一种四君子滴丸制剂

摘要

本发明公开了一种四君子滴丸制剂。该四君子滴丸制剂由挥发油、四君子总多糖和基质组成；所述挥发油是将炒白术经二氧化碳超临界萃取得到；从下述质量份数的四种原料药中提取四君子总多糖：党参2份、炒白术残渣2份、茯苓2份、炙甘草1份，所述炒白术残渣为将炒白术经二氧化碳超临界萃取所述挥发油后剩余物质；所述基质为木糖醇和羟丙基甲基纤维素；所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比为1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03。本发明将木糖醇与羟丙基甲基纤维素配合使用，所制滴丸硬度好，既解决了滴丸易碎的问题，又不影响其能滴能冷凝的特性。实验证明，本发明的四君子滴丸对于益气健脾和促进肠胃运动方面有更强的作用。

权利要求

1.四君子滴丸制剂，由挥发油、四君子总多糖和基质组成；

所述挥发油是将炒白术经二氧化碳超临界萃取得到的；

所述四君子总多糖从下述质量份数的四种原料药中提取得到：党参2份、炒白术残渣2份、茯苓2份、炙甘草1份，所述炒白术残渣为将炒白术经所述二氧化碳超临界萃取所述挥发油后剩余的物质；

所述基质为木糖醇和羟丙基甲基纤维素；

所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比为

1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03。

2.根据权利要求1所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比为1:0.01:4:0.016。

3.根据权利要求1所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述二氧化碳超临界萃取的条件为压力40～45MPa，温度35～45℃，时间1.5～2h。

4.根据权利要求1所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述四君子总多糖的提取方法包括用蛋白酶对所述四种原料药的水提液进行酶解去除蛋白的步骤。

5.根据权利要求4所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

6.根据权利要求5所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：用所述木瓜蛋白酶酶解的温度为50-60℃，pH值为5-6，酶解时间为3 h。

7.根据权利要求6所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：用所述木瓜蛋白酶酶解的温度为50℃，pH值为6。

8.根据权利要求5所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述木瓜蛋白酶与所述四种原料药的配比为240-360U:100g。

9.根据权利要求8所述的四君子滴丸制剂，其特征在于：所述木瓜蛋白酶与所述四种原料药的配比为240U：100g。

10.四君子滴丸制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用二氧化碳超临界萃取炒白术中的挥发油，同时收集炒白术残渣；

(2)将下述重量份数的四种原料药混合后，提取四君子总多糖：党参2份、步骤(1)所述炒白术残渣2份、茯苓2份、炙甘草1份；

(3)将所述四君子总多糖、所述挥发油、木糖醇和羟丙基甲基纤维素按照质量配比为

1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03的比例制备得到四君子滴丸制剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述二氧化碳超临界萃取的条件为压力40～45MPa，温度35～45℃，时间1.5～2h；

步骤(3)中，所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比为1:0.01:4:0.016。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述四君子总多糖的提取方法包括用蛋白酶对权利要求10中的所述四种原料药的水提液进行酶解去除蛋白的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：用所述木瓜蛋白酶酶解的温度为

50-60℃，pH值为5-6，酶解时间为3 h

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：用所述木瓜蛋白酶酶解的温度为50℃，pH值为6。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶与权利要求10中所述四种原料药的配比为240-360U:100g。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶与权利要求10中所述四种原料药的配比为240U：100g。

说明书

一种四君子滴丸制剂

技术领域

[0001] 本发明属于药品技术领域，涉及一种四君子滴丸制剂，其主要活性物质为总多糖。

背景技术

[0002] 四君子汤最早见于《宋·太平惠民和剂局方》，是补气健脾的基础方，原方中采用人参，但在现代中药用药中常用党参代替人参。中国药典（2010版）中其由党参、茯苓、炒白术、炙甘草四味药组成，质量比例为2:2:2:1，有益气健脾之功效，主治营卫气虚，代表方剂为四君子汤。

[0003] 多糖类化合物作为一种新药物，具有毒副作用小、安全性高、疗效好等优点，因此在临床应用中显示出越来越广阔的前景。现已确认，多糖具有抗肿瘤和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等广泛的生物学活性。四君子总多糖和其他药用多糖一样具有广泛药理作用，其中对机体的免疫作用最显著。

