一种高品质低分子达特安瑞的制备方法

摘要

本发明公开了一种高品质低分子达特安瑞(Dalteparin Sodium)的制备方法，属于生物医药领域。该方法采用粗品肝素钠为原料，以复合酶解和改良的亚硝酸盐降解法为基础，经酶解、氧化、超滤除杂、醇沉除杂、降解、还原、碱氧纯化、超滤精制、冻干等步骤制得具有特定平均分子量(5600-6400)的低分子达特安瑞精品，具有制备工艺简单、产品的稳定性和抗血栓活性好等特点。

权利要求

1.一种高品质低分子达特安瑞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)酶解：向粗品肝素钠中加入10～15倍量水，溶解得原料液，调节原料液温度至

35℃～39℃，加入复合酶，搅拌反应10～15小时，去沉淀，上清液过滤，收集滤液；所述复合酶包括木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II及脱氧核糖核酸酶I，木瓜蛋白酶的用量为肝素钠粗品重量的1％～2％，核糖核酸酶II的用量为肝素钠粗品重量的0.5％～1％，脱氧核糖核酸酶I的用量为肝素钠粗品重量的0.5％～1％；

2)氧化：控制步骤1)所得滤液温度至40℃～50℃，调整滤液pH值至9～11，加入

0.1％～0.5％滤液体积的过氧化氢，搅拌反应6～8小时，得纯化液；

3)超滤除杂：采用截留分子量为3,000Da～5,000Da的超滤膜对步骤2)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤5～10小时，收集截留液；

4)醇沉除杂：截留液醇沉除杂，沉淀物干燥称重；

5)降解：向步骤4)所得沉淀物中加7～8倍量的水溶解，用盐酸溶液调节料液pH值至2.0～4.0，调整料液温度至15～30℃，加入适量亚硝酸钠，搅拌反应90～120分钟；所述亚硝酸钠的加入量为步骤4)所得沉淀物质量的2％～3％；

6)还原：降解反应完成后，迅速用氢氧化钠溶液调节料液的pH值至9.0～10.0，加入适量硼氢化钠，搅拌反应10～15小时，反应完成后用盐酸溶液调节pH值至2.0～5.0，继续搅拌反应15～30分钟，反应完成后，用氢氧化钠溶液调节料液的pH值至6～8，并加入适量的氯化钠，搅拌溶解并过滤，向滤液中加入3～5倍体积的醇液，搅拌后静置12～15小时；去上清液，向沉淀物中加入水，搅拌使其溶解，并进行20～30分钟紫外照射；所述硼氢化钠的加入量为步骤4)所述沉淀物质量的0.9％～1.1％；氯化钠与料液的质量体积比为0.9％～1.1％；

7)碱氧纯化：用氢氧化钠溶液调节料液pH值至9～10，加入1～3％料液体积的过氧化氢，20～30℃料液温度下搅拌反应6～8小时；氧化完毕后，醇沉，并将沉淀物用适量水溶解，所用水的量为步骤4)所述沉淀物质量的3～4倍；

8)超滤精制：将步骤7)所得溶液用5000Da～6000Da的膜循环超滤，收集截留液；截留液经0.22μm的膜超滤，得滤液，调节滤液pH值至6.4～7.4；

9)冻干：将滤液冻干，得低分子达特安瑞成品。

2.根据权利要求1所述的高品质低分子达特安瑞的制备方法，其特征在于，步骤4)醇沉除杂时，向步骤3)所得的截留液中加入0.6～0.8倍体积的甲醇，沉淀14～18小时，分离得沉淀物；再将沉淀物加水溶解，向溶液中加入1～1.2倍体积的甲醇，沉淀14～18小时，分离得沉淀物，将沉淀物真空干燥并称重。

3.根据权利要求1所述的高品质低分子达特安瑞的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述醇液为甲醇溶液或乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的高品质低分子达特安瑞的制备方法，其特征在于，步骤7)醇沉的具体过程为：用盐酸溶液调节料液pH至6～8，向其中加入适量氯化钠及2～3倍体积的乙醇，搅拌20～30分钟以后，静置沉淀8～10小时，去上清液；氯化钠与料液的质量体积比为1％～3％。

说明书

一种高品质低分子达特安瑞的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种高品质低分子达特安瑞的制备方法。

