一种急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株转让专利
申请号 : CN201310148717.6
文献号 : CN103224909B
文献日 : 2014-07-23
发明人 : 不公告发明人
申请人 : 南京凯基生物科技发展有限公司
摘要 :
本发明采用逐步递增5-FU浓度、间歇作用的体外诱导法，建立了急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU。该细胞株已经于2012年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7053。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。
权利要求 :
1.一种急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU，保藏号为CGMCC No.7053。
2.如权利要求1所述的急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU在构建体内外肿瘤耐药模型中的应用。
说明书 :
一种急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株
技术领域
[0001] 本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种人类细胞株，具体涉及一种急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株及其建立方法与应用。
背景技术
[0002] 急性淋巴母细胞白血病是造血系统常见恶性肿瘤，化疗为其主要的治疗手段。虽然新的化疗药物、多药联合的强烈化疗方案的应用以及造血干细胞移植的开展已使急性白血病的预后获得很大改善，但难治、复发仍然是白血病治疗中的现实问题。研究表明，多药耐药是导致多数白血病患者化疗失败的根本原因。多药耐药性（MDR）是指对一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有耐药性。急性淋巴母细胞白血病多药耐药是指白血病细胞在接触一种抗肿瘤药物之后，产生了对多种结构不同、作用机制各异的其它抗肿瘤药物产生耐药性。因此，白血病多药耐药的机制、临床意义及耐药逆转成为肿瘤研究中的热点之一，建立实验需要的白血病耐药细胞模型更具有重要的研究意义。
[0003] 肿瘤细胞耐药株的建立方法通常有两种，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击法。本发明结合两种方法，前期诱导采用大剂量冲击法，后期诱导采用持续诱导法。通过耐药细胞株的建立可以进一步构建体内外肿瘤耐药模型，从而深入研究MDR耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制。通过耐药细胞株的建立的体内外肿瘤耐药模型，可以用于抗肿瘤药物的筛选。目前，尚没有发现关于用于药物筛选用的急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株的报道。
发明内容
[0004] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株及其建立方法。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：
[0006] 本发明采用急性淋巴母细胞白血病细胞株MOLT-4为诱导对象，前期采用大剂量冲击法，后期采用逐步递增5-FU浓度、间歇作用的体外诱导法，建立了急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU。该细胞株已经于2012年12月24日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7053。该耐药株构建体内外肿瘤耐药模型，从而实现疗效更好的抗癌药物的筛选。
[0007] 具体地，本发明涉及的急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU是按照如下方法建立获得：
[0008] （1）人急性淋巴母细胞白血病细胞株MOLT-4用培养液(含10％小牛血清的RPMI-1640培养液)，5％CO2，37℃条件下，培养至70％～90％贴壁率时，弃上清，加入氟尿嘧啶1000ng/ml冲击培养1小时，弃氟尿嘧啶1000ng/ml培养液，空白RPMI-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72-96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70％～90％贴壁率时，再重复用氟尿嘧啶1000ng/ml培养液冲击培养1小时9次，即总共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培养液冲击培养1小时，进一步以此细胞为基础，1000ng/ml持续培养7天。
[0009] （2）重复上述操作，将筛选条件依次改为氟尿嘧啶1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、20000ng/ml培养液。
[0010] 本发明通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、细胞内Rh-123研究及MDR1、MRP和细胞周期的测定，评价急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU的生物学特性，结果成功建立了MOLT-4/FU耐药株，耐药指数为34.609，对依托泊苷（VP16）、顺铂（cDPP）、紫杉醇（Taxol）、长春新碱（YCR）和阿霉素（Adr）产生了明显的交叉耐药性。
附图说明
[0011] 图1为MOLT-4、MOLT-4/FU的细胞生长曲线图。
[0012] 图2为MOLT-4的细胞周期图。
[0013] 图3为MOLT-4/FU的细胞周期图。
[0014] 图4为罗丹明123在MOLT-4细胞内的含量图。
[0015] 图5为罗丹明123在MOLT-4/FU细胞内的含量图。
[0016] 图6为本发明MOLT-4/FU细胞株的显微图。
具体实施方式
[0017] 下面通过实施例进一步说明本发明。本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0018] 实施例1急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU的诱导建立
[0019] 采用逐步递增5-FU浓度、间歇作用的体外诱导法建立急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU，具体步骤如下：