[0004] 免疫调节作用：免疫反应主要涉及巨噬细胞和淋巴细胞。刘良等以100mg/kg剂量的环磷酰胺诱导肠粘膜相关淋巴组织损伤的小鼠为模型，口服给予四君子汤总多糖后，＋ ＋Peyer’s结数量基本恢复至正常水平，Peyer’s结内细胞数量、CD3 和IgA 细胞数量也均有一定程度上升，此实验表明四君子汤复方总多糖经口服给药具有一定程度改善肠粘膜免疫功能的作用。刘玉红通过采用噻唑蓝(MTT)法检测四君子汤总多糖对人肝癌细胞株HepG2和小鼠脾淋巴细胞增生的影响，结果表明，四君子汤总多糖在体外对HepG2细胞无明显影响，但能够显著促进脾淋巴细胞增生，从另一方面证明四君子多糖能增强机体的免疫力。

[0005] 抗肿瘤作用：肿瘤细胞具有无限增值的能力，一旦组织发生癌变，其细胞就会进行迅速的无限增值。具有抗肿瘤作用的多糖主要分为两类，一类对肿瘤细胞有直接的细胞毒活性，在体外可直接杀灭肿瘤细胞；另一类通过增强机体的免疫作用间接地抗肿瘤。刘玉红采用噻唑蓝(MTT)法检测四君子汤总多糖对人肝癌细胞株HepG2和小鼠脾淋巴细胞增生的影响。结果表明四君子汤总多糖没有直接抑制肿瘤的作用和无细胞毒作用，但其中的多糖组分通过其免疫促进活性能抑制肿瘤的生长。这与中药复方整体治疗的观念相一致，符合中药治疗肿瘤的特点。李传刚通过实验证明四君子汤可诱导小鼠膀胱癌肿瘤细胞凋亡，小鼠肿瘤组织在电镜下呈特征性凋亡形态，同时实验表明大剂量四君子汤可明显促进表达，肿瘤细胞在电镜下表现为凋亡的典型形态。这证明四君子汤能通过直接和间接的途径发挥抗肿瘤作用。

[0006] 抗胃肠疾病作用：四君子汤是健脾益气的基本方剂，脾气虚证是以消化系统为中心的多系统、多器官功能障碍证候群，即以消化、运动、吸收功能障碍为主。彭成等研究发现四君子汤对胃液量、胃酸pH值无影响，但能明显增加胃主细胞内酶元颗粒的含量，提高胃蛋白酶消化毛细玻管内凝固蛋白的长度，通过促进胃蛋白酶原的合成，提高胃蛋白酶的活性，从而提高消化能力。王文波等报道了四君子汤用于治疗功能性消化不良疾病，结果表明，四君子汤治疗功能性消化不良疗效确切，对临床脾虚证功能性消化不良患者出现的纳差、腹胀、便溏、乏力等有较好的治疗作用，临床总有效率达92.3％。

[0007] 四君子的现有剂型，药典记载的只有四君子丸剂，市场上有四君子颗粒剂，四君子合剂，茶剂，丸剂（水丸）。通过对四君子复方的剂型改进，进一步提高治疗效果，为患者提供服用方便，治疗效果优异的新剂型，具有一定的社会与经济意义。与注射液比较，滴丸剂在一定程度上保留了起效较快、生物利用度高的特点，又可避免中药注射液直接入血可能引起的急性毒性和过敏反应。

[0008] 相对于其他剂型，滴丸制剂吸收快，以水溶性基质制备的滴丸，溶散时限大多在5～15min，不超过30min，所以起效快，滴丸除可口服，还可舌下含服，通过口腔黏膜直接吸收入血，起效更快。滴丸制剂与片剂一样，也可制成缓释制剂，特别是对于某些半衰期较短的化药，制成缓释滴丸后可明显延长半衰期，此种滴丸药物从载体中缓慢释放，维持药物所需浓度，可呈长效作用，经口服除了可达到缓释作用外，还可减少在消化道和肝脏的灭活作用。滴丸剂与其他口服剂型比较，体积小，质量轻，使用更加方便。服用不受饭前或饭后影响，分量使用更为方便，克服了有些药物一次口服半片或1/4片的弊端。临床应用表明，局部应用滴丸药物有浓度高、不易流失、药效长、用药次数少等特点。滴丸制备时间短，温度变化范围小，药物稳定性增高，也适用于贵重药品、易氧化、易水解、易引湿和挥发性药品的制备。滴丸剂型的这些特点，非常适于以多糖、挥发油为主要活性成分的四君子制剂。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种以总多糖、挥发油为主要成分的四君子滴丸制剂。本发明的四君子滴丸对于益气健脾和促进肠胃运动方面有较强的作用。

[0010] 本发明所提供的四君子滴丸制剂，具体由挥发油、四君子总多糖和基质组成；

[0011] 所述挥发油是炒白术经二氧化碳超临界萃取得到；

[0012] 所述四君子总多糖从下述质量份数的四种原料药中提取得到：党参2份、炒白术残渣2份、茯苓2份、炙甘草1份，所述炒白术残渣为将炒白术经所述二氧化碳超临界萃取所述挥发油后剩余的物质；