背景技术

[0002] 肝素(普通肝素即未分级肝素)是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用。但普通肝素存在生物利用度低、副作用大和给药次数过频等缺陷，而其换代产品低分子肝素如达特安瑞不仅抗血栓作用优于普通肝素，而且具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等优点。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类，在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量标准用抗FXa/FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。低分子达特安瑞是由经亚硝酸降解而得到的低分子肝素的一种，是普通肝素的一种升级产品，相对平均分子量在5600～6400Da之间，平均值在6000Da，其主要组成部分为在糖链的非还原末端具有2位氧硫酸化的艾多糖醛酸，在糖链的还原末端具有6位氧硫酸化的2，5-脱氢甘露醛。用于治疗急性深静脉血栓；急性肾功能衰竭和慢性肾功能不全者进行血液透析和血液过滤期间防止在体外循环系统中发生凝血；不稳定型冠状动脉疾病；预防与手术有关的血栓形成。具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，是目前主流的抗血栓类的药物。

[0003] 低分子达特安瑞(Dalteparin Sodium)是未分级肝素在特定的温度和pH条件下，与亚硝酸盐作用，使未分级肝素中的N-硫酸葡萄糖胺反应脱去HSO4-形成-NH2，-NH2与亚硝酸盐发生重氮化反应，在放出N2的同时糖苷键断裂，电子转移，缩环生成2，5-脱氢甘露醛，后者经还原糖或脱氢形成甘露糖醇。它与肝素产品相比，有着更好的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响。我国现有授权号为CN 101942038 B的专利“一种达替肝素的生产方法”，此专利方法是通过在肝素钠溶液中加入含甲基的有机溶剂，在特定温度和酸性条件下，采用亚硝酸盐降解法获得低分子肝素成品。在其制备过程中，是以精品肝素钠为原料，难以从原料源头控制最终成品质量，而且在制备过程中，加入了含甲基的有机溶剂和缺乏对降解的条件系统的、精密的控制，从而导致制备出来的低分子肝素样品拥有纯度不够、分子量分布不集中、杂质残留过多等缺点，这些都是目前的工艺所不能解决的问题。在最终制成注射型药物的过程中容易产生风险。

发明内容

[0004] 本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种高品质低分子达特安瑞的制备方法。

[0005] 与其他低分子肝素钠相比，该方法制备的高品质低分子量达特安瑞(Dalteparin Sodium)有着非常好的稳定性和抗血栓活性。

[0006] 本发明的技术任务是按以下方式实现的：一种高品质低分子达特安瑞的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 1)酶解：向粗品肝素钠中加入10～15倍量水(质量比)，溶解得原料液，调节原料液温度至35℃～39℃，加入复合酶，搅拌反应10～15小时，去沉淀，上清液过滤，收集滤液；

[0008] 2)氧化：控制步骤1)所得滤液温度至40℃～50℃，调整滤液pH值至9～11，加入0.1％～0.5％滤液体积的过氧化氢，搅拌反应6～8小时，得纯化液；

[0009] 3)超滤除杂：采用截留分子量为3,000Da～5,000Da的超滤膜对步骤2)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤5～10小时，收集截留液；

[0010] 4)醇沉除杂：截留液醇沉除杂，沉淀物干燥称重；

[0011] 5)降解：向步骤4)所得沉淀物中加7～8倍量(质量比)的水溶解，用盐酸溶液调节料液pH值至2.0～4.0，调整料液温度至15～30℃，加入适量亚硝酸钠，搅拌反应90～120分钟；所述亚硝酸钠的加入量为步骤4)所得沉淀物质量的2％～3％；

[0012] 6)还原：降解反应完成后，迅速用氢氧化钠溶液调节料液的pH值至9.0～10.0，加入适量硼氢化钠，搅拌反应10～15小时，反应完成后用盐酸溶液调节pH值至2.0～5.0，继续搅拌反应15～30分钟，反应完成后，用氢氧化钠溶液调节料液的pH值至6～8，并加入适量的氯化钠，搅拌溶解并过滤，向滤液中加入3～5倍体积的醇液，搅拌后静置12～15小时；去上清液，向沉淀物中加入水，搅拌使其溶解，并进行20～30分钟紫外照射；所述硼氢化钠的加入量为步骤4)所述沉淀物质量的0.9％～1.1％；氯化钠与料液的质量体积比为0.9％～1.1％；

