小时后，加入到长满BHK21细胞的六孔板上，测定中和抗体效价。以未加抗血清的MEM培养基做阴性对照。以可中和1/2病毒的最高稀释度的血清浓度作为中和抗体效价。

[0246] 结果表明，乙脑/登革3型嵌合病毒免疫小鼠后，能产生特异的抗同型登革病毒的中和抗体，中和抗体效价最高为1:56.56(见图42。

[0247] 实验说明，本发明成功构建得到了乙脑/登革3型嵌合病毒，其可以在PHK细胞中大量复制，能产生登革病毒的中和抗体，免疫原性强，可制备成为登革疫苗。

[0248] 实施例5乙脑/登革4型嵌合病毒的制备和鉴定

[0249] 一、乙脑/登革4型嵌合病毒的制备

[0250] 1、登革病毒4型抗原基因prM-E片段的合成

[0251] 取登革病毒4型814669株编码E蛋白的基因片段prM-E（SEQ ID NO.7所示）将该片段中编码E蛋白羧基端蛋白的9个核苷酸用乙脑病毒SA14-14-2株的相应位点的核苷酸替换后，与乙脑病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因氨基端的204个核苷酸融合，然后将该片段插入到TOPO载体，获得登革病毒4型抗原基因prM-E的质粒克隆TOPO-D4prM-E。

[0252] 2、乙脑/登革4型5’半分子的构建

[0253] 将上述含有登革病毒4型prM-E序列的TOPO-D4prM-E质粒用限制内切酶KasI和BglII双酶切，采用QIAGEN公司的Qiaquick Gel extraction kit回收小片段（2.1kb），同时对乙脑5’半分子克隆pJEV-5’用限制性内切酶KasI和BglII进行双酶切，并回收大片段（4.0kb），将两个片段用NEB的T4DNA ligase连接和转化TOP10感受态细胞，挑选克隆用QIAGEN公司的Qiaprep spinminiprep kit进行质粒小量提取，并对质粒进行酶切验证和测序，获得乙脑/登革4型5’半分子克隆，命名为pJD4-5’（图43和44）。

[0254] 3、乙脑/登革4型全长克隆的构建

[0255] 将上述构建的乙脑/登革4型5’半分子克隆pJD4-5’和乙脑3’半分子克隆pJEV-3’half用限制内切酶BspEI和XhoI进行双酶切，分别回收大片段（分别为6.1kb和7.5kb），进行连接和转化TOP10感受态细胞，挑选克隆进行质粒小量提取、酶切验证和全长测序，获得乙脑/登革4型全长cDNA克隆，命名为pJD4FC。

[0256] 酶切结果如图45和46，根据测序图谱，可读出pJD4FC的序列如SEQ IDNO.11所示。

[0257] 4、乙脑/登革4型嵌合病毒体外转录物RNA的制备

[0258] 将pJD4FC 用 限 制 性 内 切 酶XhoI 线 性 化，用 Invitrogen的 PureLink PCRpurification kit纯化线性化产物，然后采用Promega公司的Ribomax large scaleRNA production system-SP6进行体外转录。40μl反应体系包括：5×transcriptbuffer8μl、rATP（100mM）2μl、rCTP（100mM）2μl、rUTP（100mM）2μl、rGTP（100mM）0.7μl、
7
mG cap analog（40mM）3μl、enzyme mix 4μl、线性化产物18.3μl。反应体系于37℃孵育4h后，加入2μl RNase-free DNase于37℃消化模板30min，然后用QIAGEN公司的Rnease Mini kit纯化RNA产物，于-70℃保存备用（图47）。