[0013] 所述基质为木糖醇和羟丙基甲基纤维素（HPMC）；

[0014] 所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比为1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03。

[0015] 采用天然植物来源的木糖醇为基质，是由于其生物相容性好、可生物降解，无毒副作用。将木糖醇与羟丙基甲基纤维素配合使用，可以使滴丸具有很好的硬度，既解决了滴丸易碎的问题，又不影响其滴制过程的冷凝特性，同时，羟丙基甲基纤维素具有缓释作用，利于有效成分的吸收。

[0016] 在本发明的一个实施例中，所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素（HPMC）的质量配比具体为1:0.01:4:0.016。

[0017] 在本发明中，所述二氧化碳超临界萃取的条件具体为压力40～45MPa，温度35～45℃，时间1.5～2h。在本发明的一个实施例中，所述二氧化碳超临界萃取的条件具体为压力45MPa，温度40℃，时间2h。

[0018] 本发明的另一个目的是提供四君子滴丸制剂的制备方法。

[0019] 本发明所提供四君子滴丸制剂的制备方法具体可包括如下步骤：

[0020] （1）采用二氧化碳超临界萃取炒白术中的挥发油，同时收集炒白术残渣；

[0021] （2）将步骤（1）所述炒白术残渣与党参、茯苓和炙甘草按照下述重量份数混合后，提取四君子总多糖：所述党参2份、所述炒白术残渣2份、所述茯苓2份、所述炙甘草1份混合后，提取四君子总多糖；

[0022] （3）将所述四君子总多糖、所述挥发油、木糖醇和羟丙基甲基纤维素按照质量配比为1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03的比例制备得到四君子滴丸制剂。

[0023] 在上述方法步骤（1）中，所述二氧化碳超临界萃取的条件可为40～45MPa，温度35～45℃，时间1.5～2h；在本发明的一个实施例中，所述二氧化碳超临界萃取的条件具体为压力45MPa，温度40℃，时间2h；步骤（3）中，所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比具体可为1:0.01:4:0.016。

[0024] 在所述四君子滴丸制剂及其制备方法中，所述四君子总多糖的提取方法可包括用蛋白酶对四种原料药（质量配比同上）的水提液进行酶解去除蛋白的步骤。

[0025] 所述四种原料药的水提液按照包括如下步骤的方法制备得到：（a1）向所述四种原料药中加入5倍重量的石油醚，回流提取1h，挥干所述石油醚；

[0026] （a2）由步骤（a1）所得药渣用所述四种原料药5倍重量的85%（体积分数）乙醇提取1h，挥干所述乙醇；

[0027] （a3）由步骤（a2）所得药渣用所述四种原料药10倍重量的蒸馏水回流提取，从而获得所述四种原料药的水提液。

[0028] 在本发明的一个实施例中，所述蛋白酶具体为木瓜蛋白酶。

[0029] 用所述木瓜蛋白酶酶解的温度可为50-60℃，pH值可为5-6，酶解时间可为3h；所述木瓜蛋白酶与所述原料药的配比可为240-360U:100g。在本发明的一个实施例中，用所述木瓜蛋白酶酶解的温度具体为50℃，pH值具体为6；所述木瓜蛋白酶与所述原料药的配比具体为240U:100g。

[0030] 在实际操作中，用所述木瓜蛋白酶酶解后还需在100℃的水浴中灭活10min，以去除木瓜蛋白酶的影响。

[0031] 更进一步，在本发明中，所述四君子总多糖的制备方法具体包括如下步骤：

[0032] （1）向如下重量份数的四种原料药中加入所述四种原料药5倍重量的石油醚，回流提取1h，挥干所述石油醚：党参2份、炒白术2份、茯苓2份、炙甘草1份，所述炒白术为采用二氧化碳超临界萃取过挥发油成分的炒白术；

[0033] （2）由步骤（1）所得药渣用所述四种原料药5倍重量的85%（体积分数）乙醇提取1h，挥干所述乙醇；

[0034] （3）由步骤（2）所得药渣用所述四种原料药10倍重量的蒸馏水回流提取2次，每次3h，8层纱布过滤，合并滤液，浓缩滤液至其体积的毫升数与步骤（1）中所述四种原料药的总克数相等，得到浓缩液1（即所述四种原料药的水提液）；

