本发明公开了一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法和所用发酵培养基。采用控氧发酵培养法培养甲基营养菌，发酵培养基中含有的碳源为甲醇、氮源为硫酸铵，在发酵过程中分阶段控制溶解氧水平为饱和溶氧的30-50%，通过补料控制pH在5.5-6.0，通过pH-氮源联控技术实现补料，在7.5L发酵罐中培养6天最终细胞密度（OD600）超过10，PQQ产量达到了2g/L，PQQ生产强度为333.33mg/L/天，本发明操作简单，便于实现自动控制和连续发酵，为使用甲基营养菌工业化生产吡咯喹啉醌奠定了坚实的基础。
1.一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）活化菌种：将原始菌种甲基营养菌Methylovorus sp. MP688接种到固体培养基中，在适合原始菌种生长的条件下进行培养，得活化的菌种；步骤（1）中所述培养温度为30℃，培养时间为2天；所述固体培养基为在基本培养基的基础上添加琼脂粉和碳源甲醇，所述琼脂粉在所述固定培养基中的浓度为1g/L，所述甲醇在所述固定培养基中的浓度为10 g/L，其中，所述基本培养基的组分及配比如下：基本培养基以1 L计
MgSO4·7H2O 0.4-1 g，(NH4)2SO4 3-5 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4·12H2O 3 g，柠檬酸铁 30 mg，
CaCl2 30 mg，MnCl2·4H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O 5 mg，CuSO4·5H2O 0.5 mg，叶酸 0.02 mg，生物素 0.02 mg，核黄素 0.05 mg，烟酸 0.05 mg，硫辛酸 0.05 mg；
（2）种子液的培养：步骤（1）所得活化好的菌种挑单菌落，接种到5 ml液体培养基中
30℃摇床振荡，转速为200转/分，培养2~3天，然后取1~2 ml前述菌液接种至含有100 ml液体培养基的三角瓶中在相同条件下继续扩繁培养，直至得到菌株细胞密度（OD600）为
1.2~1.5的种子液；其中，所述液体培养基为在基本培养基的基础上添加碳源甲醇，所述甲醇在液体培养基中的浓度为10g/L。
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）所得种子培养液按比例接种到含有发酵培养基的发酵罐中；发酵培养过程中温度恒定，同时，发酵罐的pH、溶解氧和搅拌转速采用两阶段控制策略；氮源补料采用pH-氮源联控方式进行，碳源补料采用间歇补料方式进行；步骤（3）中所述发酵温度为30~35℃，发酵时间为6~8天;步骤（3）中所述种子培养液与发酵培养基的体积比为1:50~1:10；所述的发酵培养基，具体组成和配比如下：发酵培养基以1 L计
MgSO4·7H2O 0.4 g，(NH4)2SO4 3 g，KH2PO4 2.8 g，Na2HPO4·12H2O 6 g，柠檬酸铁 60 mg，
CaCl2 0.05 mg，MnCl2·4H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O 5 mg，CuSO4·5H2O 0.5 mg，叶酸 0.02 mg；
（31）初期：接种之后发酵初期通气量控制在0.02~5 vvm，不控制溶解氧，转速控制在
200~300 rpm，初始pH值调整为6.5-7.0后，pH值不再控制；
（32）后期：随着细菌生长，pH值下降，待pH值下降到5.5~6.0时，通过泵反馈流加氨水或者硫酸铵将pH控制在此水平；
待发酵罐中的溶解氧下降到饱和溶氧的30%时，通过溶解氧与转速和通气量关联的策略将溶解氧控制在30%~50%的水平，具体为：优先调整转速，所述转速范围为200~800 rpm，当转速达到上限800 rpm时，调整通气量，所述通气量范围是0.2~5 vvm;步骤（3）中所述碳源为甲醇，所述氮源为硫酸铵、氨水中的一种或两种；所述碳源初始浓度为7.5~15 g/L，氮源初始浓度7.5~15 g/L；发酵过程中碳源的总浓度控制在15 g/L以内，硫酸铵的总浓度控制在3 g/L以内；
所述pH-氮源联控方式为当发酵液pH值随着细菌生长下降到6.0时启动氮源补料程序，通过流加方式进行氮源补料，通过流加补料液进行氮源补料，所述的氮源补料液为
