用于深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.生产淀粉酶的培养基

摘要

本发明涉及用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高淀粉酶的产量。

权利要求

1.一种深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：所述培养基中，还含有有效量的微量元素；微量元素含量为：

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：其中，各组分在培养基中的含量可在±10％范围内浮动。

3.如权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，各组分配制于水中；和/或所述培养基的pH值6±0.5。

4.权利要求1-3任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j，生产淀粉酶。

5.一种制备权利要求1-3任一所述的深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

(b)将所述酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；

(c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及微量元素；

其中，各组分的用量按照权利要求1-3任一所述。

6.一种利用深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j生产淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-3任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j，从而生产淀粉酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将深海海洋嗜热细菌 (Geobacillus sp.)4j按体积比1-5％的接种量接种入权利要求1-3任一所述的培养基，60℃、静置状态下发酵培养72-96h，静置培养过程中每隔12h进行一次振荡处理，将培养菌液混匀；培养72h和96h后，离心分离发酵上清液，其中含有淀粉酶。

8.一种用于培养深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.)4j的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1-3任一所述的培养基。

说明书

用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培

养基

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)生产淀粉酶的培养基及其制备方法。

背景技术

[0002] 嗜热海洋微生物是来源于地热含油地质层、深海火山泥、深海热液口等特殊环境的一类嗜热微生物资源。嗜热微生物因其对高温独特的适应性而备受人们关注，一般是指最适生长温度大于45℃的一类微生物。作为嗜热微生物，其主要应用之一是嗜热酶的开发应用。嗜热酶因其热稳定性高的优点而备受瞩目，其中最有名的就是Tag酶的发现和开发，使得PCR反应这一革命性的技术发展成为生命科学领域最为重要的技术之一。目前已知的从嗜热菌中分离出来的酶具高热稳定性、传质速率高、耐化学变性剂、易于纯化等特点。

[0003] 深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j，是由是由中国海洋第三研究所首次分离得到的、来源于深海、最适生长温度在60℃的一种中度嗜热微生物。由于其来源于深海这一极端环境，对溶氧、高盐、高温、高压等环境条件可能会有特殊的生理相应。在应用方面，Geobacillus sp.4j目前发现能够产生降解淀粉的淀粉酶。该种淀粉酶的活性和热稳定性等有待进一步探索，而能否用于工业化生产一种新型淀粉酶也值得研究。

[0004] 然而，嗜热菌Geobacillus sp.4j在原始培养基中生长淀粉酶的产量很低，成为各项研究的瓶颈，特别在其规模化发酵培养产酶的领域。如果不能提高淀粉酶的产量，就很难进行相应的酶学研究和工业化生产的探索。

[0005] 因此，通过优化其培养环境、改善其发酵工艺成为当务之急。培养基是微生物生长的基质，开发一种用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j生产淀粉酶的新型培养基是目前工作的重要基础。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基，其制备方法及应用。

[0007] 在本发明的第一方面，提供一种深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基，所述培养基包括以下组分：

[0008]

[0009] 在一个优选例中，所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.是Geobacillus sp.4j。

[0010] 在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：

[0011]

[0012] 在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：

[0013]

[0014]

[0015] 其中，各组分在培养基中的含量可在±10%(更佳地±5%)范围内浮动。

[0016] 在另一优选例中，所述培养基中，还含有有效量(适于细菌生长的量)的微量元素；较佳地，微量元素含量为：

[0017]

[0018] 在另一优选例中，所述培养基中，各组分配制于水(较佳地，所述的水是去离子水)中；和/或所述培养基的pH值6±0.5。

[0019] 在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，生产淀粉酶。

[0020] 在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基的方法，所述方法包括：

[0021] (a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

[0022] (b)将所述酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；

[0023] (c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素；

[0024] 其中，各组分的用量按照前面任一所述。

[0025] 在另一优选例中，在步骤(a)中，所述糊化为用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。

[0026] 在另一优选例中，步骤(c)之后，进一步包括：将pH调至6±0.5，在121℃灭菌20-30min。

[0027] 在本发明的另一方面，提供一种利用深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的方法，所述方法包括：利用前面任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，从而生产淀粉酶。

