鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增检测方法

摘要

本发明涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法，该方法包括真菌DNA的提取、真菌的环介导等温扩增、显示检测步骤完成，以克服现有技术所需周期长、操作复杂等问题，该方法优点是快速、特异性强、灵敏度高，且成本低，可用于田间鹰嘴豆壳二孢叶枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

权利要求

1.一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增检测方法，其特征在于按下列步骤进行：a、待检样品或真菌的DNA提取：

采用常规真菌DNA提取方法提取待检样品，或真菌的核酸，其中提取样品DNA的OD260/OD280为1.6-2.0，浓度为10-100ng/μL；

b、进行鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌的环介导等温扩增反应：

在装有22μL环介导等温扩增反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶，于恒温65℃扩增反应30-60min，将温度调到80℃终止反应，3-5min后取出待检，其中Bst DNA聚合酶为8U/μL；环介导等温扩增反应液是由10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L脱氧核酸三磷酸基质、4-8mmol/L硫酸镁、0.8-1.6μmol/L上游内引物FIP、0.8-1.6μmol/L下游内引物BIP、0.2-0.3μmol/L上游外引物F3、0.2-0.3μmol/L下游外引物B3、0.2-0.8μmol/L上游环引物LF和0.2-0.8μmol/L下游环引物LB组成，其中：上游外引物F3：5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’；

下游外引物B3：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’；

上游内引物FIP：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’；

下游外引物BIP：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’；

上游环引物LF：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’；

下游环引物LB：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’；环介导等温扩增反应液中

10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH 8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、

100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；环介导等温扩增反应液中的脱氧核酸三磷酸基质由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四种脱氧核糖核酸组成，其中四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1；

c、显色检测：在每个反应管中加入1μL显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，即为待检样品中含有或为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌。

说明书

鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增检测方法

技术领域

[0001] 本发明设涉及一种利用环介导等温扩增技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

[0002] 鹰嘴豆壳二孢叶枯病由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起，是一种毁灭性的病害。1911年，鹰嘴豆壳二孢叶枯病在巴基斯坦被首次发现，该病害的危害性很高，在鹰嘴豆的重要种植区巴基斯坦，年受害面积高达25-50％。冷凉的气候非常适合病害发展，常造成100％的产量损失。2007年，该病害在新疆北部的鹰嘴豆主栽区昌吉州木垒2
县、奇台县等地暴发，其中仅在木垒县发病面积为4000hm，平均为害株率46％，严重田块为害株率达到100％，产量损失率为40％-50％。该病害主要危害叶片、叶柄、茎杆，也可侵染幼嫩的荚果。叶片被害后由叶缘向内扩散，形成“U”形或“V”形浅褐色至深褐色病斑，潮湿时病斑上产生分散的细小黑点，叶柄和茎杆受害初期产生水浸状病斑，随后病斑逐渐变为深褐色，病斑处凹陷并逐渐萎蔫干枯造成落叶断枝，严重时整株枯萎死亡。豆荚受害初期产生水浸状病斑，然后变成深褐色病斑，严重时豆荚干枯。雨水偏多年份，发病严重，产量损失极大。因此，开展鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病的传播与控制具有重要意义。

[0003] 自从发现鹰嘴豆壳二孢叶枯病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究。传统的检测方法是从病残体或带病种子分离菌体，将其接种在相应培养基上，于适宜温度培养数天，再对这些菌体的形态进行观察。若产孢则继续观察分生孢子的形态特征，从菌落上挑片镜检，观察菌丝、分生孢子、分 生孢子梗等形态。从而确定是否存在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由Ascochyta rabiei引起的病害。传统的检测方法不仅操作繁琐、费时，而且要求有高度的专业知识，尤其不能满足病害防治中快速诊断及海关进出境快速检测和鉴定的需求。

[0004] 基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但成本高，制约了其发展；杂交方式固有的局限性影响了其特异性；质谱技术以其快速真确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高，因此，限制了其应用。

