一种新的胃癌标志物及其检测方法和应用转让专利
申请号 : CN201310126020.9
文献号 : CN103224922B
文献日 : 2014-12-10
发明人 : 杨娟 , 黄辰 , 宋土生 , 倪磊
申请人 : 西安交通大学
摘要 :
本发明公开了一种新的胃癌标志物及其检测方法。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该分子称为ENOSF1-A，为线粒体烯醇化酶超家族成员1（ENOSF1）的一个片段，其精确分子量为5334.7道尔顿ENOSF1-A在胃癌患者血清检测中呈现特异性的高表达，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）检测ENOSF1-A或ELISA方法测检测ENOSF1的表达水平，可作为胃癌血清的检测方法。
权利要求 :
1.一种胃癌血清多肽标志物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.如权利要求1所述的胃癌血清多肽标志物，其特征在于，其血清当中的检测参数为
0.67～0.78ng/mL。
3.权利要求1所述的胃癌血清多肽标志物在制备胃癌血清诊断药物中的应用。
4.与权利要求1所述的胃癌血清多肽标志物相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备中的应用。
说明书 :
一种新的胃癌标志物及其检测方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于胃癌检测技术领域，涉及一种胃癌血清多肽标志物及其检测方法和应用。
背景技术
[0002] 目前全球每年新增胃癌患者93.4万，其中有近40万在中国内地。患病率和死亡率均超过世界平均水平的两倍。胃癌的发病率随年龄的增加而显著升高，发病的高峰年龄在50岁～80岁。近5年研究发现，中青年人的胃癌发病率迅速增加，19岁至35岁青年人胃癌发病率比30年前翻了一番。胃癌的主要治疗方法有早期切除、二期切除、局部消融、介入治疗及化疗、生物治疗、中药等综合治疗。绝大多数患者在确诊时已属晚期。术后易复发转移，放化疗效果也不理想，预后多不佳。因此，急需探索新的早期诊断和早期治疗的手段。
[0003] 血清诊断被认为是早期诊断癌症最新、最有效的方法。它是通过寻找血液中的肿瘤标志物特别是其中的蛋白标志来评判肿瘤的发生和发展情况，从而实现对肿瘤早期诊断。人类血清中存在大量蛋白和多肽，其中部分蛋白和多肽的存在和缺失以及表达的高低与人类健康程度密切相关，成为疾病诊断的生物标志物。而目前比较公认的肿瘤标记物有CEA、CA19-9、CA125、AFP、PSA等，但其对胃癌的筛查缺乏敏感性和特异性，因此并不能用于胃癌的诊断。
发明内容
[0004] 本发明解决的问题在于提供一种胃癌血清多肽标志物及其检测方法和应用，该分子多肽为线粒体烯醇化酶超家族成员1（ENOSF1）的一个片段，是新的胃癌血清标志物。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0006] 一种胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
[0007] 所述的胃癌血清多肽标志物，其血清当中的检测参数为0.67～0.78ng/mL。
[0008] 所述的胃癌血清多肽标志物作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。
[0009] 与所述的胃癌血清多肽标志物相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备的应用。
[0010] ENOSF1蛋白作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。
[0011] 与ENOSF1蛋白相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备的应用。
[0012] 所述胃癌血清诊断药物为ELISA检测胃癌血清多肽标志物的药物。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0014] 本发明公开了一种胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，该分子称为ENOSF1-A。ENOSF1-A为线粒体烯醇化酶超家族成员1（ENOSF1）的一个片段，其精确分子量为5334.7道尔顿。ENOSF1-A在胃癌患者血清检测中呈现特异性的高表达：而在正常对照人群中血清中表达范围为：0.41～0.54ng/mL；在胃溃疡病人血清中表达范围为:0.45～0.54ng/mL；在胃癌患者血清中表达范围为：0.67～0.78ng/mL，且不同组间的表达具有极显著差异（p<0.001）。
[0015] 鉴于ENOSF1-A在胃癌血清中特异性高表达，那么ENOSF1-A就可以作为胃癌血清诊断标志物；且其母本蛋白ENOSF1在胃癌患者血清中呈现特异性的高表达，因此，ENOSF1可应用于胃癌患者血清诊断：用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）检测ENOSF1-A或ELISA方法测检测ENOSF1的表达水平，可作为胃癌患者检测的方法。而针对ELISA检测胃癌血清诊断，ENOSF1就可以作为ELISA检测药物的新的靶点。
附图说明
[0016] 图1为同一胃癌患者血清样本的三次重复的蛋白多肽图谱(1KDa～10KDa)；
[0017] 图2为蛋白多肽峰m/z:5335在胃癌患者和正常对照组中的蛋白多肽表达差异；
[0018] 图3为胃癌患者血清蛋白多肽混合物的凝胶色谱分离图；
[0019] 图4为ENOSF1-A的MS/MS质谱鉴定图谱；
[0020] 图5为不同组别中ENOSF1蛋白的表达水平。
具体实施方式
[0021] 本发明提供的胃癌血清多肽分子，是一种新筛选的胃癌血清诊断标志物，其表达具有特异性，可应用于胃癌诊断。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0022] 具体的该胃癌血清诊断标志物的筛选为：
