一种水稻杂交育种材料及其培育方法与应用，利用特异启动子驱动和反义抑制表达的手段获得带有除草剂敏感基因、且除草剂敏感基因仅在雄蕊中表达的母本材料和带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雌蕊中表达的父本材料。应用中将父母本材料混播，进行机械化种植，通过在抽穗前喷施除草剂，实现母本去雄，父本去雌，利用双亲间的单向交配生产高质量的F1杂交种子。本发明方法可以自由的获得“不育系”和“恢复系”，并获得高纯度的杂交种，有效去除父母本自交结实种子的混杂，特别是避免了光温敏不育系在不利的光温条件下育性恢复所导致的杂交种纯度严重下降，而且简化了杂交水稻亲本的繁殖过程，节省了人力、物力，提高了生产效率。
1.一种水稻杂交育种材料的培育方法，其特征在于，所述水稻杂交育种材料的母本材料带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雄蕊中表达；父本材料带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雌蕊中表达，其中，所述母本材料培育方法为：克隆Osg6B雄蕊特异启动子并将Osg6B雄蕊特异启动子驱动的氰氟草酯敏感基因的反义片段或苯达松敏感基因的反义片段转入水稻母本品种，使除草剂抗性基因特异的在雄蕊部位表达受到抑制，实现Osg6B雄蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，得到仅有雄蕊部分对除草剂敏感的母本材料，所述水稻母本品种为NS629S；
所述父本材料的培育方法为：克隆STS14雌蕊特异启动子并将STS14雌蕊特异启动子驱动的氰氟草酯敏感基因的反义片段或苯达松敏感基因的反义片段转入水稻父本品种，使除草剂抗性基因特异的在雌蕊部位表达受到抑制，实现STS14雌蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，获得仅有雌蕊部分对除草剂敏感的父本材料，所述水稻父本品种为RH003，并且所述除草剂为野生型水稻不敏感型除草剂。
2.根据权利要求1所述的水稻杂交育种材料的培育方法，其特征在于，所述除草剂敏感基因为氰氟草酯敏感基因、苯达松敏感基因中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的水稻杂交育种材料的培育方法，其特征在于，所述除草剂为氰氟草酯、苯达松中的任意一种。
4.一种杂交水稻混播制种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培育带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雄蕊中表达的母本材料；培育带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雌蕊中表达的父本材料，其中，所述母本材料培育方法为：克隆Osg6B雄蕊特异启动子并将Osg6B雄蕊特异启动子驱动的氰氟草酯敏感基因的反义片段或苯达松敏感基因的反义片段转入水稻母本品种，使除草剂抗性基因特异的在雄蕊部位表达受到抑制，实现雄蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，得到仅有雄蕊部分对除草剂敏感的母本材料，所述水稻母本品种为NS629S，所述父本材料的培育方法为：克隆STS14雌蕊特异启动子并将STS14雌蕊特异启动子驱动的氰氟草酯敏感基因的反义片段或苯达松敏感基因的反义片段转入水稻父本品种，使除草剂抗性基因特异的在雌蕊部位表达受到抑制，实现STS14雌蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，获得仅有雌蕊部分对除草剂敏感的父本材料，所述水稻父本品种为RH003；
(2)将步骤(1)中培育的水稻母本材料和水稻父本材料进行混播，其中水稻父本材料和水稻母本材料的质量比为1：6；在抽穗前7天喷施除草剂，所述除草剂为野生型水稻不敏感型除草剂氰氟草酯，在该氰氟草酯除草剂中水剂质量分数0.25％并且每亩喷施
50L-60L，从而实现对于母本去雄，对于父本去雌，通过父母本单向交配，获得F1杂交种，进行机械化收获。