[0005] 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，出现了多种核酸扩增方法，如链替代扩增反应(Strand Displacement Amplification，SDA)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)，以及目前被广泛使用的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)等。这些扩增方法都有其启动新一轮核酸合成的创新之处。

[0006] 其中，基于rDNA-ITS的长度多态性和序列多态性的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反应生物亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的热点，目前已广泛应用于真菌的属种间及种内组群水平的系统学研究。因此，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对真菌的分子检测开展研究，但PCR方法需要昂贵的PCR仪，对设备要求较高，不适宜在基层进行推广。

[0007] 环介导等温扩增技术(Loop-mediatd Isothermal Amplification，简称LAMP)，是2000年由日本的荣研株式会的Notomi T等人开发出来的一种新的核酸扩增方法。LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特9 10
点，可以在1h之内，将靶DNA片段扩增10-10 倍。反应完成后，直接在扩增产物中添加SYBR GREEN I染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果，体系呈绿色即为 阳性，呈橙色即为阴性。或在DNA延生合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中镁离子结合，会产生一种焦磷酸镁的衍生物，而高效扩增的LAMP法生成大量这样的衍生物，并呈现白色沉淀。可以把浑浊度作为鉴定指标，只要用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察等过程。具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点。已广泛应用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性及定量检测。因为LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，所以利于在一些基层机构的应用，有着极为广泛的应用前景。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的环介导等温扩增快速检测方法，该方法包括真菌DNA的提取、真菌的环介导等温扩增、显示检测步骤完成，以克服现有技术所需周期长、操作复杂等等问题，该方法优点是快速、特异性强、灵敏度高，且成本低，可用于田间鹰嘴豆壳二孢叶枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

[0009] 本发明所述的一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法，按下列步骤进行：

[0010] a、待检样品或真菌的DNA提取：

[0011] 采用常规真菌DNA提取方法提取待检样品核酸，其中提取样品DNA的OD260/OD280为1.6-2.0，浓度为10-100ng/μL；

[0012] b、进行鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌的环介导等温扩增反应：

[0013] 在装有22μL环介导等温扩增反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶，于恒温65℃扩增反应30-60min，将温度调到80℃终止反应，3-5min后取出待检；

[0014] c、显色检测：在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，即为待检样品中含有或为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌。

[0015] 步骤b中环介导等温扩增反应液是由10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L脱氧核酸三磷酸基质、4-8mmol/L硫酸镁、0.8-1.6μmol/L 上游内 引物FIP、0.8-1.6μmol/L下游内引物BIP、0.2-0.3μmol/L上游外引物F3、0.2-0.3μmol/L下游外引物B3、0.2-0.8μmol/L上游环引物LF和0.2-0.8μmol/L下游环引物LB组成，其中：

[0016] 上游外引物F3：5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’；

[0017] 下游外引物B3：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’；

[0018] 上游内引物FIP：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’；

[0019] 下游外引物BIP：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’；

[0020] 上游环引物LF：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’；

[0021] 下游环引物LB：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’。

[0022] 步骤b环介导等温扩增反应液中10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100。

[0023] 步骤b环介导等温扩增反应液中的脱氧核酸三磷酸基质由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四种脱氧核糖核酸组成，其中四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

[0024] 步骤b中Bst DNA聚合酶为8U/μL。

[0025] 步骤c中显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I。

[0026] 本发明所述的一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的环介导等温扩增快速检测方法，该方法的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件 下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形9
成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA积累到10拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。

[0027] 本发明涉及的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌环介导等温扩增快速检测方法，该方法中：

[0028] 鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的分离、纯化，采用常规分离真菌的方法对其进行分离，采用单孢分离进行纯化；

[0029] 鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的培养：将鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei接种到鹰嘴豆煎汁PDA平板上，置温度26℃温箱中培养15d，备用；