[0013] 7)碱氧纯化：用氢氧化钠溶液调节料液pH值至9～10，加入1％～3％料液体积的过氧化氢，20～30℃料液温度下搅拌反应6～8小时；氧化完毕后，醇沉，并将沉淀物用适量水溶解，所用水的量为步骤4)所述沉淀物质量的3～4倍；

[0014] 8)超滤精制：将步骤7)所得溶液用5000Da～6000Da的膜循环超滤，收集截留液；截留液经0.22μm的膜超滤，得滤液，调节滤液pH值至6.4～7.4；

[0015] 9)冻干：将滤液冻干，得高品质低分子达特安瑞成品。

[0016] 优选的，所述复合酶包括木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II及脱氧核糖核酸酶I，木瓜蛋白酶的用量为肝素钠粗品重量的1％～2％，核糖核酸酶II的用量为肝素钠粗品重量的0.5％～1％，脱氧核糖核酸酶I的用量为肝素钠粗品重量的0.5％～1％。

[0017] 步骤4)、步骤7)中，可以利用现有技术中公知的醇沉方法完成醇沉操作，但是，为了得到更好的提纯效果，优选以下具体方法实现：

[0018] 步骤4)醇沉除杂时，向步骤3)所得的截留液中加入0.6～0.8倍体积的甲醇，沉淀14～18小时，分离得沉淀物；再将沉淀物加水溶解，向溶液中加入1～1.2倍体积的甲醇，沉淀14～18小时，分离得沉淀物，将沉淀物真空干燥并称重；

[0019] 步骤7)醇沉的具体过程：用盐酸溶液调节料液pH至6～8，向其中加入适量氯化钠及2～3倍体积的乙醇，搅拌20～30分钟以后，静置沉淀8～10小时，去上清液；氯化钠与料液的质量体积比为1％～3％。

[0020] 步骤6)中，所述醇液优选为甲醇溶液或乙醇溶液。

[0021] 与现有技术相比，本发明的高品质低分子达特安瑞的制备方法具有以下突出的有益效果：

[0022] (一)以复合酶解和改良的亚硝酸盐降解法为基础，以粗品肝素钠为原料，选用木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II等蛋白和核酸酶优化组合，对粗品肝素中蛋白和核酸进行高效降解，并结合膜技术一次性去除蛋白和核酸杂质，避免了传统工艺中从粗品到精品制备反复除杂的繁琐过程；

[0023] (二)未分级肝素在特定的温度和pH条件下，与亚硝酸盐作用，使未分级肝素中的N-硫酸葡萄糖胺反应脱去HSO4-形成-NH2，-NH2与亚硝酸盐发生重氮化反应，在放出N2的同时糖苷键断裂，电子转移，缩环生成2，5-脱氢甘露醛，后者经还原糖或脱氢形成甘露糖醇，后通过低分子膜分离技术获得具有特定平均分子量(5800-6200)的低分子达特安瑞精品；

[0024] (三)通过本发明方法制备得到的低分子达特安瑞平均分子量为5800～6200，分子量分布：＜1600的比例≤40.0％；＞4500的比例≤11.0％；抗FXa/FIIa＞30，抗FXa效价：145-180IU/mg，抗FIIa效价：＜5.0IU/mg，与其他低分子肝素钠相比，有着非常好的稳定性和抗血栓活性，产品质量超越欧洲药典标准，有望成为新生代的肝素类抗血栓药物。

具体实施方式

[0025] 以具体实施例对本发明的高品质低分子达特安瑞的制备方法作以下详细地说明。

[0026] 制备实施例一：

[0027] 具体步骤：

[0028] 1)酶解：称取粗品肝素钠100g，向其中加入1200g水，溶解得原料液；调节原料液温度至37℃，分别加入木瓜蛋白酶1g、核糖核酸酶II0.5g及脱氧核糖核酸酶I0.5g，搅拌反应12小时，去沉淀，上清液过滤，收集得滤液；

[0029] 2)氧化：控制步骤1)所得滤液温度至45℃，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调整滤液pH值至9.5～10，加入12ml过氧化氢，搅拌反应7小时，得纯化液；

[0030] 3)超滤除杂：采用截留分子量为4,000Da的超滤膜对步骤2)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤7小时，收集得截留液316ml；

[0031] 4)醇沉除杂：向步骤3)所得的截留液中加入252ml甲醇，沉淀16小时，分离得沉淀物a；再将沉淀物a加水溶解至300ml，并加入300ml甲醇，沉淀16小时，分离得沉淀物b，将沉淀物b真空干燥并称重(83g)；