[0020] （1）人急性淋巴母细胞白血病细胞株MOLT-4用培养液(含10％小牛血清的RPMI-1640培养液)，5％CO2，37℃条件下，培养至70％～90％贴壁率时，去上清，加入氟尿嘧啶1000ng/ml冲击培养1小时，去氟尿嘧啶1000ng/ml培养液，空白RPMI-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72-96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70％～90％贴壁率时，再重复用氟尿嘧啶1000ng/ml培养液冲击培养1小时9次，即总共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培养液冲击培养1小时，进一步以此细胞为基础，1000ng/ml持续培养7天。
[0021] （2）重复上述操作，将筛选条件依次改为氟尿嘧啶1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、20000ng/ml培养液。
[0022] （3）敏感细胞逐渐死亡，而耐药细胞继续生长。如此反复诱导、换液、传代，历时约6月，最终得到在20μg／mL5-FU中稳定生长增殖的耐药株，命名为MOLT-4/FU。将该细胞冻存2月后复苏，在不含5-FU的培养液中反复传代2月以上仍基本保持原来的耐药性。
[0023] 实施例2耐药株形态学观察
[0024] 取对数生长期的急性淋巴母细胞白血病多药耐药细胞株MOLT-4/FU，于倒置显微镜下观察细胞形态，结果如图6所示：细胞形态变大，核皱缩。
[0025] 实施例3细胞生长曲线和群体倍增时间的测定
[0026] 细胞消化、计数、配制成浓度为5×103个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液（每孔500个细胞）；6孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中分别培养2d、4d、6d、8d、10d；将96孔板进行MTT染色，每孔加入20μL MTT（5mg/mL），在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；λ=490nm，酶标仪读出每孔的OD值，以时间为横坐标、OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
MOLT-4、MOLT-4/FU的细胞生长曲线见图1。
MOLT-4、MOLT-4/FU的细胞生长曲线见图1。
[0027] 实施例4、PI染色法检测细胞周期
[0028] 用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2×105/ml，接种于6孔培养板，培养24h；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4℃保存的0.01M PBS洗涤细胞3次，70%乙醇冰上固定5min，2000rpm室温离心5min，重悬于冷PBS lml，备用；用流式细胞仪检测，激发波长为488nm，接收波长为575nm。结果显示，MOLT-4G1期、S期、G2期细胞分别为68.05%、14.59%、17.36%，MOLT-4/FU G1期、S期、G2期细胞分别为77.33%、10.69%、11.98%，MOLT-4/FU S期、G2期细胞减少，G1期细胞明显增多，结果见图2、图3。
[0029] 实施例5流式细胞仪检测罗丹明123蓄积
[0030] 用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2×105/ml，接种于6孔培养板，培养24h；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4℃保存的0.01M PBS洗涤细胞3次，收集并6
调整细胞浓度为1×10/ml，每管加入浓度为5ug/ml的罗丹明123500uL，37℃保温30min，
500rpm离心2min，去除培养液,再用新培养液洗去细胞外的罗丹明染料，在37℃保温
10min,使P-gp糖蛋白功能得以发挥，把药物泵出，再用培养液洗1次，放在冰冷的培养液中待检测，流式细胞仪用488nm的激发光，测试细胞荧光强度。结果见图4、图5。MOLT-4细胞荧光强度为5395，MOLT-4/FU细胞荧光强度为113，MOLT-4/FU细胞内的细胞罗丹明123含量比MOLT-4减少。
调整细胞浓度为1×10/ml，每管加入浓度为5ug/ml的罗丹明123500uL，37℃保温30min，
500rpm离心2min，去除培养液,再用新培养液洗去细胞外的罗丹明染料，在37℃保温
10min,使P-gp糖蛋白功能得以发挥，把药物泵出，再用培养液洗1次，放在冰冷的培养液中待检测，流式细胞仪用488nm的激发光，测试细胞荧光强度。结果见图4、图5。MOLT-4细胞荧光强度为5395，MOLT-4/FU细胞荧光强度为113，MOLT-4/FU细胞内的细胞罗丹明123含量比MOLT-4减少。
[0031] 实施例6药物敏感试验
[0032] 细胞消化、计数、配制成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔4
加入100ul细胞悬液（每孔1×10 个细胞）；96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24小时；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值；计数各组别抑制率及药物IC50。
加入100ul细胞悬液（每孔1×10 个细胞）；96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24小时；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值；计数各组别抑制率及药物IC50。
[0033] 试验结果参见表1。根据表1的结果可以看出，MOLT-4/FU对氟尿嘧啶、依托泊苷、顺铂、紫杉醇、长春新碱、阿霉素的耐药指数是34.609、2.107、1.510、1.596、3.162、2.785。
[0034] 表1细胞株对各种化疗药物的IC50和耐药指数
[0035]化疗药物 IC50(ug/ml)MOLT-4 IC50(ug/ml)MOLT-4/FU RI
氟尿嘧啶（5-FU） 0.847 29.314 34.609
依托泊苷（VP16） 0.149 0.314 2.107
顺铂（cDPP） 0.196 0.296 1.510
紫杉醇（Taxol） 0.089 0.142 1.596
长春新碱（YCR） 0.315 0.996 3.162
阿霉素（Adr） 0.214 0.596 2.785
氟尿嘧啶（5-FU） 0.847 29.314 34.609
依托泊苷（VP16） 0.149 0.314 2.107
顺铂（cDPP） 0.196 0.296 1.510
紫杉醇（Taxol） 0.089 0.142 1.596
长春新碱（YCR） 0.315 0.996 3.162
阿霉素（Adr） 0.214 0.596 2.785