在线监测细菌的生长速率和氮源补料量曲线，一旦细菌的生长速率或者氮源补料速率与上一时间段相比有降低，通过间歇补料方式加入碳源甲醇，补料量为每升发酵液加入
5~15 g甲醇；所述甲醇为工业甲醇或分析纯;（4）收获发酵液，得吡咯喹啉醌。
一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法及所用的发酵培养
基
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物发酵技术研究领域，具体的涉及一种微生物发酵高效生产吡咯喹啉醌（PQQ）的方法及所用的发酵培养基。
背景技术
[0002] 吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是第三类氧化还原酶的辅酶，也是被称为一种新的维生素，具有多种生理功能，在防治肝损伤和肝中毒、促进神经生长因子生成、调节自由基水平，抗辐射损伤、心血管疾病和糖尿病等方面有重要医用价值。
[0003] 目前PQQ主要是化学合成法，微生物合成具有清洁低碳、温和可控、成本低廉等优势，是一种极具潜力的生产方式。影响微生物发酵生产PQQ大规模应用的主要因素有：（1）适合于工业生产的微生物不多；（2）文献报道的PQQ生产菌株生产周期长，产率不高；（3）PQQ作为一种辅酶，并不是微生物的次级代谢产物，其合成调控受培养条件和代谢调控的严格制约。
发明内容
[0004] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种能使PQQ合成量增加的培养方法和发酵培养基，摸索一条行之有效的微生物发酵生产PQQ的控制方法，实现利用甲基营养菌高效生产PQQ的目的。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种发酵制备所述PQQ的发酵培养基。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明提供了一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其包括如下步骤：
[0007] （1）活化菌种：将原始菌种甲基营养菌Methylovorus sp.MP688接种到固体培养基中，在适合原始菌种生长的条件下进行培养，得活化的菌种；
[0008] （2）种子液的培养：将步骤（1）所得活化好的菌种接种到液体培养基中，在适合菌体生长的条件下进行培养，得种子培养液；
[0009] （3）发酵罐发酵：将步骤（2）所得种子培养液按比例接种到含有发酵培养基的发酵罐中；发酵培养过程中温度恒定，同时，发酵罐的pH、溶解氧和搅拌转速采用两阶段控制策略；氮源补料采用pH-氮源联控方式进行，碳源补料采用间歇补料方式进行；
[0010] （4）收获发酵液，得吡咯喹啉醌。
[0011] 进一步地，本发明提供了以下优选的技术方案：
[0012] 其中，所述甲基营养菌Methylovorus sp.MP688，已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.4096。（详细信息请参见中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所申请的专利号为201010548511.9的发明专利）。
[0013] 优选的，步骤（1）中所述培养温度为30～35℃，培养时间为2～3天；所述固体培养基为在基本培养基的基础上添加琼脂粉和碳源甲醇，所述琼脂粉在所述固定培养基中的浓度为1～2g/L，所述甲醇在所述固定培养基中的浓度为7.5～15g/L，其中，所述基本培养基的组分及配比如下：
[0014] 基本培养基（以1L计）
[0015] MgSO4·7H2O 0.4-1g，
[0016] (NH4)2SO4 3-5g，
[0017] KH2PO4 1.4g，
[0018] Na2HPO4·12H2O 3g，
[0019] 柠檬酸铁 10-30mg，
[0020] CaCl2 10-30mg，
[0021] MnCl2·4H2O 5-10mg，
[0022] ZnSO4·7H2O 5-10mg，
[0023] CuSO4·5H2O 0.5-2mg，
