茶树β-葡糖苷酶基因bGlu及其应用转让专利
申请号 : CN201310177923.X
文献号 : CN103224946B
文献日 : 2014-07-02
发明人 : 陆建良 , 范方媛 , 刘阳 , 李娜娜 , 郑新强 , 梁月荣
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明属于基因工程领域，涉及一种新的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu及其编码蛋白，同时还涉及β-葡糖苷酶基因bGlu在促进植物叶片挥发性物质释放上的应用。具体而言：茶树β-葡糖苷酶基因bGlu为SEQ？ID？No：1所示的核苷酸序列。茶树β-葡糖苷酶基因bGlu编码的蛋白质为SEQ？ID？No：2所示的氨基酸序列。该茶树β-葡糖苷酶基因bGlu的用途是：用于构建转基因植物，该转基因植物叶片的挥发性物质得到提高。当植物为茶树时，挥发性物质包括顺-3-己烯醇，芳樟醇，水杨酸甲酯，香叶醇，苯甲醇，反,反-2,4-庚二烯醛。
权利要求 :
1.茶树β-葡糖苷酶基因bGlu，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu编码的蛋白质，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
3. 权利要求1所述的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu的用途，其特征是：用于构建转基因植物，所述转基因植物叶片的挥发性物质得到提高。
4. 根据权利要求3所述的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu 的用途，其特征是：所述植物为茶树，所述挥发性物质包括顺-3-己烯醇，芳樟醇，水杨酸甲酯，香叶醇，苯甲醇，反,反-2,4-庚二烯醛。
5. 根据权利要求3所述的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu 的用途，其特征是：所述植物为烟草，所述挥发性物质包括4-甲基-1-戊醇，6-甲基-5-烯基-2-戊醇，
2-乙基己醇，芳樟醇、橙花醇、3-羟基-β-紫罗兰酮。
说明书 :
茶树β-葡糖苷酶基因bGlu及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu及其编码蛋白，同时还涉及β-葡糖苷酶基因bGlu在促进植物叶片挥发性物质释放上的应用。
背景技术
[0002] β-葡糖苷酶（EC3.2.1.21）属于水解酶类，可催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键，生成葡萄糖及其苷元，其存在于自然界的植物体、酵母、真菌及细菌体内。
[0003] 不同来源的β-葡糖苷酶分子由于其结构和组成不同而差异很大，相对分子量一般在40-300Kd之间，其最适催化温度分布于40-110℃之间。目前研究显示大部分β-葡糖苷酶的等电点（pI）一般在3.5-5.5的酸性范围内，最适酸度可以高于pH7.0，且酸碱耐受性强。葡萄糖是β-葡糖苷酶的典型抑制剂；δ-葡萄糖酸内脂、对氯高汞苯甲酸、异2+ 2+ +
丙基-β-D-硫代葡萄糖苷也可抑制该酶活性；Hg 、Cu 、Ag、SDS、EDTA和脲对大部分不
2+ 2+ +
同来源的该酶的抑制作用较明显；Mn 、Co 和K 对多种来源的β-葡糖苷酶有明显的激活作用。β-葡糖苷酶的催化机制是保留型的酸催化双置换机制（Double Displacement Mechanism），催化反应需要质子供体（Proton Donor）和亲核基团（Nucleophile）。一般认为β-葡糖苷酶有2个活性中心：一个亲核中心和一个酸碱催化中心；其催化过程为：在糖基化底物存在时，酶的亲核中心攻击底物异头碳原子，形成α构象的糖基-酶共价中间体，+
然后由水介导酶底物中间体水解，酶的另一活性中心提供H，糖苷键水解同时β糖基产物形成，酶回复到其初始的质子状态。
丙基-β-D-硫代葡萄糖苷也可抑制该酶活性；Hg 、Cu 、Ag、SDS、EDTA和脲对大部分不
2+ 2+ +
同来源的该酶的抑制作用较明显；Mn 、Co 和K 对多种来源的β-葡糖苷酶有明显的激活作用。β-葡糖苷酶的催化机制是保留型的酸催化双置换机制（Double Displacement Mechanism），催化反应需要质子供体（Proton Donor）和亲核基团（Nucleophile）。一般认为β-葡糖苷酶有2个活性中心：一个亲核中心和一个酸碱催化中心；其催化过程为：在糖基化底物存在时，酶的亲核中心攻击底物异头碳原子，形成α构象的糖基-酶共价中间体，+
然后由水介导酶底物中间体水解，酶的另一活性中心提供H，糖苷键水解同时β糖基产物形成，酶回复到其初始的质子状态。