[0259] 5、乙脑/登革4型嵌合病毒的拯救

[0260] 将贴壁生长的BHK21细胞用胰酶消化，用含10%小牛血清的MEM培养基（Gibco）吹打细胞，800rpm离心5min，用无菌预冷PBS洗涤细胞2次，用160μl PBS重悬细胞，加入5-10μg上述纯化的体外转录产物RNA（对照细胞加入相同体积的PBS），混匀后按照电压140V、脉冲时间25ms、脉冲1次的实验参数用Biorad的Gene pulser Xcell进行电转。然后将细胞置于冰上6min，再转入含10%小牛血清的MEM培养基中37℃培养。次日将培养基更换为含2%小牛血清的MEM培养基，继续培养至第5～7天，以pJD4FC体外转录物电转的BHK21细胞出现明显CPE，对照细胞无病变（图48）。将病变细胞及上清液反复冻融3次，
4000rpm离心10min，收获上清液，分装后于-70℃保存，获得的第一次嵌合病毒命名为JD4（P1）。

[0261] 6、乙脑/登革4型嵌合病毒的传代培养

[0262] 取上述获得的第一代嵌合病毒JD40.5ml接种贴壁生长的原代地鼠肾细胞（PHK细胞），于37℃吸附1h后，加入含2%小牛血清的MEM培养基，继续培养至细胞出现CPE。吸取上清液，4000rpm离心10min，收获的上清液为第二代嵌合病毒JD4（P2），分装后于-70℃保存。按照相同方法将JD4在PHK细胞上传至第10代，其间对嵌合病毒进行各项鉴定（图49）。

[0263] 二、乙脑/登革4型嵌合病毒的RT-PCR鉴定

[0264] 1、乙脑/登革4型嵌合病毒的RT-PCR鉴定和测序

[0265] 用Roche公司的High pure viral RNA kit提取第二代嵌合病毒JD4（P2）的RNA，并用Invitrogen的Super III Reverse Transcriptase将嵌合病毒RNA逆转录为cDNA。以该cDNA为模板，用Takara的PrimeSTAR HS DNApolymerase进行PCR扩增。引物序列如下：第一对JD4PF1:5'-CACCTGATCACGTCGGAATA-3'，JD4PR1:5'-CCGCTCGAGCCCAAAGCTTCAAACTCTAGAT-3'，产物长度2078bp；第二对：JD4PF2:5'-CGCCCCTACGATTCCGGACAGA-3'，JD4PR2:5'-GGAAAAGGATCCGTGGTTCCAGG-3'，产物长度2155bp；第三对：JD4PF3:5'-TGCGGAGTCAGATCTGTCACT-3'，JD4PR3:5'-CATTTTCTGTCCGGAATCGTAG-3'，产物长度820bp；第四对：JD4PF4:5'-GAACATGGAGGATGCGTCAC-3'，JD4PR4:5'-GGTCCGGACCAGTCTAGTGACAGATCTGACTC-3'，产物长度1608bp。结果显示4条产物均扩增成功（图50）。对PCR产物进行测序，均与嵌合病毒预期序列一致。

[0266] 2、乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的蚀斑检测

[0267] 将BHK21细胞接种至六孔板，待细胞融合度达70-80%时进行蚀斑检测。以无血清MEM培养基作为稀释液，分别对各代次嵌合病毒进行10倍梯度稀释。吸去BHK21细胞的培养基，分别在各孔中加入400μl稀释后的病毒液，于37℃吸附60min，每20min轻柔振摇一次。吸附完成后吸去病毒液，在每孔中加入2ml 1%低熔点琼脂糖（含2%小牛血清），待凝固后于37℃培养。5天后每孔加入2ml 4%多聚甲醛固定60min，然后用结晶紫染液染色，观察蚀斑形态并根据蚀斑数量计算病毒滴度（图51）。