[0035] （4）用木瓜蛋白酶对步骤（3）所得浓缩液1进行酶解，并用双氧水脱色，得到浓缩液2；

[0036] （5）向步骤（4）所得浓缩液2中加入所述浓缩液2两倍体积量的无水乙醇，放入冰箱，静置24h，抽滤，滤渣依次用无水乙醇、丙酮、石油醚进行洗涤，恒温冷冻干燥，得所述四君子总多糖。

[0037] 在上述方法中，步骤（1）中，所述二氧化碳超临界萃取的条件可为40～45MPa，温度35～45℃，时间1.5～2h；在本发明的一个实施例中，所述二氧化碳超临界萃取的条件具体为压力45MPa，温度40℃，时间2h。

[0038] 在上述方法中，步骤（4）中，用所述木瓜蛋白酶对所述浓缩液1进行酶解的温度可为50-60℃（如50℃），pH值可为5-6（如pH6.0），酶解时间可为3h；所述木瓜蛋白酶与所述原料药的配比可为240-360U:100g（如240U:100g）。

[0039] 在本发明的一个实施例中，所述四君子滴丸的制备方法具体包括如下步骤：

[0040] （1）混合基质的制备：将木糖醇与羟丙基甲基纤维素按质量比为1∶0.003～0.006的比例混合均匀；

[0041] （2）将所述挥发油、所述四君子总多糖加入到步骤（1）制备的混合基质中，得到混合物，使所述混合物中，所述四君子总多糖、所述挥发油和所述混合基质的质量比为1∶0.01～0.03∶4.012～5.03；

[0042] （3）将步骤（2）所得混合物在80±5℃左右加热熔融，用内径为2mm的滴头，控制滴头距冷却剂液面的距离为15±5cm，以滴速为15±2滴/min的速度滴入温度为3±2℃的所述冷却剂中，形成滴丸；

[0043] （4）吸去步骤（3）中滴丸表面的所述冷却剂，并干燥得所述四君子滴丸。

[0044] 通过上述方法制备得到的四君子滴丸制剂中，四君子总多糖、挥发油、木糖醇和羟丙基甲基纤维素的质量配比约为1:0.01～0.03:4～5:0.01～0.03。

[0045] 在上述方法中，步骤（1）中，所述木糖醇与所述羟丙基甲基纤维素的质量比具体可为1∶0.004；步骤（2）中，所述四君子总多糖、所述挥发油和所述混合基质的质量比具体可为1∶0.01∶4.016；步骤（3）中，所述混合物加热熔融的温度具体可为85℃；控制滴头距冷却剂液面的所述距离具体可为15cm，所述滴速具体可为15滴/min，所述冷却剂的温度具体可为5℃；所述冷却剂具体可为二甲硅油；步骤（4）中所述冷却剂具体可为二甲硅油。通过该方法制备得到的四君子滴丸制剂中，所述四君子总多糖、所述挥发油、所述木糖醇和所述羟丙基甲基纤维素的质量配比具体为1:0.01:4:0.016。

[0046] 本发明将木糖醇与羟丙基甲基纤维素配合使用，可以使滴丸具有很好的硬度，既解决了滴丸易碎的问题，又不影响其滴制与冷凝的特性。本发明所提供的四君子滴丸制剂，与传统水煎煮提取相比具有药物溶出快，吸收好，生物利用度高，服用方便，药物分散快、吸收好、稳定性增强等优点，具有较好的开发前景。实验证明，本发明所提供的四君子滴丸对于益气健脾方面，与传统汤剂相比具有更强的作用。

具体实施方式

[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0049] 下述实施例中所涉及的定量数据，均设置三次重复实验，其结果为三次重复的平均值。

[0050] 党参（安国市祈澳中药饮片有限公司，批号：100417101）；茯苓（安国市祈澳中药饮片有限公司，批号：100301111）；炒白术（安国市祈澳中药饮片有限公司，批号：100428101）；炙甘草（安国市祈澳中药饮片有限公司，批号：105668192）；大黄（甘肃省毫州市京皖中药饮品厂，批号：110901）；二甲硅油（天津市恒兴化学试剂有限公司,批号：20091221）；石油醚(30～60)（天津市恒兴化学试剂有限公司，批号：20090221）；无水乙醇（天津市进丰化工有限公司，批号：20110306）；木糖醇（山东福田药业有限公司，批号：11031908）；羟丙基甲基纤维素（山东瑞泰化工（集团）有限公司）；木瓜蛋白酶（广西科学院生物研究所，美刀牌，活力
240U/g，批号20110422）；大黄（甘肃省毫州市京皖中药饮品厂，批号：110901）；血清淀粉酶试剂盒（南京建成生物工程研究所生产，批号：20110620）；1%甲基橙（分析纯，天津市光复精细化工研究所），5%碳酸氢钠（分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司，批号：110801），氯化钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20100427）。胃动素(MTL)、血管活性肠肽(VIP)、前列腺素E2(PGE2)和P物质(SP)，均为ELISA试剂盒，由美国R&D公司生产，进口分装，批号201110，上海创赛公司提供。