[0028] 在一个优选例中，将深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.按体积比1-5%的接种量接种入前面任一所述的培养基，60℃、静置状态下发酵培养72-96h，静置培养过程中每隔12h进行一次振荡处理，将培养菌液混匀；培养72h和96h后，离心分离发酵上清液，其中含有淀粉酶。

[0029] 在另一优选例中，用于接种的种子液的OD600为1.8-2.4，菌落数密度约为6 6
2.1×10-2.8×10CFU/ml。

[0030] 在本发明的另一方面，提供一种用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的试剂盒，所述试剂盒中包括：前面任一所述的培养基。

[0031] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

[0032] 本发明人经过长期而深入的研究，研究开发了一种新的适合于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)使之高效生产淀粉酶的培养基配方。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高淀粉酶的产量。

[0033] 如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

[0034] 术语“本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基”指含有可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素的组合物；或基本上由可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素组成的组合物。在组合物中，所述的可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素占培养基总重量的80-100%，较佳地占90-100%，更佳地占95-100%，如98%，99%。

[0035] 作为本发明的优选方式，用于配制本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)培养基的各组分的用量如表1所示。

[0036] 表1

[0037]

[0038]

[0039] 作为本发明的优选方式，所述的培养基中还添加微量元素，微量元素的添加量以满足菌体生长和生产所需为宜，本领域技术人员可按照经验添加。作为本发明的优选方式，微量元素各组分的用量如表2所示。

[0040] 表2

[0041]

[0042] 在得知本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地进行配制。

[0043] 本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.发酵生产淀粉酶，淀粉酶的产量得到显著提高，有利于大规模工业化生产。

[0044] 作为本发明的优选方式，在配制所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中。所述的水较佳地为去离子水。更优选的，提供一种用于制备上述培养基的方法，包括步骤：

[0045] (a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

[0046] (b)将所述酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；

[0047] (c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素。

[0048] 所述可溶性淀粉需先进行糊化处理，目的是防止灭菌过程中结块的问题。可溶性淀粉的糊化可以采用本领域人员已知的任何方法。作为本发明的优选方式，所述糊化为用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。

[0049] 作为本发明的优选方式，步骤(c)之后，进一步包括：将pH调至6±0.5，在121℃灭菌20-30min。

[0050] 本发明还提供了使用所述培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)发酵生产淀粉酶的发酵方法，包括步骤：利用所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，从而生产淀粉酶。

[0051] 本发明还提供了一种上述发酵方法生产的淀粉酶的检测方法，其操作步骤包括：

[0052] a.用接种针或灭菌的枪头从新鲜的Geobacillus sp.1j的固体平板中挑取单菌落，接种至装有80ml活化种子培养基的250ml摇瓶中，60℃、100rpm摇床发酵培养16-20h，获得新鲜种子液；

[0053] b.取所述新鲜种子液，按1%(v/v)的接种量接入装有50ml所述新型培养基的250ml摇瓶中，硅胶塞密封，60℃，静置于高温恒温摇床中发酵培养72-96h，对于整个静置培养过程，每隔12h进行一次15min，100rpm的振荡，将培养菌液混匀，使菌液混合均匀。培养72h和96h后，12000rpm，4℃离心3min，获得发酵上清液用于酶活的测定，取其中较大的值。

[0054] 较佳地，将-80℃保存的菌种解冻后，用无菌接种环取1环菌液，在固体平板活化培养基上进行划线，置于60℃恒温培养箱中，活化培养8-12h，获得新鲜固体平板，然后置于4℃冰箱待用，以后固体平板每隔30天重新活化一次。

[0055] 较佳地，每升活化培养基包含有酵母粉2.5g，蛋白胨2.5g，氨三乙酸0.1g，二水硫酸钙0.04g，氯化镁0.2g，柠檬酸铁0.01675g，微量元素液I0.5ml，磷酸盐缓冲液100ml，其余为去离子水，pH调至7.35左右，在121℃灭菌20-30min。