[0024] 叶酸 0.02-0.05mg，
[0025] 生物素 0.02-0.05mg，
[0026] 核黄素 0.02-0.05mg，
[0027] 烟酸 0.02-0.05mg，
[0028] 硫辛酸 0.02-0.05mg。
[0029] 优选的，步骤（2）具体步骤为：步骤（1）所得活化好的菌种挑单菌落，接种到5ml液体培养基中30～35℃摇床振荡，转速为200～250转/分，培养2～3天，然后取1～2ml前述菌液接种至含有100ml液体培养基的三角瓶中在相同条件下继续扩繁培养，直至得到菌株细胞密度（OD600）为1.2～1.5的种子液；其中，所述液体培养基为在基本培养基的基础上添加碳源甲醇，所述甲醇在液体培养基中的浓度为7.5～15g/L。其中，所述基本培养基的组分及配比如下：
[0030] 基本培养基（以1L计）
[0031] MgSO4·7H2O 0.4-1g，
[0032] (NH4)2SO4 3-5g，
[0033] KH2PO4 1.4g，
[0034] Na2HPO4·12H2O 3g，
[0035] 柠檬酸铁 10-30mg，
[0036] CaCl2 10-30mg，
[0037] MnCl2·4H2O 5-10mg，
[0038] ZnSO4·7H2O 5-10mg，
[0039] CuSO4·5H2O 0.5-2mg，
[0040] 叶酸 0.02-0.05mg，
[0041] 生物素 0.02-0.05mg，
[0042] 核黄素 0.02-0.05mg，
[0043] 烟酸 0.02-0.05mg，
[0044] 硫辛酸 0.02-0.05mg。
[0045] 优选的，步骤（3）中所述种子培养液与发酵培养基的体积比为1:50～1:10；所述的发酵培养基，具体组成和配比如下：
[0046] 发酵培养基（以1L计）
[0047] MgSO4·7H2O 0.4-1g，
[0048] (NH4)2SO4 3-5g，
[0049] KH2PO4 2.1-2.8g，
[0050] Na2HPO4·12H2O 4.5-6g，
[0051] 柠檬酸铁 30-80mg，
[0052] CaCl2 0.05-0.25mg，
[0053] MnCl2·4H2O 5-10mg，
[0054] ZnSO4·7H2O 5-10mg，
[0055] CuSO4·5H2O 0.5-1mg，
[0056] 叶酸 0.02-0.05mg。
[0057] 优选的，步骤（3）中所述发酵温度为30～35℃，发酵时间为6～8天。
[0058] 优选的，所述的两阶段控制策略的具体为：
[0059] （1）初期：接种之后发酵初期通气量控制在0.02～5vvm，不控制溶解氧，转速控制在200～300rpm，初始pH值调整为6.5-7.0后，pH值不再控制；
[0060] （2）后期：随着细菌生长，pH值下降，待pH值下降到5.5～6.0时，通过泵反馈流加氨水将pH控制在此水平；
[0061] 待发酵罐中的溶解氧下降到饱和溶氧的30%时，通过溶解氧与转速和通气量关联的策略将溶解氧控制在30%～50%的水平，具体为：优先调整转速，所述转速范围为200～800rpm，当转速达到上限800rpm时，调整通气量，所述通气量范围是0.2～5vvm。
[0062] 优选的，步骤（3）中所述碳源为甲醇，所述氮源为硫酸铵、氨水中的一种或两种；所述碳源初始浓度为7.5～15g/L，氮源初始浓度7.5～15g/L；发酵过程中碳源的总浓度控制在15g/L以内，硫酸铵的总浓度控制在3g/L以内；
[0063] 所述pH-氮源联控方式为当发酵液pH值随着细菌生长下降到6.0时启动氮源补料程序，通过流加方式进行氮源补料，所述的氮源补料液为0.10～0.25g/ml的氨水或硫酸铵；
[0064] 在线监测细菌的生长速率和氮源补料量曲线，一旦细菌的生长速率或者氮源补料速率与上一时间段相比有降低，通过间歇补料方式加入碳源甲醇，补料量为每升发酵液加入5～15g甲醇；所述甲醇为工业甲醇或分析纯。
[0065] 优选的，步骤（4）的发酵液按照武汉大学赵永芳等专利《吡咯喹啉醌的提取方法》制备吡咯喹啉醌产品（专利授权号为CN1138776C）。吡咯喹啉醌含量的测定参照Geiger O.等人1987年的文献Enzymatic determination of pyrroloquinoline quinone using crude membranes from Escherichia coli。