[0051] SPE-SED 超 临 界 CO2 提 取 装 置（美 国 Applied Separation 公 司）；Agilent6890N-5973inent气相色谱-质谱联用仪；721可见分光光度计（上海菁华科技有限公司）；ZZ-6小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；ZB200疲劳转棒仪（成都泰盟科技有限公司）；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（金坛市丹阳门石英玻璃厂）；LD5-10型离心机（北京医用离心机厂）；Spectra Max190酶标仪（美国分子公司)；MH-5000可调式电热套（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；78X-2片剂四用崩解仪（上海黄海药检仪器厂）；JA4003精密电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；HY-081游标卡尺(杭州华益工具刀具有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；DHG-9075A烘箱（上海恒一科技有限公司）；不同规格的滴管等。

[0052] 实施例1、四君子滴丸制剂的制备及其功能鉴定

[0053] 一、四君子滴丸制剂的制备

[0054] 1、挥发油的萃取

[0055] 将上述原料药炒白术按照如下方法进行二氧化碳超临界萃取，获得挥发油：

[0056] （1）将20g粉碎均匀的原料药炒白术装入30mL提取釜，利用SPE-SED超临界CO2提取装置进行二氧化碳超临界萃取挥发油；

[0057] （2）控制二氧化碳超临界萃取挥发油的萃取压力45MPa，萃取温度40℃，萃取时间2h。

[0058] （3）萃取所得挥发油为绿色透明液体，所含活性成分经GC-MS分析主要为：杜松脑。

[0059] 2、四君子总多糖的提取及纯化

[0060] 四种原料药：党参10.00g、炒白术10.00g、茯苓10.00g、炙甘草5.00g。

[0061] 将经过步骤1进行过挥发油萃取的炒白术残渣与其余三种原料药（党参、茯苓和炙甘草）按照“党参10.00g、炒白术残渣10.00g、茯苓10.00g、炙甘草5.00g”的用量混合，混合后如下方法进行总多糖的提取及纯化，获得四君子总多糖：

[0062] （1）石油醚回流：将共计35g四君子药材粉末，加入相当于原药材5倍重量（175g）的石油醚，回流1h，挥干溶剂；

[0063] （2）乙醇回流：药渣中加入相当于原药材5倍重量（175g）的85%的乙醇，回流1h，挥干溶剂；

[0064] （3）水提：药渣中加入相当于原药材10倍重量的蒸馏水（350g，即350mL）进行提取，共提取2次，每次3h，纱布过滤，合并滤液，将滤液浓缩至35mL，相当于1g药材/mL；

[0065] （4）酶解：采用木瓜蛋白酶进行脱蛋白处理，控制水浴温度为50℃，pH值为6，酶解时间为3h，酶干粉用量为四种原料药总质量的1%（即0.35g木瓜蛋白酶，溶于50mL蒸馏水），计算酶活与四种原料药的配比为240U：100g，酶解后在100℃的水浴中灭活10min以去除残余的木瓜蛋白酶，加入原料药总质量的0.1%的H2O2脱色；

[0066] （5）醇沉：加2倍体积（170mL）的无水乙醇，放置冰箱，静置24h，抽滤，滤渣分别用无水乙醇、丙酮、石油醚依次进行洗涤，恒温冷冻干燥，得四君子总多糖。

[0067] 3、四君子滴丸制剂的制备

[0068] （1）混合基质的制备：将木糖醇与羟丙基甲基纤维素按质量比为1∶0.004的比例混合均匀；

[0069] （2）将步骤1获得的挥发油、步骤2获得的四君子总多糖加入到步骤（1）制备的混合基质中，获得混合物。其中四君子总多糖、挥发油和混合基质的质量比为1∶0.01∶4.016；

[0070] （3）将步骤（2）所得混合物搅拌均匀，在85℃加热熔融，搅拌均匀，用内径为2mm的滴头，控制滴头距冷却液（二甲硅油）液面的距离15cm，以滴速为15滴/min的速度滴入温度为5℃的冷却剂二甲硅油中，形成滴丸；