[0023] 首先应用液体蛋白芯片技术分离提取胃癌患者和正常对照人群血清蛋白多肽，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术捕获胃癌患者和正常对照人群蛋白多肽图谱，并且采用ClinProTools2.1软件对比分析胃癌患者和正常人群血清蛋白多肽谱图差异，找出组间显著差异表达的蛋白多肽分值，在胃癌患者血清中显著高表达的蛋白多肽峰值中筛出胃癌血清肿瘤标志物。
[0024] 对于所筛选的胃癌血清诊断标志物的验证为：
[0025] 应用HPLC将胃癌患者血清分离的蛋白多肽混合物分为20～30个组分，在对其进行二级质谱的鉴定，并且对鉴定出的蛋白多肽采用酶联免疫法进行血清回归分析，结果血清回归验证证明其在胃癌患者血清中显著高表达，具有特异性，可以作为胃癌患者血清筛查的生物标志物。
[0026] 1、样本的采集与处理：
[0027] 采集自西安交通大学第一附属医院肿瘤外科（2008年12月至2009年6月）的64例（男性32例；女性32例；平均年龄59岁）病理确诊的胃癌患者和32例正常对照人群（男性16例；女性16例；平均年龄56岁）。样本考虑年龄、性别、采集时间、储存条件是否一致、有无基础疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管（黄帽、有隔离胶）采集全血5mL，室温静置30min；室温离心5min(3000g)，将上层血清分装成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反复冻融。
[0028] 1.2试剂与仪器
[0029] 血清蛋白的提取采用德国布鲁克公司的磁珠试剂盒“弱阳离子型”（MB-WCX），以及光谱纯(HPLC级)乙腈、三氟乙酸(德国Merck公司)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(美国Sigma公司)。
[0030] 磁珠分离器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlex III基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)(德国Bruker Daltonics公司)。
[0031] 2、血清蛋白样本的制备
[0032] 运用弱阳离子（MB-WCX）磁珠捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下：
[0033] ①用混匀器完全混匀磁珠悬浮液1min；
[0034] ②加10μL MB-WCX结合液以及10μL MB-WCX磁珠至PCR管，混匀后加5μL血清，混匀至少5次，静置5min；
[0035] ③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁1min，液体清澈后弃上清液；
[0036] ④加100μL MB-WCX冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上清液，重复步骤③、④两次；
[0037] ⑤加5μL MB-WCX洗脱液洗涤贴壁的磁珠，并反复吹打10次，磁珠贴壁2min，将上清液移入干净的离心管；
[0038] ⑥加5μL MB-WCX稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS检测或者冻存于-20℃冰箱24h之内质谱分析。
[0039] 2.2质谱分析
[0040] 将分离收集得到的蛋白样本1μL与10μL的基质α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，取1μL点在Anchorchip靶板上（德国Bruker公司），每个样本分别点三个靶点以作三次重复。待室温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析，采用FlexControl2.0软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶（5次点靶，每次打靶2×30次）之后生成质谱图，获得由不同质核比（m/z）组成的蛋白多肽谱图。采用ClinProTools2.1软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值（P<0.001）。
[0041] 将胃癌患者组和正常对照组血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALDI-TOF-MS分析后，对胃癌患者组和正常对照组的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，在分子量范围1000Da～10000Da共检测到81个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高，三个样本的检测结果如图1所示。
[0042] 采用ClinProTools2.1软件对质谱捕获的胃癌患者和正常对照组的血清蛋白多肽图谱进行分析，将胃癌患者血清多肽谱图与正常人群进行比较分析，共检测到13个具有极显著差异的蛋白多肽峰图（P<0.001），其中13个蛋白多肽峰图在两组间具有极显著差异（P<0.001），其中7个蛋白多肽在胃癌患者中表达显著下调，其余6个蛋白多肽在胃癌患者中表达显著上调，具体如表1所示。
[0043]分子量(质荷比) P值 胃癌平均表达 正常对照平均表达
1866.69↓ <0.000001 2.23±0.19 5.72±0.63
3317.29↓ <0.000001 2.3±0.33 4.95±0.94
1779.65↓ <0.000001 1.73±0.45 3.17±0.85
6631.9↓ <0.000001 3.75±0.65 7.98±1.73
6433.6↓ <0.000001 2.13±0.53 4.3±1.34
1061.38↓ <0.000001 1.63±0.45 6.19±2.28
5335.08↑ <0.000001 10.1±2.33 5.55±1.2
5905.56↑ 0.0002 30.37±4.43 16.26±2.64
5868.57↑ <0.00001 5.26±1.05 3.24±0.48