5.根据权利要求4所述的杂交水稻混播制种方法，其特征在于，所述除草剂敏感基因为氰氟草酯敏感基因、苯达松敏感基因中的任意一种。
一种水稻杂交育种材料及其培育方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及水稻制种领域，具体地说是一种水稻杂交育种材料及其培育方法与应用。
背景技术
[0002] 杂交水稻为我国乃至全球粮食安全做出了巨大贡献。但现有的水稻杂种优势利用和制种，配组不自由，且种子生产环节多、工序复杂，过多依赖于密集的人力、物力，生产效率低下。特别是近年来，随着我国经济发展，农村青壮年进城务工，农村劳动力短缺，杂交稻种子生产面临严重的挑战。实现杂交水稻机械化混播制种，对降低杂交稻制种成本，提高制种质量和效率，促进杂交水稻的进一步推广应用，都具有重要意义。
[0003] 植物组织特异型启动子是一类特定的DNA片段，具有驱动基因在特定组织、细胞中表达的能力。根据表达特性的不同，组织特异型启动子可以被分为根特异启动子、绿色组织特异启动子、茎特异启动子、雄蕊（花粉）特异启动子、雌蕊特异启动子等类型。优良的组织特异启动子仅在特定的组织或细胞中有驱动能力，而在其他细胞中不具有驱动能力。因此，在植物基因工程中常使用组织特异启动子完成特定细胞内的基因操作而不会对靶细胞以外的部位产生影响。目前的研究已经发现了一些可供基因工程使用的水稻组织特异启动子，对生殖发育相关的过程来说，包括Osg6B启动子、OsMADS58启动子、OsACE1启动子、RTS启动子等雄蕊（花粉）特异表达启动子。来源于水稻的雌蕊（柱头）特异启动子研究较少，也没有应用的报道。但自烟草、油菜和马铃薯中克隆获得的雌蕊特异启动子如STS14启动子、SLG启动子、SRK启动子和SLR1启动子在水稻中仍具有雌蕊特异表达的特点。这些雌/雄蕊特异启动子的强度也足以驱动人工DNA片段造成特定部位的除草剂敏感性。
[0004] 氰氟草酯是一种水稻不敏感的除草剂，又名千金或氰氟禾草灵，主要用于防治禾本科杂草。氰氟草酯是内吸传导性除草剂，由植物的叶片和叶鞘吸收，韧皮部传导，抵制乙酰辅酶A羧化酶活性，干扰并终止脂肪酸代谢合成，抑制植物细胞分裂生长，破坏细胞膜系统等脂结构，最终引起细胞死亡。施用氰氟草酯对环境影响较小，动物实验表明无明显毒性，是水稻生产中常用的优良除草剂。
[0005] 传统制种工艺中存在父母本自交结实种子混杂导致杂交种纯度下降的问题，如两系制种中光温敏不育系在不利的光温条件下育性恢复，自交结实严重影响杂交种纯度。
发明内容
[0006] 为克服现有技术不足，本发明目的在于提供一种水稻杂交育种材料及其培育方法与应用，旨在解决目前生产上制种成本高，步骤繁琐，纯度难以保证等问题。
[0007] 本发明的目的之一提供一种水稻杂交育种材料，该材料中的母本材料（不育系）为带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雄蕊中表达；父本材料（恢复系）为带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雌蕊中表达。
[0008] 本发明的杂交育种材料是使用特异启动子驱动和反义抑制表达的手段获得，具体培育方法通过如下方式实现：
[0009] 将雄蕊特异启动子驱动的除草剂抗性基因反义片段转入水稻母本品种，使除草剂抗性基因特异的在雄蕊部位表达受到抑制，实现雄蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，得到仅有雄蕊部分对除草剂敏感的母本材料；
[0010] 将雌蕊特异启动子驱动的除草剂抗性基因反义片段转入水稻父本品种，使除草剂抗性基因特异的在雌蕊部位表达受到抑制，实现雌蕊特异启动子驱动除草剂敏感基因的目的，获得仅有雌蕊部分对除草剂敏感的父本材料。
[0011] 其中除草剂敏感基因为氰氟草酯敏感基因、苯达松敏感基因等中的任意一种或作物育种中其它可接受的敏感基因；驱动除草剂敏感基因的启动子为STS14雌蕊特异表达启动子、Osg6B雄蕊特异表达启动子中的任意一种或其他可接受的花器官特异的启动子。