[0071] （4）吸去步骤（3）中滴丸表面的冷却剂二甲硅油，干燥得四君子滴丸。

[0072] 通过上述方法制备得到的四君子滴丸制剂中，四君子总多糖、挥发油、木糖醇和羟丙基甲基纤维素的质量配比为1:0.01:4:0.016。

[0073] 二、四君子滴丸制剂的功能鉴定

[0074] 1、四君子滴丸制剂益气健脾作用的实验研究

[0075] 实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购于山西医科大学实验动物中心，合格证号SCXK-201101。

[0076] 药物：步骤一制备的四君子滴丸制剂，四君子汤水提液，以及大黄提取液。其中，四君子汤水提液按照如下方法制备得到：将四种原料药党参、炒白术、茯苓、灸甘草按质量比2:2:2:1的比例混合，加入8倍质量的水，浸泡1h，煎煮2h，双层纱布过滤，将滤渣重复以上加水、煎煮、过滤的步骤，重复2次，合并3次煎煮的滤液，滤液浓缩至1.75g/mL，冷藏备用。
大黄提取液按照如下方法制备得到：取3倍质量的水将大黄浸泡1h，水煎煮提取15min，双层纱布过滤，滤渣加2倍质量的水煎煮15min，合并滤液，浓缩至1.5g/mL，密封，冷藏备用（用于制作脾虚小鼠模型）。

[0077] 本研究选用游泳、转棒、自主活动等实验，观察药物对脾虚小鼠的抗疲劳作用；选用血清淀粉酶来观察药物对脾虚小鼠消化功能的改善作用；通过对脾脏系数和胸腺系数的影响结果观察药物对免疫系统的影响作用。具体如下：

[0078] （1）分组及造模

[0079] 将96只昆明小鼠随机平均分成6组（16只/组），每组雌雄各半，即空白对照组、模型对照组、四君子汤组（35g原料药/kg）、四君子滴丸高剂量组（含四君子总多糖2g/kg）、四君子滴丸中剂量组（含四君子总多糖1g/kg）、四君子滴丸低剂量组（含四君子总多糖0.5g/kg）。除空白对照组灌服自来水外，其余各组灌胃大黄水提液37.5g/kg进行造模，每日一次，连续造模2周。灌服大黄水提液两周后，与空白对照组相比，造模小鼠出现耸毛、活动减少、饮食量减少等现象，说明造模小鼠已经具有脾虚症状。两周后，除空白对照组灌服自来水外，其余各组每日游泳一次（使小鼠继续维持脾虚症状并兼有气虚症状，合并游泳模型后动物出现活动减少、嗜卧等现象），并灌服相应的药物，即模型对照组灌服木糖醇和羟丙基甲基纤维素（HPMC）的混合物（木糖醇：HPMC质量比为1∶0.004）（3.5g/kg），四君子汤组灌服四君子汤水提液，四君子滴丸高、中、低剂量组灌服相应浓度的四君子滴丸溶液。各组连续灌服两周，每日一次。

[0080] （2）对脾虚小鼠体力性疲劳模型影响

[0081] A.转棒实验

[0082] 药物灌服第14天时，对各组小鼠进行转棒实验检测，具体如下：

[0083] 将ZB-200疲劳转棒仪的转速调整至40r/min，同步将5只小鼠放在转棒上，实验前三天适应性转棒3次，每次10min，给药1h后，将各组小鼠放置在转速为40r/min转棒上，记录小鼠在转棒上停留的时间，如果2min内跌落，将其立即放上棒上继续实验（参照“张林，韦坚仪，韩德刚等.地黄抗疲汤对小鼠抗疲劳作用的实验研究.泰山医学院学报，2009，30（3）：161-164”）。

[0084] B.游泳实验

[0085] 药物灌服第15天时，对各组小鼠进行游泳实验检测，具体如下：

[0086] 将小鼠置于水温25±1℃、水深约30cm的游泳箱中，给药1h后，在将放入游泳箱内，记录自游泳开始至小鼠头进入水面不能抬起时间，作为小鼠游泳时间（参照“张林，韦坚仪，韩德刚等.地黄抗疲汤对小鼠抗疲劳作用的实验研究.泰山医学院学报，2009，30（3）：161-164”）。

[0087] 结果显示：与空白对照组相比，模型对照组小鼠游泳时间明显缩短（P<0.01）；其余各组无显著差异。与模型对照组相比，四君子汤组、四君子滴丸高、中、低各剂量组游泳时间均有延长，其中四君子汤水提液组、四君子滴丸高、中剂量组具有显著差异（P<0.01），且四君子滴丸高剂量组作用效果明显好于四君子汤组（P<0.05）。与空白对照组比较，模型组小鼠转棒时间明显缩短（P<0.05），与模型对照组比较，四君子汤组、四君子滴丸高、中、低各剂量组转棒时间均有延长，其中四君子滴丸高、中剂量组具有显著差异（P<0.01、P<0.05），且作用优于四君子汤组。结果见表1。