[0004] 植物组织中β-葡糖苷酶活性的测定方法及条件依据不同植物而不同。葡萄和葡萄汁、葡萄酒中该酶活性的检测方法有两种：一是以对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物的比色法测定β-葡萄糖苷的活性；二是酶提取液中加入香叶酯、橙花脂、香茅酯、2-苯基-乙基-丙酸脂、α-松油脂后，用己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶检测葡萄糖生成量。其中，对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物的比色法被广泛采用。
[0005] 研究显示，β-葡糖苷酶与茶叶、水果、蔬菜等植物的萜类挥发性物质的形成有密切关系，同时该酶还与植物的抗逆性有关。有研究表明，葡萄酒中的挥发性成分主要包括萜烯类、脂类、醛酮类及醇类等，其中含量较高的萜烯类物质的生成主要依赖于β-葡糖苷酶的催化。另有研究显示，茶叶的香气成分大多以糖苷结合态形式存在于茶鲜叶中，β-葡糖苷酶是将茶树鲜叶中香气前体物质糖苷转化为游离态挥发性香气的关键酶，对绿茶、红茶和乌龙茶香气形成有重要作用。有人用β-葡糖苷酶粗品进行夏茶香气改善试验，结果制得的烘青绿茶芳樟醇及香叶醇含量显著提高，另外在龙井茶制作过程中加入外源β-葡糖苷酶处理鲜叶，使处理样品中香叶醇、芳樟醇、橙花叔醇等组分大量释放，可见，合理利用β-葡糖苷酶可有效改善茶叶品质。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的与提高茶叶挥发性物质有关的β-葡糖苷酶的编码基因、编码蛋白及其应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶树β-葡糖苷酶基因bGlu，为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明还同时提供了上述茶树β-葡糖苷酶基因bGlu编码的蛋白质，为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
[0009] 本发明还同时提供了上述茶树β-葡糖苷酶基因bGlu的用途，用于构建转基因植物，转基因植物叶片的挥发性物质得到提高。
[0010] 作为本发明的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu的用途的改进：植物为茶树，挥发性物质包括顺-3-己烯醇，芳樟醇，水杨酸甲酯，香叶醇，苯甲醇，反,反-2,4-庚二烯醛。
[0011] 作为本发明的茶树β-葡糖苷酶基因bGlu的用途的另一种改进：植物为烟草，挥发性物质包括4-甲基-1-戊醇，6-甲基-5-烯基-2-戊醇，2-乙基己醇，芳樟醇、橙花醇、3-羟基-β-紫罗兰酮。
[0012] 本发明的β-葡糖苷酶基因bGlu与促进植物叶片挥发性物质释放有关，该基因是应用消减杂交技术从茶树机械损伤叶与正常叶中筛选分离的差异基因片段，然后采用3’RACE和5’RACE技术获得bGlu全长基因。该基因核苷酸序列全长2229bp，如SEQ ID No：1所示，其中开放阅读框架（ORF）位于5’端第22位至第2037位，共长2016bp，如SEQ ID No：1划线部分所示，编码SEQ ID No: 2的氨基酸序列。经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，SEQ ID No：1所示的核苷酸序列与葡萄（XM_002266434.2）、黄瓜（XM_002514407.1）等相应基因具有80%左右的同源性。经文献检索发现研究显示，黄瓜中β-葡糖苷酶与植株生长速度有关；葡萄中β-葡糖苷酶与果实成熟和环境逆境（脱水等逆境）应激有关。另外，水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）中β-葡糖苷酶与胁迫（盐胁迫、渗透胁迫、干旱、低温胁迫等）诱导有关；棉花（Gossypium hirsutum）中β-葡糖苷酶与病虫侵害有关。同时比对还表明，本发明序列与上述数据库中登录的2个已知的茶树β-葡糖苷酶基因序列（登录号分别为AM285295.2和HQ679938.2）同源性低于
25%，证明本发明序列与已知的茶树β-葡糖苷酶基因不同，是一种新的茶树β-葡糖苷酶基因。研究文献搜索未发现有关上述2已登录的茶树β-葡糖苷酶基因具体用途的报道。
25%，证明本发明序列与已知的茶树β-葡糖苷酶基因不同，是一种新的茶树β-葡糖苷酶基因。研究文献搜索未发现有关上述2已登录的茶树β-葡糖苷酶基因具体用途的报道。