[0030] 鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和检测：将50mg冷冻干燥后的菌丝和孢子粉至研钵内加入液氮充分研磨，倒入离心管中，加入200μL2％十六烷基三甲基溴化铵裂解液(100mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.0；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，1.4mol/L氯化钠和少量石英砂充分研磨，再加入300μL2％十六烷基三甲基溴化铵裂解液，将样品充分混匀，温度65℃，水浴1h(5-10min混匀一次)取出放置室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v)24∶1，充分颠倒混匀，12000转/分钟离心10min，取上清液至新的离心管中，继续抽提一次，取上清液至新的离心管中，加入等体积预冷异丙醇充分颠倒混匀，温度4℃，放置1-2h促进DNA沉淀，12000转/分钟，温度4℃，离心10min，弃上清液，加入500μL70％乙醇混匀，12000转/分钟，温度4℃，离心5min，弃上清液，在超净工作台上自然晾干无酒精味后加入适量的1×TE(10mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸，0.1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)缓冲液进行溶解(TE中含5μg/μL核糖核酸酶(RNase))，得到DNA溶液待用；

[0031] 下载GenBank公布的多条鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei ITS序列，其序列号分别为AY152550，DQ822479，DQ822480，EU167600，FJ032643，HQ700312，JF714463，将下载序列与本实验测序序列名为“ITS”进行比对，找出保守区，即ITS序列的1-440bp，并根据其利用在线软件 www.primerexplorer，jp设计一套特异的LAMP引物，包括两条外引物：上游外引物(F3)/下游外引物(B3)，两条内引物：上游内引物(FIP)/下游内引物(BIP)，两条环引物：上游环引物(LF)/下游环引物(LB)；鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei真菌环介导等温扩增LAMP检测引物的靶片段大小为181bp；