[0088] 表1四君子滴丸对脾虚小鼠游泳及转棒时间的影响

[0089]

[0090] 注：与空白对照组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与四君子汤组比较▲P<0.05。

[0091] （3）对脾虚小鼠自主活动的影响

[0092] 药物灌服第15天时，对各组小鼠进行自主活动检测，具体如下：

[0093] 给药后1h，将小鼠置于ZB-200型小动物自主活动仪内，适应5min，记录5min内小鼠活动的次数（参考“张大方，金若敏，孟宪丽等.药理与中药药理实验.上海科学技术出版社，2006，第二版，34-35”）。

[0094] 结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠自主活动次数显著减少（P<0.01）；与模型对照组比较，四君子汤组、四君子滴丸高、中、低剂量组自主活动时间明显延长（P<0.05，或P<0.01），四君子滴丸高剂量组作用结果优于四君子汤组（P<0.05）。结果见表
2。

[0095] 表2四君子滴丸对脾虚小鼠自主活动的影响

[0096]

[0097]

[0098] 注：与空白对照组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与四君子汤组比较▲P<0.05。

[0099] （4）对脾虚小鼠免疫器官及血清淀粉酶的影响

[0100] 末次给药后1h，一方面，眼眶静脉丛取血，3000r/min离心，取血清，用血清淀粉酶试剂盒测定血清淀粉酶含量。另一方面，处死小鼠，取胸腺和脾，称重，计算脏器系数（脏器系数=脏器重量（g）/小鼠体重（g））（参考“甘静宜，巩忠福，程桂林等.四君子汤对脾虚大鼠血清消化酶和胃肠激素的影响.中国兽医杂志，2011，42（2）：43-44”）。

[0101] 免疫器官质量检测结果显示：与空白对照组相比，模型对照组脾脏系数和胸腺系数明显降低（P<0.01）；与模型组相比，四君子汤组、四君子滴丸高、中、低剂量组脾脏系数和胸腺系数均有一定的增加，且四君子汤组、四君子滴丸高、中剂量组作用效果显著（P<0.05，P<0.01），说明四君子滴丸可增加脾虚小鼠的免疫器官质量。结果见表3。

[0102] 表3四君子滴丸对脾虚小鼠脾脏系数和胸腺系数的影响

[0103]

[0104] 注：与空白对照组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05、**P<0.01。

[0105] 血清淀粉酶检测结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠血清淀粉酶（AMS）显著减少（P<0.01）；与模型对照组比较，四君子汤组、四君子滴丸高、中、剂量组血清淀粉酶明显增高（P<0.05，或P<0.01）；与四君子汤组比较，四君子滴丸高、中剂量组作用较好（P>0.05）。结果见表4。

[0106] 表4四君子滴丸对脾虚小鼠血清中淀粉酶含量的影响

[0107]

[0108] 注：与空白对照组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与四君子汤组比较▲P<0.05。

[0109] 2、四君子滴丸制剂对小鼠胃肠运动影响的实验研究

[0110] 实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购于山西医科大学实验动物中心，合格证号SCXK-201101。

[0111] 药物：步骤一制备的四君子滴丸制剂，四君子汤水提液，以及大黄提取液。其中，四君子汤水提液按照如下方法制备得到：将四种原料药党参、炒白术、茯苓、灸甘草按质量比2:2:2:1的比例混合，加入8倍质量的水，浸泡1h，煎煮2h，双层纱布过滤，将滤渣重复以上加水、煎煮、过滤的步骤，重复2次，合并3次煎煮的滤液，滤液浓缩至1.75g/mL，冷藏备用。
大黄提取液按照如下方法制备得到：取3倍质量的水将大黄浸泡1h，水煎煮提取15min，双层纱布过滤，滤渣加2倍质量的水煎煮15min，合并滤液，浓缩至1.5g/mL，密封，冷藏备用（用于制作脾虚小鼠模型）。

[0112] 本研究选用肠推进率、胃排空量来观察药物对脾虚小鼠消化吸收和胃肠活动的影响，选用胃动素、血管活性肠肽、前列腺素E2及P物质几项指标观察药物对脾虚小鼠胃肠激素的影响。具体如下：