[0013] 本发明提供了上述基因bGlu编码的蛋白质，其具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。该蛋白中含有671个氨基酸，分子量约为73.2kD，等电点为8.7。序列中强碱性氨基酸（Lys, Arg）占10.3%、强酸性氨基酸（Asp, Glu）占8.7%、疏水性氨基酸（Ala, Ile, Leu, Phe, Trp, Val）34%、极性氨基酸（Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr）27.4%、其他氨基酸（Met, Gly, His, Pro）19.5%。蛋白结构中α螺旋占比29.51%，β折叠占比10.73%，以及其他结构占比59.76%。研究表明，该bGlu定位于叶绿体，属于第三类糖基水解酶家族。经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，SEQ ID No：2所示的氨基酸序列与黄瓜、桃和葡萄等具有79%以上的同源性，同时与已知的茶树β-葡糖苷酶（登录号CAK97604（由登录号为AM285295.2的核苷酸序列编码）和ADV40931.2（由登录号为AM285295.2的核苷酸序列编码）氨基酸序列同源性低于15%，证明所获得的是一种新的茶树β-葡糖苷酶bGlu。
[0014] 本发明还提供了茶树叶片机械损伤过程中的bGlu基因表达及其挥发性物质相关性分析。叶片机械损伤处理后不同时间（0h、1h、2h、5h、10h和15h）处理样和对照样的bGlu基因表达结果（图1）显示，茶树新梢bGlu基因随损伤处理后表达强度显著高于未损伤处理的对照，而且随处理时间延长表达呈现先增强后减弱的趋势，在摊放8h时达到表达高峰，随后表达降低，说明机械损伤可诱导该bGlu基因的高表达。新梢机械损伤过程中挥发性物质相关性分析结果如图2~图7所示：机械损伤后新梢挥发性物质相对含量显著高于未经损伤处理的对照，同时随时间延长挥发性物质含量先增高后降低，在处理8h后含量达最高，随后又降低。说明机械损伤有助于提高叶片挥发性物质含量。相关性分析表明，bGlu基因表达强度与挥发性物质含量呈显著正相关关系。可见，新梢挥发性物质含量与bGlu基因表达存在密切关联。
[0015] 本发明提供一种利用该基因提高植物叶片挥发性成分的验证及应用方法。该方法涉及含有所述基因的重组载体以及由所述重组载体转化得到的转基因植物。
[0016] 提高植物叶片挥发性组分含量的验证采用转基因烟草进行鉴定。具体做法包括pZP211-bGlu载体构建、农杆菌介导转化及烟草再生苗获得、转茶树bGlu基因烟草鉴定、阳性植株离体叶片挥发性物质测定。检测发现转基因烟草机械损伤叶片挥发性萜类物质（如芳樟醇、橙花醇等）含量较野生型烟草叶片增加24-44%。
[0017] 本发明的要点在于提供了SEQ ID No：1所示的核苷酸序列和SEQ ID No：2所示的氨基酸序列及其在提高植物叶片挥发性物质上的应用。
附图说明
[0018] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0019] 图1为机械损伤对茶树叶片bGlu基因表达强度的影响对比图；
[0020] bGlu基因表达以肌动蛋白基因Actin作为参比，机械损伤处理组Actin及正常叶对照组Actin表达一致表示已将不同时间的处理组及对照组样品浓度调整一致，保证表达结果具有可比性。机械损伤处理组与正常叶对照组的bGlu基因表达对比显示损伤处理后bGlu基因表达显著增强，表明机械损伤可增强茶树bGlu基因的表达；机械损伤处理组的bGlu基因表达趋势表明bGlu基因表达随损伤时间延长呈现先增强后减弱的趋势，8h时达到表达高峰，随后表达减弱。
[0021] 图2~图7为机械损伤对茶树叶片挥发性物质含量的影响对比图；
[0022] 图2为机械损伤中顺-3-己烯醇相对含量变化图；
[0023] 图3为机械损伤中芳樟醇相对含量变化图；
[0024] 图4为机械损伤中水杨酸甲酯相对含量变化图；
[0025] 图5为机械损伤中香叶醇相对含量变化图；
[0026] 图6为机械损伤中苯甲醇相对含量变化图；
[0027] 图7为机械损伤中反,反-2,4-庚二烯醛相对含量变化图；
[0028] 目标物质含量以GC/MS目标化合物峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比表示，即挥发性物质的相对含量。6种挥发性物质相对含量分析均显示机械损伤处理组的挥发性物质含量高于正常叶对照组，并随损伤时间的延长其含量先增高后降低，在处理8h时达最高，随后又降低。说明机械损伤有助于提高叶片挥发性物质含量。相关性分析表明，bGlu基因表达强度与挥发性物质含量呈显著正相关关系。可见，新梢挥发性物质含量与bGlu基因表达存在密切联系。
[0029] 图8为 pZP211质粒图谱图。
[0030] 图9为转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草的NPTII-PCR凝胶电泳分析图；