5808.03↑ 0.000377 2.2±0.85 1.33±0.3
1982↓ 0.000968 1.54±0.34 5.41±1.21
3242.12↑ 0.00021 11.55±2.31 7.14±2.31
1546.02↑ 0.0006 10.38±2.76 5.92±1.63
1866.69↓ <0.000001 2.23±0.19 5.72±0.63
3317.29↓ <0.000001 2.3±0.33 4.95±0.94
1779.65↓ <0.000001 1.73±0.45 3.17±0.85
6631.9↓ <0.000001 3.75±0.65 7.98±1.73
6433.6↓ <0.000001 2.13±0.53 4.3±1.34
1061.38↓ <0.000001 1.63±0.45 6.19±2.28
5335.08↑ <0.000001 10.1±2.33 5.55±1.2
5905.56↑ 0.0002 30.37±4.43 16.26±2.64
5868.57↑ <0.00001 5.26±1.05 3.24±0.48
5808.03↑ 0.000377 2.2±0.85 1.33±0.3
1982↓ 0.000968 1.54±0.34 5.41±1.21
3242.12↑ 0.00021 11.55±2.31 7.14±2.31
1546.02↑ 0.0006 10.38±2.76 5.92±1.63
[0044] 对表1中的胃癌患者血清中特异高表达6个蛋白多肽进行Flex analysis软件分析，结果如图2所示，经过M/Z:5335在胃癌患者（红色，峰值在上的曲线）和正常对照（绿色，峰值在下的曲线）中的表达比较，发现M/Z:5335的蛋白多肽峰图在胃癌患者血清中均显著高表达，因此对其进行序列鉴定并作为标志物的首选进一步鉴定。
[0045] 3、胃癌血清潜在标志物的序列鉴定
[0046] 具体采用液相色谱分离与质谱联用的技术对胃癌血清多肽标志物M/Z:5335进行鉴定，采用Waters公司Nano Acquity UPLC对经磁珠分离收集的质谱上样剩余的血清蛋白多肽进行二维凝胶色谱分离，收集15～30份肽段馏份：在收集液中检测到目的蛋白；再联用Thermo Fisher公司LTQ Orbitrap XL质谱系统对胃癌患者血清中表达上调的蛋白多肽M/Z:5335进行序列鉴定。
[0047] 具体的操作步骤为：
[0048] 3.1样本前处理
[0049] 合并提取后的蛋白样，1300转，10分钟，取上清液，冷冻干燥仪干燥，使终体积在50ul，得到液体A，用安捷伦ziptip萃取柱，浓缩处理液体A。
[0050] 处理方法：①ziptip柱子用100%乙腈吹打5次，活化柱子；②活化好的ziptip在液体1中，反复吹吸10次，尽量避免气泡产生；③50%ACN0.1%TFA水溶液，洗涤3次ziptip柱子；④、ziptip柱子在0.1%TFA中反复吹吸，使样本洗脱，得到洗脱液2；⑤重复以上1-4步，30次；⑥合并30次的洗脱液2，冷冻干燥至10ul，用于质谱鉴定。
[0051] 3.2色谱分离：
[0052] 原始样品加10ul流动相A，转移至进样瓶中，共20ul。
[0053] 一 维 超 高 效 液 相 系 统：Waters 公 司 Nano Aquity UPLC(Waters Corporation,Milford,USA)。色谱柱：
[0054] 捕集柱： C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn
[0055] 分析柱： C18,3.5μm,75μm×150mm,nanoAcquityTMColumn
[0056] 流动相A：5%乙腈，0.1%甲酸的水溶液
[0057] 流动相B:95%乙腈，0.1%甲酸的水溶液；所有溶液均为HPLC级。
[0058] 捕集流速15μl/min，捕集时间3min，分析流速400nl/min；分析时间60min，色谱柱温度35℃；Partial Loop模式进样，进样体积18μl。
[0059] 梯度洗脱程序：
[0060]时间 流速 流动相A% 流动相B%
40.0 0.400 95.0 5.0
41.0 0.400 55.0 45.0
45.0 0.400 20.0 80.0
45.50 0.400 95.0 5.0
60.00 0.400 95.0 5.0
40.0 0.400 95.0 5.0
41.0 0.400 55.0 45.0
45.0 0.400 20.0 80.0
45.50 0.400 95.0 5.0
60.00 0.400 95.0 5.0
[0061] 凝胶色谱分离结果如图3所示。色谱图中横坐标表示样本流出时间，纵坐标代表多肽相对丰度，色谱设定时间为60min，从10min开始收集收集馏分，多肽成分主要在15min后被分离并采用梯度洗脱方式，使洗脱效率提高，设定捕集时间收集馏分：收集15～30份肽段馏份，5.3K Da的目标肽的峰约在45min流出，在第18管收集液中被检测到。
[0062] 3.3LTQ-Orbitrap XL质谱分析：
[0063] 使用Thermo Fisher公司LTQ Obitrap XL质谱分析系统。Nano离子源(Michrom Bioresources,Auburn,USA)，喷雾电压1.8kV；质谱扫描时间60min；实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion),在10秒内对母离子进行2次串级之后加入到排除列表内90秒；扫描范围400-2000m/z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为100000；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子)。检测结果如图4所示。
[0064] 数据分析：使用数据分析软件Bioworks Browser3.3.1SP1进行SequestTM检索。母离子误差设定为100ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切,可变修饰为M(Methionine)甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn>=0.10.