[0113] （1）分组和造模

[0114] 将72只昆明小鼠随机平均分成6组（12只/组），每组雌雄各半，即空白对照组、模型对照组、四君子汤组（35g原料药/kg）、四君子滴丸高剂量组（含四君子总多糖2g/kg）、四君子滴丸中剂量组（含四君子总多糖1g/kg）、四君子滴丸低剂量组（含四君子总多糖0.5g/kg）。每日两分次给药，采用边给药边造模的方法，上午除空白对照组灌服自来水外，其余各组灌服相应的药物，即模型对照组灌服木糖醇和羟丙基甲基纤维素（HPMC）的混合物（木糖醇：HPMC质量比为1∶0.004）（3.5g/kg），四君子汤组灌服四君子汤水提液，四君子滴丸高、中、低剂量组灌服相应浓度的四君子滴丸溶液，下午除空白对照组灌服自来水外，其余各组灌胃大黄水提液37.5g/kg进行造模，每天下午给药完毕后，将除空白对照组外的各组小鼠置于水温25±1℃、水深约30cm的游泳箱中，游泳10min后捞起吹干，连续两周（使小鼠每日游泳一次，是为了继续维持脾虚症状并兼有气虚症状，即出现活动减少、嗜卧等现象）。

[0115] （2）对脾虚小鼠肠推进率及胃排空量的影响

[0116] 药物灌服第15天时，对各组小鼠进行肠推进率及胃排空量的检测，具体如下：

[0117] 给药后30min，灌服1%甲基橙，给药量为0.1mL/10g，20min后，小鼠眼球取血至死，称量小鼠体重，解剖，将小鼠胃两端结扎后截取胃，再截取小肠。用卷尺测量上至幽门，下至回盲部的肠管长度，及甲基橙红染部分长度。计算甲基橙推进率，推进率=推进距离（cm）/小肠全长（cm）×100%。将胃置于5mL浓度为1%（1g/100ml）的碳酸氢钠溶液中，用剪刀剪破，浸泡半小时后，2000r/min离心10min，取上清液，测其吸光度（A），计算胃排空量，胃排空量=（1-A）/A对照×100%（A对照为0.25mL的1%甲基橙溶于5mL碳酸氢钠溶液的吸光度值）。

[0118] 肠推进率检测结果显示：与空白对照组相比，模型对照组肠推进率有所增高。与模型对照组比较，其余各剂量组均有所降低，但无显著差异。

[0119] 胃排空量检测结果显示：与空白组对照相比，模型对照组、四君子汤组胃排空量有显著减小（P<0.01），其余各组无明显差异。与模型对照组比较，四君子滴丸高、低剂量组胃排空量有明显增大（P<0.05），中剂量组有显著增大（P<0.01），四君子汤组呈增大趋势，无明显变化。与四君子汤组比较，四君子滴丸高、中、低剂量组均有显著差异（P<0.01）。结果见表5。

[0120] 表5四君子滴丸对脾虚小鼠肠推进率及胃残留量的影响

[0121]

[0122] 注：与空白组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型组比较*P<0.05、**P<0.01；与四君子汤组比较▲P<0.05、▲▲P<0.01。

[0123] （3）对脾虚小鼠血清胃动素及小肠匀浆液活性肠肽、前列腺素E2及P物质的影响[0124] 药物灌服第15天时，对各组小鼠进行血清胃动素（MTL）及小肠匀浆液活性肠肽（VIP）、前列腺素E2（PGE2）及P物质（SP）的检测，具体如下：

[0125] 将小鼠从眼角取血，3500r/min离心10min，取血清，用ELESA试剂盒测定小鼠血清胃动素。截取肠管，称重，制成10%组织匀浆，2500r/min离心10min，取上清液，用ELESA法测定小鼠小肠匀浆液中VIP、PGE2、SP含量。ELESA操作参照相应的试剂盒说明书进行。以上各组数据整理后，用统计学方法进行处理，比较分析。

[0126] 血清胃动素检测结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠的胃动素（MTL）水平呈显著性升高趋势（P<0.01）。与模型对照组比较，四君子滴丸高、中剂量组小鼠胃动素（MTL）水平呈明显降低趋势（P<0.05），四君子汤组呈明显升高趋势（P<0.05），四君子滴丸低剂量组呈降低趋势，但无明显差异。与四君子汤组比较，四君子滴丸高、中、低剂量组均有明显差异（P<0.01，或P<0.05）。结果见表6。

[0127] 表6四君子滴丸对脾虚小鼠胃动素的影响

[0128]

[0129] 注：与空白对照组比较△P<0.05、△△P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05、**P<0.01，与四君子汤组比较▲P<0.05、▲▲P<0.01。

[0130] 小肠匀浆液活性肠肽、前列腺素E2及P物质的检测结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小肠匀浆液活性肠肽含量呈升高趋势，且具有显著差异（P<0.05），与模型