[0031] 图中M代表DNA Marker，即DNA分子量标记，箭头所指两条带分别为500bp和400bp标记。S1、S2代表野生烟草对照植株的NPTII-PCR凝胶泳道，该泳道无条带表示野生烟草对照植株基因组中未转入重组茶树β-葡糖苷酶bGlu基因，表示S1和S2野生烟草对照植株；S3、S4和S5代表转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草的NPTII-PCR凝胶泳道；电泳条带显示在400-500bp间，与预计筛选标记基因NPTII的产物大小相符，表示该植株成功转化茶树β-葡糖苷酶bGlu重组基因，即S3、S4和S5为转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草植株。
[0032] 图10为野生型和转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草叶片机械损伤后的挥发性物质含量比较图；
[0033] 目标物质含量以GC/MS目标化合物峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比表示，即挥发性物质的相对含量。比较发现转基因烟草机械损伤叶片挥发性萜类物质（如芳樟醇、橙花醇等）含量较野生型烟草叶片增加24-44%。
具体实施方式
[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，以便于更好地理解，但并不限定本发明。实施例中的试验方法，如无特殊说明均为常规方法。
[0035] 实施例1：茶树β-葡糖苷酶bGlu基因的分离与克隆
[0036] 1）利用抑制性消减杂交（SSH）分离茶树β-葡糖苷酶bGlu基因片段[0037] 以福鼎大白茶茶树品种叶片为材料，用5号昆虫针在处理组芽下第二叶上穿刺6针，对照组为未经穿刺的芽下第二叶，处理6h后对处理组和对照组进行取样冻存。将两组样品分别用液氮研磨后，以TRIzol法（Invitrogen Life Technologies）提取茶树叶片总RNA，并以OligotexTM-dT30 mRNA Purification Kit （宝生物[大连]有限公司）TM纯化mRNA，利用PCR-Slelect cDNA Subtraction Kit（Clontech Laboratories，Lnc., Mountain View, USA）进行抑制性消减杂交，具体做法是：分别取2μg处理组和对照组纯化mRNA，以SMARTScribe 逆转录酶进行cDNA第一链合成，进而以20×Second-Strand酶混合物合成cDNA第二链，获得双链cDNA（ds cDNA）；每组ds cDNA经Rsa 1消化后分成两管，分别与接头Adaptor 1（SEQ ID No: 3所示）和Adaptor 2R（SEQ ID No: 4所示）连接成为tester cDNA，未连接接头的为driver cDNA；第一次杂交时，在driver cDNA中分别加入两份tester cDNA，变性后退火杂交，使原来有丰度差别的tester cDNA均等化，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver cDNA，进行第二次杂交退火，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端；采用巢式PCR进行两轮PCR反应以提高差异基因片段浓度，第一次PCR两端连接有不同接头的双链cDNA片段得以指数扩增，第二次PCR利用巢式引物富集差异表达的基因片段。具体操作参见试剂盒使用说明。将获得的差异表达基因片段插入pMD 18-T载体（宝生物[大连]有限公司），并以M13-F/M13-R引物组合（分别如SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14所示）进行PCR验证，阳性克隆委托Invitrogen公司进行测序。
[0038] 序列分析：
[0039] 将 测 得 序 列 利 用 Vecscreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）除去载体与接头序列得到差异表达的EST片段，经Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）序列同源性比对，获得了一个与陆地棉、黄瓜等的β-葡糖苷酶相似性较高的茶树新EST序列。
[0040] 2）茶树β-葡糖苷酶bGlu基因克隆