[0032] 其中引物序列为：

[0033] 上游外引物F3：5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’；

[0034] 下游外引物B3：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’；

[0035] 上游内引物FIP：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’；

[0036] 下游外引物BIP：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’；

[0037] 上游环引物LF：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’；

[0038] 下游环引物LB：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’。

[0039] 序列比对结果：

[0040] AY152550 .....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35[0041] DQ822479 ....g----------------------------------- 36[0042] DQ822480 ....g----------------------------------- 36[0043] EU167600 gaagg----------------------------------- 1720[0044] FJ032643 gaagg----------------------------------- 58[0045] HQ700312 gaagg-------------------------------t--- 59[0046] JF714463 .......ggggct----c-g-a------------------ 33[0047] ITS ................................-------- 8[0048] AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75[0049] DQ822479 ---------------------------------------- 76[0050] DQ822480 ---------------------------------------- 76[0051] EU167600 ---------------------------------------- 1760[0052] FJ032643 ---------------------------------------- 98[0053] HQ700312 ---------------------------------------- 99[0054] JF714463 ---------------------------------------- 73[0055] ITS ---------------------------------------- 48[0056] AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115[0057] DQ822479 ---------------------------------------- 116[0058] DQ822480 ---------------------------------------- 116[0059] EU167600 ---------------------------------------- 1800[0060] FJ032643 ---------------------------------------- 138[0061] HQ700312 ---------------------------------------- 139[0062] JF714463 ---------------------------------------- 113[0063] ITS ---------------------------------------- 88[0064] AY152550 TGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCA 155[0065] DQ822479 ---------------------------------------- 156[0066] DQ822480 ---------------------------------------- 156[0067] EU167600 ---------------------------------------- 1840[0068] FJ032643 ---------------------------------------- 178[0069] HQ700312 ----g----------------------------------- 179[0070] JF714463 ---------------------------------------- 153[0071] ITS ---------------------------------------- 128[0072] AY152550 ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG 195[0073] DQ822479 ---------------------------------------- 196[0074] DQ822480 ---------------------------------------- 196[0075] EU167600 ---------------------------------------- 1880[0076] FJ032643 ---------------------------------------- 218[0077] HQ700312 ---------------------------------------- 219[0078] JF714463 ---------------------------------------- 193[0079] ITS ---------------------------------------- 168[0080] AY152550 CGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA 235[0081] DQ822479 ---------------------------------------- 236[0082] DQ822480 ---------------------------------------- 236[0083] EU167600 ---------------------------------------- 1920[0084] FJ032643 ---------------------------------------- 258[0085] HQ700312 ---------------------------------------- 259[0086] JF714463 ---------------------------------------- 233[0087] ITS ---------------------------------------- 208[0088] AY152550 TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTC 275[0089] DQ822479 ---------------------------------------- 276[0090] DQ822480 ---------------------------------------- 276[0091] EU167600 ---------------------------------------- 1960[0092] FJ032643 ---------------------------------------- 298[0093] HQ700312 ---------------------------------------- 299[0094] JF714463 ---------------------------------------- 273[0095] ITS ---------------------------------------- 248[0096] AY152550 CATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAG 315[0097] DQ822479 ---------------------------------------- 316[0098] DQ822480 ---------------------------------------- 316[0099] EU167600 ---------------------------------------- 2000[0100] FJ032643 ---------------------------------------- 338[0101] HQ700312 ---------------------------------------- 339[0102] JF714463 ---------------------------------------- 313[0103] ITS ---------------------------------------- 288[0104] AY152550 CTTTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTA 355[0105] DQ822479 ---------------------------------------- 356[0106] DQ822480 ---------------------------------------- 356[0107] EU167600 ---------------------------------------- 2040[0108] FJ032643 ---------------------------------------- 378[0109] HQ700312 ---------------------------------------- 379[0110] JF714463 ---------------------------------------- 353[0111] ITS ---------------------------------------- 328[0112] AY152550 GACTCCCCCTTAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTT 395[0113] DQ822479 -----g--.------------------------------- 395[0114] DQ822480 -----g--.------------------------------- 395[0115] EU167600 -----g--.------------------------------- 2079[0116] FJ032643 -----g--.------------------------------- 417[0117] HQ700312 -----g--.------------------------------- 418[0118] JF714463 -----g--.------------------------------- 392[0119] ITS -----g--.------------------------------- 367[0120] AY152550 CGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCATAACGACG 435[0121] DQ822479 ---------------------------------------- 435[0122] DQ822480 ---------------------------------------- 435[0123] EU167600 ---------------------------------------- 2119[0124] FJ032643 ---------------------------------------- 457[0125] HQ700312 ---------------------------------------- 458[0126] JF714463 ---------------------------------------- 432[0127] ITS ---------------------------------------- 407[0128] AY152550 ACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACC........ 467[0129] DQ822479 --------------------------------........ 467[0130] DQ822480 --------------------------------........ 467[0131] EU167600 --------------------------------tcggatca 2159[0132] FJ032643 --------------------------------tcggatca 497[0133] HQ700312 --------------------------------tcggatca 498[0134] JF714463 --------------------------------tcggatca 472[0135] ITS --------------------------------t....... 440[0136] LAMP引物设计：

[0137]

[0138]

[0139] LAMP引物序列：

[0140]

[0141] 进行鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的环介导等温扩增反应：

[0142] 环介导等温扩增(LAMP)反应体系(25μL)：上游内引物：上游内引物(FIP)/下游内引物(BIP)各1.6μM，外引物：上游外引物(F3)/下游外引物(B3)各0.2μM，环引物：上游环引物(LF)/下游环引物(LB)各0.8μM，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)(10mM each)1.4μM，10×LAMP Buffer(KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、TritonX-100 2.5μL，硫酸镁2μL，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA2μL，用超纯水补齐至25μL，将样品混合均匀，于温度65℃孵育45min，温度80℃，10min结束反应；