[0066] 进一步地，本发明提供了一种吡咯喹啉醌，其是由上述方法生产得到。
[0067] 更进一步地，本发明提供了一种发酵培养基，具体组成和配比如下：
[0068] 发酵培养基（以1L计）
[0069] MgSO4·7H2O 0.4-1g，
[0070] (NH4)2SO4 3-5g，
[0071] KH2PO4 2.1-2.8g，
[0072] Na2HPO4·12H2O 4.5-6g，
[0073] 柠檬酸铁 30-80mg，
[0074] CaCl2 0.05-0.25mg，
[0075] MnCl2·4H2O 5-10mg，
[0076] ZnSO4·7H2O 5-10mg，
[0077] CuSO4·5H2O 0.5-1mg，
[0078] 叶酸 0.02-0.05mg。
[0079] 更进一步地，本发明提供了上述发酵培养基在生产吡咯喹啉醌中的应用。
[0080] 本发明的有益效果如下：
[0081] 本发明采用发酵培养基，有利于甲基营养菌快速高效的合成吡咯喹啉醌，组分为无机盐，无复杂的有机物，因此成本低廉，适合工业放大生产。
[0082] 本发明发酵培养过程中温度恒定，发酵罐的pH、溶解氧和搅拌转速采用两阶段控制策略；通过限制溶解氧（30-50%）和控制弱酸性环境（pH5.5-6.0），将细菌生长速率维持在较低水平（低于2OD600/24小时），来协调细菌生长与PQQ的合成两个过程，使碳源代谢流更多的流向合成PQQ的途径，从而得到高产量的PQQ；同时，通过pH-氮源联控方式进行氮源补料，通过间歇补料方式进行碳源补料，使发酵过程最优。本发明在7.5L自动发酵罐中培养6天最终细胞密度（OD600）超过10，PQQ产量达到了2g/L，PQQ生产强度为333.33mg/L/天，产量和生产强度超过已有文献报道的最高值，并缩短了发酵周期；同时，本发明操作简单，便于实现自动控制和连续发酵，为使用甲基营养菌工业化生产PQQ奠定了坚实的基础。
附图说明
[0083] 图1本发明发酵生产PQQ的结果。
[0084] 图中：●表示细菌生长曲线，■表示PQQ合成曲线。
具体实施方式
[0085] 下面结合附图及其具体实施方式详细介绍本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实例，应包含权利要求书中的全部内容。
[0086] 以下实施例中所使用的药品，购自国药集团化学试剂有限公司，药品级别为分析纯；实施例中使用的仪器均为生物实验室常规仪器，所用的发酵罐型号为BIOSTAR Bplus,Germany。
[0087] 实施例1甲基营养菌Methylovorus sp.MP688的活化
[0088] Methylovorus sp.MP688保藏于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC4096，是一株PQQ产量达到生产水平的菌株。用原始菌株（甘油保藏或者冻干状态）在固体培养基平板上划线，30℃培养2天；挑单菌落，接种到5ml液体培养基中，30℃，摇床200转/分，培养48小时作为活化种子。所述固体培养基为在基本培养基的基础上添加琼脂粉和碳源甲醇，所述琼脂粉在所述固定培养基中的浓度为1g/L；所述液体培养基为在基本培养基的基础上添加碳源甲醇；其中所述甲醇在固定培养基或液体培养基中的浓度为10g/L；所述基本培养基的组分及配比如下：
[0089] 基本培养基（以1L计）
[0090] MgSO4·7H2O 0.4-1g，
[0091] (NH4)2SO4 3-5g，
[0092] KH2PO4 1.4g，
[0093] Na2HPO4·12H2O3g，
[0094] 柠檬酸铁 30mg，
[0095] CaCl2 30mg，
[0096] MnCl2·4H2O 5mg，
[0097] ZnSO4·7H2O 5mg，
[0098] CuSO4·5H2O 0.5mg，
[0099] 叶酸 0.02mg，
[0100] 生物素 0.02mg，
[0101] 核黄素 0.05mg，
[0102] 烟酸 0.05mg，
[0103] 硫辛酸 0.05mg。
[0104] 实施例2种子液的制备
[0105] 取实施例1得到的菌液2ml，并接种至含有100ml液体培养基的三角瓶，30℃，摇床200转/分，培养36小时，同样条件下活化1-2次，使最终细密度（OD600）为1.2～1.5，制成种子液。所用液体培养基同实施例1。