[0041] 依据该EST序列，设计特异引物（SEQ ID No: 5-12所示）进行全长基因克隆。取福鼎茶树品种新梢（1芽2叶），液氮研磨后以TRIzol法（Invitrogen Life Technologies）提取茶树叶片总RNA，并以OligotexTM-dT30 mRNA Purification Kit （宝生物[大连]有限公司）纯化mRNA，取1μg纯化mRNA，以TaKaRa 3’RACE Core Set Ver.2.0试剂盒 （宝生物[大连]有限公司）进行3’端基因序列克隆。mRNA经逆转录酶M-MLV合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以特异性引物（SEQ ID No: 5所示）和3’Outer Primer（SEQ ID No: 6所示）进行Outer-PCR反应，取1μl Outer-PCR产物，以特异性引物（SEQ ID No: 7所示）和3’Inner Primer（SEQ ID No: 8所示）进行Inner-PCR反应，预计3’END产物长度为750bp-850bp之间，具体操作参见试剂盒使用说明。另取1μg纯化mRNA，以TaKaRa 5’-Full RACE Kit试剂盒（宝生物[大连]有限公司）进行5’端基因序列克隆，mRNA的5’端经Alkaline Phosphatase（CIAP，碱性磷酸酶）的去磷酸化作用和Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）的“去帽子”反应后，与试剂盒中提供的5’ RACE 接头连接成为Ligated RNA。Ligated RNA经逆转录酶M-MLV合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以特异性引物（SEQ ID No: 9所示）和3’Outer Primer（SEQ ID No: 10所示）进行Outer-PCR反应，取1μl Outer-PCR产物，以特异性引物（SEQ ID No: 11所示）和3’Inner Primer（SEQ ID No: 12所示）进行Inner-PCR反应，预计5’END产物长度为1100bp-1250bp之间，具体操作参见试剂盒使用说明。将上述RACE产物于1.8%琼脂糖凝胶上电泳，并割取目标条带，以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行条带回收，并插入pMD 18-T载体（宝生物[大连]有限公司），并以M13-F/M13-R引物组合（分别如SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14所示）进行PCR验证，阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。
[0042] 将获得的片段序列由SeqMan软件（DNAStar公司）根据重叠区域进行片段拼接，获得bGlu全长序列，该基因长度为为2229bp，具体如SEQ ID No：1所示。经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，该序列与黄瓜、葡萄等具有80%左右的同源性。经EditSeq软件（DNAStar公司）对该序列进行ORF搜索，发现开放阅读框位于SEQ ID No：1序列的第22至第2037位，总长为2016bp，推演得到了包含671个氨基酸的蛋白序列（开放阅读框的最后3个碱基为终止密码子，不编码氨基酸），具体如SEQ ID No：2所示，该序列与黄瓜、桃和葡萄等具有79%以上的同源性，证明所获得的是编码茶β-葡糖苷酶bGlu的全长基因序列。
[0043] 进一步的，经MegAlign软件（DNAStar公司）进行多重序列同源性比对和计算，结果显示，该bGlu核苷酸序列（SEQ ID No：1，即序列表中的No1）与已知的茶树β-葡糖苷酶基因序列（登录号分别为AM285295.2和HQ679938.2）同源性低于25%；同时由开放阅读框ORF推演得到的氨基酸序列（SEQ ID No：2，即序列表中的No2），与已知的茶树β-葡糖苷酶（登录号CAK97604（由登录号为AM285295.2的核苷酸序列编码）和ADV40931.2（由登录号为AM285295.2的核苷酸序列编码）氨基酸序列同源性低于15%，证明所获得的是一种新的茶β-葡糖苷酶bGlu。
[0044] 实施例2：茶树叶片机械损伤过程中的bGlu基因表达及其挥发性物质相关性分析[0045] 1） 茶树叶片机械损伤过程中的bGlu基因表达
[0046] 以福鼎茶树品种叶片为材料，用5号昆虫针在处理组一芽二叶新梢上各刺6针，对照组为正常同嫩度新梢，机械损伤处理后，分别于0h、1h、2h、5h、10h和15h后分别取处理和对照样冻存，同时剩余的处理和对照鲜叶经蒸汽杀青1min，90℃烘干4h后制成干茶样品。取机械损伤处理不同时间的鲜叶液氮研磨后，以TRIzol法（Invitrogen Life Technologies）提取茶树叶片总RNA，以特异性引物SEQ ID No: 15和SEQ ID No: 16进行TMRT-PCR表达验证，产物大小为224bp。RT-PCR采用全式金2×Easy Taq PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）进行，同时以茶树肌动蛋白（Actin）基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923）作为参比（所用特异性引物为SEQ ID No: 17和SEQ ID No:
18）。
18）。
[0047] 15μl反应PCR体系为：ddH2O 4.9μl；2×Easy TaqTM PCR SuperMix 7.5μl；Primer (bGlu引物SEQ ID No：15 & SEQ ID No：16或者Actin引物SEQ ID No: 17和SEQ ID No: 18；10mM each) 0.6μl；cDNA 2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性
45s、50℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环，72℃后延伸10min。产物以2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1所示：茶树新梢bGlu基因随损伤处理后表达强度显著高于未损伤处理的对照，而且随处理时间延长表达呈现先增强后减弱趋势，在摊放8h时达到表达高峰，随后表达降低。说明机械损伤可诱导该bGlu基因的高表达。
45s、50℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环，72℃后延伸10min。产物以2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1所示：茶树新梢bGlu基因随损伤处理后表达强度显著高于未损伤处理的对照，而且随处理时间延长表达呈现先增强后减弱趋势，在摊放8h时达到表达高峰，随后表达降低。说明机械损伤可诱导该bGlu基因的高表达。
[0048] 2） 茶树新梢机械损伤过程中挥发性物质含量分析
[0049] 上述干茶样品经粉碎后过0.45mm筛，香气提取采用连续蒸馏抽提装置（SDE法）。于500ml圆底烧瓶中加入茶叶15g，沸水350ml，同时加入内标物癸酸乙酯100μl（0.2μg/μl）；于250ml烧瓶中加入重蒸乙醚30ml。将上述两烧瓶安装至SDE装置并水浴50℃加热乙醚，套式加热器加热茶汤。茶汤沸腾状态下萃取1h，转移含挥发性物质的乙醚萃取液至玻璃试管中，并用无水硫酸钠脱水过夜，吹氮气浓缩后，得挥发性物质浓缩液。浓缩液利用GC/MS（HP6890/5973，安捷伦公司）分析，分析条件为：HP-INNOWax 30m×0.32mm×0.5μm毛细管柱；载气为高纯He（99.999%），流速为1.0ml/min；程序升温为50℃保持5min，以3℃/min升温速率上升至210℃并保持10min，再以3℃/min上升至230℃；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，电离方式为EI，扫描方式为scan，扫描范围为10-400；进样方式为不分流进样；采样延迟3.5min；进样量2μl。各组分质谱数据进行NIST库检索，对照拟合指数并结合标样和参考有关文献进行定性，同时根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比进行定量。新梢机械损伤过程中挥发性物质相关性分析结果如图2~图7所示：机械损伤后新梢挥发性物质相对含量显著高于未经损伤处理的对照，同时随时间延长挥发性物质含量先增高后降低，在处理8h后含量达最高，随后又降低。说明机械损伤有助于提高叶片挥发性物质含量。相关性分析表明，bGlu基因表达强度与挥发性物质含量呈显著正相关关系。
可见，新梢挥发性物质含量与bGlu基因表达存在密切联系。
可见，新梢挥发性物质含量与bGlu基因表达存在密切联系。
[0050] 实施例3：转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草获得及其鉴定
[0051] 1） RT-PCR扩增bGlu及扩增片段连入T-载体
[0052] 根据SEQ ID No：1所示基因序列设计包含Sac 1和Bam H1酶切位点以及5’AA保护碱基的引物，为SEQ ID No: 19和SEQ ID No: 20（SEQ ID No: 19中划线部分为Sac 1酶切位点，SEQ ID No: 20中划线部分为Bam H1酶切位点）所示。以TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies）提取茶树（福鼎大白茶）新梢总RNA，cDNA第一链合成采用TaKaRa stPrimeScript II 1 Strand cDNA Synthesis Kit（宝生物[大连]有限公司）进行。PCR反应以TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（宝生物[大连]有限公司）进行。
[0053] 50μl反应体系为： ddH2O 30.5μl；TaKaRa Ex Taq Hot Start（5 U/μl）0.5μl；2+