[0012] 其中所述水稻母本品种（不育系）为品种NS629S或育种学上可接受的其它品种，父本品种（恢复系）为品种RH003或育种学上可接受的其它品种。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种杂交水稻混播制种方法。
[0014] 该制种方法通过如下方式实现：
[0015] （1）按上述方法培育的带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雄蕊中表达的母本材料和带有除草剂敏感基因，且除草剂敏感基因仅在雌蕊中表达的父本材料进行混播；在抽穗前喷施除草剂，从而实现母本去雄，父本去雌，所获种子均为杂交种，使机械化收获变为可行；
[0016] （2）在隔离田块单独种植上述母本材料（不育系）或父本材料（恢复系），在不施除草剂条件下，繁殖母本（不育系）或父本（恢复系）。
[0017] 其中除草剂为对应的氰氟草酯、苯达松、吡嘧磺隆等。
[0018] 与现有技术相比，本发明优点在于：
[0019] 1、有利于父母本的自由选配。
[0020] 2、通过喷施除草剂，自动实现母本去雄，父本去雌，大大减轻了工作量，提高了生产效率。
[0021] 3、有效地避免了父母本自交结实种子的混杂，特别是是防止了母本自交结实导致的杂交种纯度下降，显著提高杂交种纯度。
[0022] 4、母本（不育系）繁殖简单，只需通过自交即可获得，不需使用保持系，从而简化了繁殖过程，降低了生产成本。
[0023] 5、生产流程简单，易于控制，由于喷施除草剂后父母本均不能自交结实，所有后代都是杂交种，因此便于机械化操作，实现杂交稻混播机械化制种，提高生产效率，降低制种成本，节省人力、物力。
附图说明
[0024] 图1 本发明中父母本培育流程图。
[0025] 图 2 本发明中制种方法实现流程图。
具体实施方式
[0026] 以下结合附图及实施方式，对本发明进行进一步的说明。
[0027] 以下实施例中Osg6B雄蕊特异启动子、STS14雌蕊特异启动子均为公知启动子；除草剂敏感基因也为已知基因；氰氟草酯、苯达松、吡嘧磺隆等为公知除草剂；水稻品种NS629S和RH003均为现有常规品种，由安徽省农业科学院水稻所提供；
[0028] 以下实施例中，若无特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
[0029] 实施例1 水稻杂交育种材料的培育方法
[0030] 以水稻品种NS629S和RH003为例；
[0031] （1）母本材料培育方法
[0032] 克隆Osg6B雄蕊特异启动子并驱动氰氟草酯敏感基因或苯达松敏感基因的反义片段转化水稻品种NS629S，在转基因子代中选择单拷贝插入、农艺性状优良、在且仅在雄蕊部分对氰氟草酯或苯达松敏感度高的植株作为母本材料；
[0033] （2）父本材料培育方法
[0034] 克隆STS14雌蕊特异启动子驱动氰氟草酯敏感基因或苯达松敏感基因的反义片段导入水稻品种RH003，在转基因子代中选择单拷贝插入、农艺性状优良、在且仅在雌蕊部分对氰氟草酯或苯达松敏感度高的植株作为父本材料。
[0035] 实施例2、机械化混播制种(安徽合肥种植)
[0036] （1）将发明获得父母本材料种子混配，其质量比为1：6（父本：母本），于5月10日-5月15日播种，采用常规的水育秧方式培育壮秧。插秧采用久保田SPW-48C自动插秧机，平均行距30cm，株距18cm。大田种植采用常规水肥管理，在抽穗前7天左右喷施相应的除草剂（如氰氟草酯，水剂质量分数0.25%，每亩喷施50L-60L）, 杀雄（母本），去雌（父本）； 通过收割机收获种子。经抽样检测，所测种子均为杂交种，无父母本自交结实混杂。
[0037] 根据除草剂的种类，控制喷施除草剂的浓度、喷施时间和部位，既要做到有效去雄（雌），又要避免产生药害，降低杂交种产量。
[0038] （2）在隔离田块单独种植母本（不育系），在不喷施除草剂条件下，常规水肥管理，病虫害控制的条件下，繁殖母本（不育系）。父本的繁殖类同。
[0039] 应该理解，以上实施例仅用来解释本发明，而并不用于限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明的方法、作物品种、步骤或条件等所作的某些等同的修改或替换、显而易见的改进，均属于本发明的保护范围。