[0106] 实施例3在5L全自动发酵罐中进行PQQ生产实例A
[0107] 用实施例2的种子液，按照1:20的比例接种到7.5L自动发酵罐中。接种后发酵初期通气量控制在1vvm，搅拌转速控制在300rpm，温度控制在0℃，初始pH值设为7.0；所述碳源甲醇初始浓度为7.5g/L，氮源硫酸铵初浓度15g/L；所述的发酵培养基，具体组成和配比如下：
[0108] 发酵培养基（以1L计）
[0109] MgSO4·7H2O 0.4g，
[0110] (NH4)2SO4 3g，
[0111] KH2PO4 2.8g，
[0112] Na2HPO4·12H2O 6g，
[0113] 柠檬酸铁 60mg，
[0114] CaCl2 0.05mg，
[0115] MnCl2·4H2O 5mg，
[0116] ZnSO4·7H2O 5mg，
[0117] CuSO4·5H2O 0.5mg，
[0118] 叶酸 0.02mg。
[0119] 随着细菌生长，pH值下降，待下降到6.0时，通过泵反馈流加氨水将pH控制在此水平；待发酵罐中的溶解氧下降到饱和溶氧的40%时，通过溶解氧与搅拌转速和通气量关联的策略将溶解氧控制在40%的水平，搅拌转速调整优先（800rpm上限），转速达到上限时调整通气量，通气量最大设置为5vvm。采用pH-氮源联控技术实现氮源氨水的补料，补料液浓度为0.15g/ml；在线监测细菌的生长速率，当细菌12小时内的生长速率曲线与前12小时生长速率降低时，通过间歇补料方式加入碳源甲醇，补料量为每升发酵液加入10g甲醇；所述的碳源补料液，具体为工业甲醇或分析纯。每12小时记录和计算细胞密度（OD600）和PQQ产量。在这种发酵条件下，经过6天的培养，最终细胞密度（OD600）可达到或超过10，PQQ产量达到或超过2g/L，PQQ生产强度至少为333.33mg/L/天，具体结果可参见图1。
[0120] 实施例4在5L全自动发酵罐中进行PQQ生产实例B
[0121] 用实施例2的种子液和实施例3中的发酵培养基组成和配比，按照1:50的比例接种到7.5L自动发酵罐中。接种之后发酵初期通气量控制在1vvm，搅拌转速控制在300rpm，温度控制在30℃，初始pH值设为6.5后不再控制；所述碳源甲醇初始浓度为7.5g/L，氮源硫酸铵初始浓度15g/L。
[0122] 随着细菌生长，pH值下降，待下降到5.8时，通过泵反馈流加氨水将pH控制在此水平；待发酵罐中的溶解氧下降到饱和溶氧的30%时，通过溶解氧与搅拌转速和通气量关联的策略将溶解氧控制在30%的水平，搅拌转速调整优先（800rpm上限），转速达到上限时调整通气量，通气量最大设置为5vvm。采用pH-氮源联控技术实现氮源氨水的补料，补料液浓度为0.15g/ml；在线监测细菌的生长速率，当细菌12小时内的生长速率曲线与前12小时生长速率降低时，通过间歇补料方式加入碳源甲醇，补料量为每升发酵液加入10g甲醇；所述的碳源补料液，具体为工业甲醇或分析纯。每12小时记录和计算细胞密度（OD600）和PQQ产量。在这种发酵条件下，经过6天的培养，最终细胞密度（OD600）可达到或超过10，PQQ产量达到或超过1g/L，PQQ生产强度至少为166.67mg/L/天。
[0123] 实施例5在5L全自动发酵罐中进行PQQ生产实例C
[0124] 用实施例2的种子液和实施例3中的发酵过程的全部参数控制，改变所用发酵培养基，具体组成和配比如下：
[0125] MgSO4·7H2O 1g，
[0126] (NH4)2SO4 5g，
[0127] KH2PO4 2.1g，
[0128] Na2HPO4·12H2O 4.5g，
[0129] 柠檬酸铁 80mg，
[0130] CaCl2 0.1mg，
[0131] MnCl2·4H2O 5mg，
[0132] ZnSO4·7H2O 5mg，
[0133] CuSO4·5H2O 0.5mg，
[0134] 叶酸 0.05mg。
[0135] 在这种发酵条件下，经过6天的培养，最终细胞密度（OD600）可达到或超过10，PQQ产量达到或超过1.5g/L，PQQ生产强度至少为250mg/L/天。
[0136] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