[0143] 结果检测：

[0144] (1)离心产物看是否产生白色沉淀，若有白色沉淀产生，结果为阳性，若无白色沉淀产生，则结果为阴性；

[0145] (2)将产物于2％-3％的琼脂糖凝胶电泳分析，若图片显示LAMP特征性梯状条带，结果为阳性，如无任何条带则结果为阴性；

[0146] (3)加入1μL SYBR GREEN I观察颜色变化，若产物变为绿色，为阳性，若不变色仍为橙色，则结果为阴性。

[0147] 本发明所述的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌环介导等温扩增快速检测方法，是根据鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌的ITS保守序列利用在线软件www.primerexplorer，jp在线设计一套特异的LAMP引物，包括两条外引物：上游外引物(F3)/下游外引物(B3)，两条内引物：上游内引物(FIP)/下游内引物(BIP)，两条环引物：上游环引物(LF)/下游环引物(LB)；鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei真菌LAMP检测引物的靶片段大小为181bp；
该保守序列为鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌所特有，以保证检测不同属真菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与普通PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用琼脂糖凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料用肉眼即可观察，简单而快速，特别适用于基层检验检疫机构。
附图说明：

[0148] 图1为本发明所要检测的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的特异性电泳检测图，其中：泳道M为分子量为2000bp的marker，泳道1-9依次为鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabeie，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，链格孢(Alternaria alternata)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，赤霉菌属(Nectria sp.)，毛壳菌属(Chaetomium sp.)，生赤壳属(Bionectria sp.)，镰刀菌属(Fusarium sp.)，阴性 对照；

[0149] 图2为本发明所要检测的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的特异性显色反应图，其中：1-9依次为鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabeie，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，链格孢(Alternaria alternata)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，赤霉菌属(Nectria sp.)，毛壳菌属(Chaetomium sp.)，生赤壳属(Bionectria sp.)，镰刀菌属(Fusarium sp.)，阴性对照；

[0150] 图3为本发明检测的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的灵敏性电泳检测图，其中：泳道M为分子量为2000bp的marker，泳道1-10为DNA浓度梯度，依次为6.01×10ng/μL，0 -1 -2 -3 -4
6.01×10ng/μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/-5 -6 -7 -8
μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/μL，6.01×10 ng/μL；

[0151] 图4为本发明对鹰嘴豆壳二孢病残体、带菌种子及带菌土壤的电泳检测图，其中：泳道M为分子量为2000bp的marker，泳道1-6分别为病残体DNA，带病种子DNA，不带病种子DNA，带病土DNA，不带病土DNA，阴性对照；

[0152] 图5为本发明对鹰嘴豆壳二孢病残体、带菌种子及带菌土壤的显色反应图，其中：1-6分别为病残体DNA，带病种子DNA，不带病种子DNA，带病土DNA，不带病土DNA，阴性对照。

具体实施方式

[0153] 下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制；

[0154] 实施例1环介导等温扩增技术对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的特异性检测：

[0155] 环介导等温扩增(LAMP)反应液：

[0156] 环介导等温扩增(LAMP)反应体系(25μL)：内引物FIP/BIP为上游内引物(FIP)：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’和下游内引物(BIP)：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’各1.6μM，外引物F3/B3为上游外引物(F3)：
5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’，下游外引物(B3)：5’- ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’各
0.2μM，环引物LF/LB为上游环引物(LF)：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’，下游环引物(LB)：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’各0.8μM，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)(10mM each)1.4μM，其中混合物脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1，10×LAMP Buffer(KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、曲拉通X-100)2.5μL，MgSO42μL，BstDNA聚合酶8U，用双蒸水补齐至23μL；其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

[0157] Bst DNA聚合酶：8U/μL(New England Biolabs)；

[0158] 显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I；

[0159] 按程序进行检测：

[0160] 样品DNA提取：

[0161] 使用试剂盒提取包括鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌，其他为常见菌株的DNA；

[0162] 进行环介导等温扩增反应：

[0163] 在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，于温度65℃，孵育45min，温度80℃，10min结束反应；

[0164] 电泳检测及显色检测：

[0165] 将产物于2％-3％的琼脂糖凝胶电泳分析，若图片显示环介导等温扩增LAMP特征性梯状条带，结果为阳性，如无任何条带则结果为阴性；

[0166] 加入1μL的显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I观察颜色变化，若产物变为绿色，为阳性，若不变色仍为橙色，则结果为阴性；