[0065] 检索结果为：m/z:5334.717736066；IPI:IPI00184190.3;Gene Symbol=ENOSF1Isoform2of Mitochondrial enolase superfamily member1;序列为
[0066] D.FRYITDVLTEEDALEILQKGQIGKKEREKQMLAQGYPAYTTSCAWL.G。
[0067] 所分离的M/Z:5335称为ENOSF1-A，为线粒体烯醇化酶超家族成员1（ENOSF1）的一个片段，其精确分子量为5334.7道尔顿，其氨基酸序列
[0068] D.FRYITDVLTEEDALEILQKGQIGKKEREKQMLAQGYPAYTTSCAWL.G（如 SEQ.ID.NO.1 所示）。
[0069] 因此，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）检测ENOSF1-A或ELISA方法测检测ENOSF1的表达水平，可作为胃癌患者检测的方法。
[0070] ENOSF1-A作为ENOSF1的一个片段，提示ENOSF1是与胃癌特异性相关的蛋白，进一步通过ELISA检测来进行验证。
[0071] 4、胃癌血清ENOSF1表达的ELISA血清验证分析：
[0072] 1）血清样本：收集胃癌患者血清32例（男性16例，女性16例；平均年龄56）、胃溃疡患者血清20例（男性；平均年龄52），以及正常对照人群血清32（男性16例；女性16例；平均年龄55.3）例进行ELISA的血清验证分析。所有血清样本均来自西安交通大学一附院，采集时间2010年1月～2010年3月。
[0073] 2）检测方法：采用酶联免疫法（ELISA）检测胃癌患者、胃溃疡患者以及正常对照组的血清ENOSF1的表达水平，试剂盒购自美国R&D公司。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）：往预先包被抗人的ENOSF1蛋白（ENOSF1）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ENOSF1蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。具体实验步骤参照试剂盒说明书，阳性判定标准按照试剂盒说明书界定。
[0074] 3）统计方法：采用GraphPad.Prism.v5.01软件进行单因素方差分析（ANOVA）以及独立样本的T检验。
[0075] 4）结果分析：酶联免疫法分析结果表明ENOSF1在不同检测组中的表达水平为胃癌>胃溃疡>正常对照组，并且三组中两两之间具有显著性差异，具体结果如表2、图5所示。
[0076] 表2：不同组别血清中ENOSF1蛋白的表达水平
[0077]
[0078] 对正常对照人群、胃溃疡人群以及胃癌患者血清中的ENOSF1进行ELISA检测，结果表明ENOSF1表达具有特异性：在正常对照人群中血清中表达范围为：0.41～0.54ng/mL；在胃溃疡病人血清中表达范围为：0.45～0.54ng/mL；在胃癌患者血清中表达范围为：0.67～0.78ng/mL，且不同组间的表达具有极显著差异（p<0.001）。这表明：ENOSF1是与胃癌发生密切相关的蛋白，且在对照组（正常对照及胃溃疡对照组）与胃癌组的表达范围并无交集存在，可以作为初步的胃癌检测指标。
[0079] 因此可以通过ELISA实验对待检血清样本的ENOSF1表达初步判定其是否还有胃癌：胃癌患者（0.67～0.78ng/mL）；正常人群（0.41～0.54ng/mL）；胃溃疡人群（0.45～0.54ng/mL）。