Primer (SEQ ID No：15 & SEQ ID No：16; 10mM each) 4μl；10×Ex Taq Buffer（MgPlus）5μl ；dNTP Mixture（2.5mM each）8μl ；cDNA 2μl。
Primer (SEQ ID No：15 & SEQ ID No：16; 10mM each) 4μl；10×Ex Taq Buffer（MgPlus）5μl ；dNTP Mixture（2.5mM each）8μl ；cDNA 2μl。
[0054] 反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，35循环；72℃后延伸10min。
[0055] 产物以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0056] 2） pZP211-bGlu载体构建
[0057] 上述电泳茶树β-葡糖苷酶bGlu目标条带割取后，以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行条带回收，并插入pMD 18-T载体（宝生物[大连]有限公司），阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。测序确认序列正确后得到pMD18-Glu质粒。pMD18-bGlu质粒和pZP211载体（如图8）同时经限制性酶Sac 1（宝生物[大连]有限公司）和 Bam H1（宝生物[大连]有限公司）双酶切及1.0%琼脂糖凝胶电泳，具体操作参见限制酶使用说明。割取目的条带并以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行回收，两者经DNA Ligation Kit Ver.2.1（宝生物[大连]有限公司）连接后获得重组质粒pZP211-bGlu，具体操作参见试剂盒说明。阳性重组质粒利用冻融交替法导入发给农杆菌LBA4404，获得侵染用菌株。
[0058] 3） 农杆菌介导法转化烟草及再生苗的获得
[0059] 将上述侵染用发根农杆菌LBA4404在添加100mg/L利福平的YMB固体培养基上28℃黑暗培养活化两次，每次12h。挑选单菌落接种于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮（AS）的液体YMB培养基中，28℃、250r/min振荡培养至OD600为0.5-0.8用于侵染。将烟草W38无菌苗叶片在MS固体培养基上预培养3天，置于发根农杆菌菌液中侵染10-30min后，无菌滤纸吸干多余的菌液，转移与含100mmol/L AS的YMB培养基（共培养培养基）中，黑暗共培养2天，将侵染后的叶片用无菌水冲洗3-4次，1000mg/L头孢噻肟钠浸泡20min以灭活农杆菌，无菌滤纸吸干材料表面水分，转移与含500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基（抑菌培养基）中25℃黑暗培养。
[0060] 4） 转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草鉴定
[0061] 转化烟草得到完整植株后，取新鲜幼嫩叶片用CTAB法提取烟草基因组DNA，用筛选标记基因NPTII的特异引物SEQ ID No: 21和SEQ ID No: 22进行PCR检测。
[0062] 15μl反应体系为：ddH2O 4.9μl；2×Easy TaqTM PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）7.5μl；引物对(SEQ ID No：21 & SEQ ID No：22; 10mM each) 0.6μl；cDNA2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s、68℃退火30s、72℃延伸60s、35个循环，72℃后延伸10min。产物以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的条带大约为476bp（图9）。检测得到的阳性植株进行扩繁。
[0063] 实施例4：转基因烟草叶片机械损伤后挥发性物质测定
[0064] 采取长势良好的转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草植株叶片，用5号昆虫针在叶片上各刺3-5针（根据叶片大小略有不同），6h后采用顶空固相微萃取收集烟草叶片挥发性物质，并以GC/MS（HP6890/5973，安捷伦公司）分析，以相同损伤处理的野生型株系W38叶片为对照，采用相同方法进行挥发性物质收集和分析。分析条件为：HP-INNOWax30m×0.32mm×0.5μm毛细管柱；载气为高纯He（99.999%），流速为1.0ml/min；程序升温为50℃保持5min，以3℃/min升温速率上升至210℃并保持10min，再以3℃/min上升至