[0032] 5)降解：向步骤4)所得沉淀物中加600g水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节料液pH值至2.0～4.0，调整料液温度至15℃，加入2g亚硝酸钠，搅拌反应90分钟；

[0033] 6)还原：降解反应完成后，迅速用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调节料液的pH值至9.0～10.0，加入0.83g硼氢化钠，搅拌反应12小时，反应完成后用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至2.0～5.0，继续搅拌反应20分钟，反应完成后，再用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节料液的pH值至6.5～7，并加入1％(w/v)料液体积的NaCl，搅拌溶解并过滤，向滤液中加入4倍体积的药用乙醇，搅拌后静置14小时；去上清液，向沉淀物中加入水至600ml，搅拌使其溶解，并进行25分钟紫外照射；

[0034] 7)碱氧纯化：用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调节料液pH值至9.5～10，加入1.5％料液体积的过氧化氢，25℃料液温度下搅拌反应7小时；氧化完毕后，用1mol/L的盐酸溶液调节料液pH至6.5～7，向其中加入1.5％(w/v)料液体积的NaCl及2.5倍料液体积的乙醇，搅拌25分钟以后，静置沉淀9小时，去上清液，沉淀物用300g水溶解；

[0035] 8)超滤精制：将步骤7)所得溶液用5000Da的膜循环超滤，收集截留液；截留液经0.22μm的膜超滤，得滤液，调节滤液pH值至6.4～7；

[0036] 9)冻干：将滤液冻干，得高品质低分子达特安瑞成品43g。

[0037] 制备实施例二：

[0038] 具体步骤：

[0039] 1)酶解：称取粗品肝素钠200g，向其中加入2000g水，溶解得原料液；调节原料液温度至37℃，分别加入木瓜蛋白酶4g、核糖核酸酶II1g及脱氧核糖核酸酶I1g，搅拌反应12小时，去沉淀，上清液过滤，收集得滤液；

[0040] 2)氧化：控制步骤1)所得滤液温度至45℃，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调整滤液pH值至9.5～10，加入25ml过氧化氢，搅拌反应7小时，得纯化液；

[0041] 3)超滤除杂：采用截留分子量为4000Da的超滤膜对步骤2)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤7小时，收集得截留液700ml；

[0042] 4)醇沉除杂：向步骤3)所得的截留液中加入560ml甲醇，沉淀16小时，分离得沉淀物a；再将沉淀物a加水溶解至700ml，并加入800ml甲醇，沉淀16小时，分离得沉淀物b，将沉淀物b真空干燥并称重(172g)；

[0043] 5)降解：向步骤4)所得沉淀物中加1200g水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节料液pH值至2.0～4.0，调整料液温度至30℃，加入4g亚硝酸钠，搅拌反应120分钟；

[0044] 6)还原：降解反应完成后，迅速用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调节料液的pH值至9.0～10.0，加入1.7g硼氢化钠，搅拌反应12小时，反应完成后用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至2.0～5.0，继续搅拌反应30分钟，反应完成后，再用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调节料液的pH值至6.5～7，并加入1％(w/v)料液体积的NaCl，搅拌溶解并过滤，向滤液中加入4倍体积的药用乙醇，搅拌后静置14小时；去上清液，向沉淀物中加入水至1200ml，搅拌使其溶解，并进行25分钟紫外照射；

[0045] 7)碱氧纯化：用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调节料液pH值至9.5～10，加入1.5％料液体积的过氧化氢，25℃料液温度下搅拌反应7小时；氧化完毕后，用1mol/L的盐酸溶液调节料液pH至6.5～7，向其中加入1.5％(w/v)料液体积的NaCl及2.5倍料液体积的乙醇，搅拌25分钟以后，静置沉淀9小时，去上清液，沉淀物用600g水溶解；

[0046] 8)超滤精制：将步骤7)所得溶液用5000Da的膜循环超滤，收集截留液；截留液经0.22μm的膜超滤，得滤液，调节滤液pH值至6.4～7；

[0047] 冻干：将滤液冻干，得高品质低分子达特安瑞92g。

[0048] 试验例：参照美国药典方法对样品进行活性检测

[0049] 以制备实施例一、二所得高品质低分子达特安瑞为样品进行试验，试验结果见表一。

[0050] 表一：

[0051]