[0056] 较佳地，每升固体平板活化培养基是在活化培养基的基础上添加琼脂粉15-20g。

[0057] 较佳地，接种时新鲜种子液新鲜种子液的OD600为1.8-2.4，菌落数密度约为6 6
2.1×10-2.8×10CFU/ml。

[0058] 较佳地，每升磷酸盐缓冲液中含有磷酸氢二钾5.44g，十二水合磷酸氢二钠43g，其余为去离子水，pH调至7.2左右。

[0059] 本发明的培养基成分明确，添加量低，成本低廉，制备操作方便，能显著提高深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j在高温环境下生长生产耐热淀粉酶的产量，使得发酵上清液中的淀粉酶的酶活由原来的2U/ml提高到6.36U/ml。这对于深海海洋嗜热细菌产酶的发酵研究和新型的淀粉酶的开发具有重要的意义。

[0060] 本发明还提供了一种利用所述发酵方法获得的淀粉酶的检测方法，包括步骤：取若干试管标记，用移液器吸取适量1%的淀粉底物(pH7.50)，放入60℃恒温水浴预热10min。然后将适量的所述发酵方法获得的发酵上清液加入试管中，立即混匀，精确反应一段时间。
反应后，将反应试管立即转移到冰水浴中，立即加入适量去离子水和适量的DNS试剂，混合均匀。然后转移至100℃恒温水浴精确计时反应5min后，立即放入冰水混合物中冷却，然后加入一定体积去离子水，混匀再用分光光度计测定540nm处的吸光度值A，根据吸光值A换算反应液中的还原糖含量。然后同时测定淀粉底物以及发酵上清液中本来就有的还原糖含量，通过计算相应的差值即可算出所述发酵上清液中淀粉酶的酶活。其中1个酶活单位定义为上述条件下每分钟催化分解产生1微摩尔还原糖的酶量。

[0061] 本发明的有益效果具体如下：

[0062] 1.本发明的新型培养基成分包括可溶性淀粉、酵母粉、硝酸钠、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵等常见试剂，微量元素液添加量低，原料易得，用量少，成本低；

[0063] 2.制备本发明的新型培养基时，先将淀粉用去离子水制成悬浮液，煮沸糊化，再冷却，将其余组分溶解于去离子水，两者混合，再添加少量微量元素液，定容即可，制备简单；

[0064] 3.采用本发明的新型培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j，该菌株在该新型培养基中生长淀粉酶的产量有显著提高，使得发酵上清液中的淀粉酶的酶活由原来的2U/ml提高到6.36U/ml。

[0065] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0066] 此外，采用不同厂家的高温恒温摇床等设备，可能会造成实验结果的少许差异，诸如此类的差异属于正常现象。

[0067] 实施例1、培养基1

[0068] 1)可溶性淀粉糊化

[0069] 称取10g可溶性淀粉，用20ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

[0070] 2)培养基配制

[0071] 称取酵母粉4g，硝酸钠3g，氯化钠20g，无水硫酸镁1.67g，氯化镁8.92g，氯化钾0.33g，氯化钙0.1g，磷酸氢二钾0.183g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤2)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6。

[0072] 其中制备微量元素液I如下制备：

[0073] 氨三乙酸12.8g，四水合氯化亚铁1g，四水合氯化锰0.5g，四水合氯化钴0.3g，二水合氯化铜0.05g，钼酸钠0.05g，硼酸0.02g，六水合氯化镍0.02g，其余为去离子水，定容至1000ml，pH调至6.8。长时间储藏需要使用0.22μm的针头式过滤器过滤除菌。

[0074] 3)发酵培养过程

[0075] 深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.4j由中国海洋第三研究所提供。从已经活化好的固体平板中挑取单菌落，接种至装有80ml活化种子培养基的250ml摇瓶中，60℃、100rpm摇床发酵培养18h，获得新鲜种子液；新鲜种子液的OD600为2.1(菌落数密度约
6
为2.4×10CFU/ml)，按1%(v/v)的接种量将新鲜种子液接入装有50ml所述新型培养基的250ml摇瓶中，60℃，静置于高温恒温摇床中发酵培养96h，对于整个静置培养过程，每隔12h进行一次15min，100rpm的振荡，将培养菌液混匀，使菌液混合均匀。培养96h后，
12000rpm，4℃离心3min，获得发酵上清液用于酶活的测定。