[0167] 对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei基因组DNA及其他8个菌株进行环介导等温(LAMP)扩增后，结果显示，结果只有鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei扩增得到阶梯状条带，其他供试菌株均无此扩增产物，向PCR产物中分别加入1μL显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I，发现阳性反应管呈现绿色，而阴性对照管未出现。

[0168] 实施例2环介导等温扩增技术对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的灵敏性检测：

[0169] LAMP反应液：

[0170] 环介导等温扩增(LAMP)反应体系(25μL)：内引物FIP/BIP为上游内引物(FIP)：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’和下游内引物(BIP)：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’各1.6μM，外引物F3/B3为上游外引物(F3)：
5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’，下游外引物(B3)：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’各
0.2μM，环引物LF/LB为上游环引物(LF)：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’，下游环引物(LB)：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’各0.8μM，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)(10mM each)1.4μM，其中混合物脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1，10×LAMP Buffer(KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、曲拉通X-100)2.5μL，硫酸镁2μL，Bst DNA聚合酶8U，用双蒸水补齐至23μL；其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

[0171] 显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I；

[0172] 按程序进行检测：

[0173] 样品DNA提取：

[0174] 使用试剂盒提取包括鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌DNA，并将原液按10倍比例稀释，作为模板进行LAMP扩增，检测灵敏度；

[0175] 进行环介导等温扩增反应：

[0176] 在装有23μLLAMP反应液的反应管中加入2μL不同浓度的模板DNA，于温度65℃，孵育45min，温度80℃，10min结束反应；

[0177] 电泳检测及显色检测：

[0178] 将产物于2％-3％的琼脂糖凝胶电泳分析，根据显示环介导等温扩增LAMP特征性梯状条带鉴定LAMP反应灵敏性；

[0179] 取浓度为60.1ng/μL的DNA，将其进行10倍比例稀释，环介导等温扩增LAMP最低-6检出限为6.01×10 ng/μL。

[0180] 实施例3鹰嘴豆壳二孢叶枯病病残体、带菌土壤、带菌种子的特异性检测：

[0181] 环介导等温扩增LAMP反应液：

[0182] 环介导等温扩增LAMP反应体系(25μL)：内引物FIP/BIP为上游内引物(FIP)：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’和下游内引物(BIP)：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3，各1.6μM，外引物F3/B3为上游外引物(F3)：
5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’，下游外引物(B3)：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’各
0.2μM，环引物LF/LB为上游环引物(LF)：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’，下游环引物(LB)：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’各0.8μM，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)(10mM each)1.4μM，其中混合物脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1，10×LAMP Buffer(KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、曲拉通X-100)2.5μL，硫酸镁2μL，Bst DNA聚合酶8U购于(New England Biolabs)，用双蒸水补齐至23μL；其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

[0183] 显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I；

[0184] 按程序进行检测：

[0185] 样品DNA提取：

[0186] 使用试剂盒提取包括鹰嘴豆壳二孢叶枯病病残体、带菌土壤、带菌种子的DNA；

[0187] 进行环介导等温扩增反应：

[0188] 在装有23μLLAMP反应液的反应管中加入2μL不同的模板DNA，于温度65℃，孵育45min，温度80℃，10min结束反应；

[0189] 电泳检测及显色检测：

[0190] 将产物于2％-3％的琼脂糖凝胶电泳分析，若图片显示环介导等温扩增LAMP特征性梯状条带，结果为阳性，如无任何条带则结果为阴性；

[0191] 加入1μL10％的荧光染料SYBR Green I观察颜色变化，若产物变为绿色，为阳性，若不变色仍为橙色，则结果为阴性；

[0192] 采用环介导等温扩增LAMP方法对鹰嘴豆植株病残体，带病种子及带病土壤DNA进行恒温扩增，结果只有带病样品获得阶梯状条带，对照样品则无任何条带；向环介导等温扩增LAMP产物中滴加显色剂SYBR GREEN I进行颜色反应，发现带病样品颜色由橙色变为绿色，而对照样品颜色则不发生任何变化，仍为橙色。