[0268] 3、乙脑/登革4型嵌合病毒JD4生长曲线的绘制

[0269] 用含2%小牛血清的MEM维持液（Gibco）将JEV/D4（P3）病毒液分别稀释至感染复数（MOI）为0.1、0.01、0.001，接种T75瓶中贴壁生长的PHK细胞，于37℃吸附60min，每20min轻柔振摇一次。吸附完成后吸去病毒液，加入20ml含2%小牛血清的MEM维持液（Gibco），于37℃培养。每隔12小时抽取0.5ml上清液，-70℃保存待测，以0.5ml MEM维持液补足体积，样品采集至接种后96小时。按照蚀斑法对不同MOI的各时间点样品进行滴度测定，绘制JD4病毒在PHK细胞中的生长曲线（图52）。结果显示病毒滴度在接种后迅速上升，在接种后36-48h达到最高，此后迅速下降。高MOI接种量的病毒滴度出现峰值较早，但不同MOI接种量所对应的峰值无显著差异。

[0270] 4、乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的Western blot鉴定

[0271] 在80μl第三代嵌合病毒JD4（P3）中加入20μl 5×protein loading buffer，混匀后沸水煮10min，10000rpm离心1min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1h，然后用登革病毒4型E蛋白多克隆抗体（稀释度1:40，自行制备）于4℃孵育过夜。PBS洗膜，然后用AP标记的羊抗兔IgG（稀释度1:5000，上海碧云天）室温孵育1.5h。PBS洗膜后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（上海碧云天）显色。按照相同条件对乙脑病毒JEV(P3)进行检测，作为对照。

[0272] 结果显示乙脑病毒未见条带，嵌合病毒在55kD处可观察到清晰条带，与登革病毒E蛋白位置相对应，结果与预期一致（图53）。

[0273] 5、乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的免疫原性实验

[0274] （1）免疫原制备

[0275] 收获自PHK细胞中培养的第三代乙脑/登革4型嵌合病毒上清，经蚀斑法测定病5
毒滴度后，用MEM基础培养基（Gibco）将病毒滴度调整至10/ml备用。

[0276] （2）实验动物及分组

[0277] 60只健康雌性4周龄BALB/c小鼠由成都生物制品研究所有限责任公司提供。将实验动物随机分为2组，每组30只：（1）JEV/D4嵌合病毒免疫组；（2）阴性对照组（MEM基础培养基）。

[0278] （3）免疫方案

[0279] 取上述病毒液和阴性对照液，充分混匀后通过腹腔注射途径接种小鼠，500ul/只。初次免疫后2周以相同途径和剂量加强接种一次。初次免疫3周后开始采血，此后每2周
1次至第13周结束，每次5只，共计6次。分离血清，用PBS稀释10倍后56℃灭活30分钟，-20℃保存备用。

[0280] （4）免疫血清中和抗体效价的检查

[0281] 将上述血清样品（1:10）用血清稀释液（PBS）按照1:2进行倍比稀释至1:640，每浓度样品分别取200ul与同体积含有50-100PFU登革病毒4型混合，混匀后于37℃孵育1小时后，加入到长满BHK21细胞的六孔板上，测定中和抗体效价。以未加抗血清的MEM培养基做阴性对照。以可中和1/2病毒的最高稀释度的血清浓度作为中和抗体效价。

[0282] 结果表明，乙脑/登革4型嵌合病毒免疫小鼠后，能产生特异的抗同型登革病毒的中和抗体，最高中和抗体效价为1:22.36（见图54）。

[0283] 实验说明，本发明成功构建得到了乙脑/登革4型嵌合病毒，其可以在PHK细胞中大量复制，能产生登革病毒的中和抗体，免疫原性强，可制备成为登革疫苗。

[0284] 综上，本发明成功地构建了乙脑病毒感染性克隆，并进一步构建了含有登革1型、登革2型、登革3型或者登革4型病毒抗原基因prM-E的乙脑/登革嵌合病毒，这些嵌合病毒能在多种人用疫苗生产用细胞上生长繁殖，生长特性类似，可以用于生产四个血清型的登革疫苗，并且，这四种嵌合病毒免疫原性强，产生的抗体的滴度高，具有良好的工业应用前景。