[0076] 其中，每升活化培养基包含有酵母粉2.5g，蛋白胨2.5g，氨三乙酸0.1g，二水硫酸钙0.04g，氯化镁0.2g，柠檬酸铁0.01675g，微量元素液I0.5ml，磷酸盐缓冲液100ml，其余为去离子水，pH调至7.35左右，在121℃灭菌20-30min。每升磷酸盐缓冲液中含有磷酸氢二钾5.44g，十二水合磷酸氢二钠43g，其余为去离子水，pH调至7.2左右。

[0077] 4)淀粉酶的酶活测定

[0078] 取若干试管标记，吸取10g/L预先糊化的淀粉底物(采用0.05M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液糊化和配制，pH7.50)280μL，放入60℃恒温水浴预热10min。然后将发酵上清液20μL加入试管中，立即混匀，精确反应10min。反应后，将反应试管立即转移到冰水浴中，立即加入200μL去离子水和300μL的DNS试剂，混合均匀。然后转移至100℃恒温水浴精确计时反应5min后，立即放入冰水混合物中冷却，然后加入离子水6ml，混匀再用分光光度计测定540nm处的吸光度值A，根据吸光值A换算反应液中的还原糖含量。然后同时测定淀粉底物以及发酵上清液中本来就有的还原糖含量，即可算出以每分钟水解产生还原糖的含量来表征的淀粉酶的酶活，测定结果，酶活为4.4U/ml。

[0079] 实施例2、培养基2

[0080] 1)可溶性淀粉糊化

[0081] 将10g可溶性淀粉用20ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

[0082] 2)培养基配制

[0083] 称取酵母粉8g，硝酸钠1g，氯化钠20g，无水硫酸镁1.67g，氯化镁15g，氯化钾0.33g，氯化钙0.15g，磷酸氢二钾0.183g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6。

[0084] 3)发酵培养过程

[0085] 同实施例1的步骤3)。

[0086] 4)发酵培养测定

[0087] 同实施例1的步骤4)，测定淀粉酶的酶活为4.98U/ml。

[0088] 实施例3、培养基3

[0089] 1)可溶性淀粉糊化

[0090] 称取9g可溶性淀粉用20ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

[0091] 2)培养基配制

[0092] 称取酵母粉8g，硝酸钠7.5g，氯化钠20g，无水硫酸镁1.67g，氯化镁6g，氯化钾0.33g，氯化钙0.6g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I12ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6。

[0093] 3)发酵培养过程

[0094] 同实施例1的步骤3)。

[0095] 4)发酵培养测定

[0096] 同实施例1的步骤4)，测定淀粉酶的酶活为5.08U/ml。

[0097] 实施例4、培养基4

[0098] 1)可溶性淀粉糊化

[0099] 称取6g可溶性淀粉用15ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体。

[0100] 2)培养基配制

[0101] 称取酵母粉8g，硝酸钠5g，氯化钠15g，无水硫酸镁1.67g，氯化镁2g，氯化钾0.33g，氯化钙0.6g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6。

[0102] 3)发酵培养过程

[0103] 为便于比较，同实施例1的步骤3)。

[0104] 4)菌体密度测定

[0105] 同实施例1的步骤4)，测定淀粉酶的酶活为6.2U/ml。

[0106] 实施例5、培养基5

[0107] 1)可溶性淀粉糊化

[0108] 称取6g可溶性淀粉用12ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

[0109] 2)培养基配制

[0110] 称取酵母粉8g，硝酸钠5g，氯化钠12.5g，无水硫酸镁1.67g，氯化镁0.32g，氯化钾0.33g，氯化钙0.6g，磷酸氢二钾0.484g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6。

[0111] 3)发酵培养过程

[0112] 同实施例1的步骤3)。

[0113] 4)菌体密度测定

[0114] 同实施例1的步骤4)，测定淀粉酶的酶活为6.36U/ml。

[0115] 实施例6、对照组实例

[0116] 1)可溶性淀粉糊化

[0117] 称取30g可溶性淀粉用50ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子