230℃；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，电离方式为EI，扫描方式为scan，扫描范围为10-400；进样方式为不分流进样；采样延迟3.5min；进样量2μl。各组分质谱数据进行NIST库检索，对照拟合指数并结合标样和参考有关文献进行定性，同时根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比进行定量，结果如图10所示：转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草植株叶片经损伤处理后，挥发性物质含量较对照分别提高了24-44%。
230℃；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，电离方式为EI，扫描方式为scan，扫描范围为10-400；进样方式为不分流进样；采样延迟3.5min；进样量2μl。各组分质谱数据进行NIST库检索，对照拟合指数并结合标样和参考有关文献进行定性，同时根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比进行定量，结果如图10所示：转茶树β-葡糖苷酶bGlu基因烟草植株叶片经损伤处理后，挥发性物质含量较对照分别提高了24-44%。
[0065] 实施例5：与其它β-葡糖苷酶转基因烟草挥发性物质促进效果比较[0066] 按照实施例3的方法将已公开的登录号为AM285295.2和HQ679938.2茶树β-葡糖苷酶基因、以及登录号为XM_002266434.2 葡萄β-葡糖苷酶基因和登录号为XM_002514407.1黄瓜β-葡糖苷酶基因，通过转化载体构建、农杆菌介导法转化和再生苗鉴定等步骤获得这些β-葡糖苷酶转基因烟草。并按照实施例4所述方法，对多种来源的转β-葡糖苷酶基因烟草进行挥发性物质测定，结果显示，转上述来源β-葡糖苷酶基因（登录号分别为AM285295.2、HQ679938.2、XM_002266434.2、XM_002514407.1）的烟草经损伤处理后，挥发性物质含量均较转本发明bGlu基因烟草低20-60%。
[0067] 上文中所用的引物等具体如下：
[0068] SEQ ID No：3 5’- CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT[0069] SEQ ID No：4 5’- CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT[0070] SEQ ID No：5 5’- GAAGCCACGCTGACAATC
[0071] SEQ ID No：6 5’- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
[0072] SEQ ID No：7 5’- TACGTGGCAGGGACTTAGTG
[0073] SEQ ID No：8 5’- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
[0074] SEQ ID No：9 5’- CCCATTGTGAACTTCACTCG
[0075] SEQ ID No：10 5’- CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
[0076] SEQ ID No：11 5’- GGCTCATGGGAATGAAGTTG
[0077] SEQ ID No：12 5’- CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
[0078] SEQ ID No：13 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC
[0079] SEQ ID No：14 5’- CAGGAAACAGCTATGAC
[0080] SEQ ID No：15 5’- ATGAGCCGAATTGATGATG
[0081] SEQ ID No：16 5’- AGTATTTTCGATGCCTTCTTAG
[0082] SEQ ID No：17 5’- AAAGCAAACAGAGAAAAGATGACC
[0083] SEQ ID No：18 5’- AGCACCAATAGTAATGACCTGACC
[0084] SEQ ID No：19 5’- AAGAGCTCATGATCAGTCGAT
[0085] SEQ ID No：20 5’- AAGGATCCGGTGGCCTTGGCA
[0086] SEQ ID No：21 5’- TGTTCCGGCTGTCAGCG
[0087] SEQ ID No：22 5’- TCGGCAAGCAGGCATCG 。
[0088] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。