一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物化工及酶工程领域，涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用。本发明将经过预处理的介孔TiO2采用硅烷偶联剂对其表面进行疏水改性，得到表面修饰的介孔TiO2载体；以修饰后的介孔TiO2为载体对脂肪酶进行固定化制备固定化脂肪酶；采用该固定化脂肪酶在有机相中进行芳香酯类的酶促合成和药物中间体的酶促手性拆分以及采用该载体对脂肪酶进行纯化研究。本发明所得到的载体可以从脂肪酶发酵粗酶液中选择性的吸附脂肪酶蛋白分子，因而固定化工艺简单，条件温和，固定化过程中酶活损失少，活性回收率高。所得的固定化脂肪酶在有机相中有着良好的立体选择性和催化活性，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）载体制备

利用硅烷偶联剂对预处理后的介孔TiO2进行表面疏水改性；所述硅烷偶联剂选自

3-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷、3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、或者3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷中的一种或两种以上；

（2）脂肪酶的固定化

在表面改性后的介孔TiO2中加入脂肪酶溶液，搅拌吸附，离心，将沉淀用磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出，冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述介孔TiO2进行表面改性的具体方法为：取预处理后的介孔TiO2，加入甲苯，预热5~20min, 再加入硅烷偶联剂，在N2保护下，30~90℃搅拌，回流反应1~24h，离心弃上清，将沉淀用甲苯、丙酮、无水乙醇依次分别洗涤后，真空干燥得表面改性的介孔TiO2。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的介孔TiO2与甲苯的质量体积比按g/mL计为1:100~500；

所述预处理的介孔TiO2与硅烷偶联剂的质量摩尔比以g/mmol计为10~1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述介孔TiO2预处理的具体方法为：向介孔TiO2中加入混合溶液，50~90℃搅拌回流1~5 h，离心弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤至pH值中性，真空干燥，得预处理后的介孔TiO2；

所述混合溶液由浓硫酸与30%过氧化氢按体积比9~1：1组成；

所述介孔TiO2与混合溶液的质量体积比以g/mL计为1:10~100。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或者3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述表面改性的介孔TiO2与脂肪酶溶液的质量体积比以g/mL计为1: 5~50；所述脂肪酶溶液的蛋白含量在0.05-5 mg/mL之间。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）在表面改性后的介孔TiO2中加入脂肪酶溶液，在20~50℃下搅拌吸附反应3~36h，离心，将沉淀用磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出，冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。

8.一种权利要求1-7所述制备方法得到的固定化脂肪酶。

9.权利要求8所述的固定化脂肪酶在水相中催化水解反应、在有机相中催化酯化反应、转酯反应和/或手性拆分中的应用。

说明书

一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工及酶工程领域，涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用，具体地涉及了一种以表面修饰的介孔TiO2为载体来制备固定化脂肪酶的方法，以及该固定化脂肪酶在有机相中催化酯类合成和拆分手性化合物中的应用。

背景技术

[0002] 脂肪酶（lipase, EC 3. 1. 1. 3，甘油三酰酯水解酶）是一种可以催化天然底物三酰甘油酯水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶类。脂肪酶可以催化诸如水解、酯化、转酯等多种类型的反应，并且具有较高的立体选择性、底物专一性和区域选择性。作为一种具有多种催化功能的酶，脂肪酶被广泛应用在食品、能源、日化、医药等重要的工业领域。尽管脂肪酶已经被许多科学家证实为最重要的工业用酶之一，但其每年的销售额只占全世界酶制剂市场的4%。由于游离脂肪酶不能重复利用、不稳定且在有机相中容易“团聚”而失活，这些都使得工业生产过程中脂肪酶的成本居高不下，另外游离脂肪酶还存在后续与产物分离不易，不利于连续化生产等缺陷，这些因素共同制约了脂肪酶在工业上的大量使用。通过化学或物理方法可以将脂肪酶固定在水不溶性的载体上将其制备成固定化脂肪酶使得其既能保持了脂肪酶的催化特性同时又具备了可回收利用，后续过程中容易与产物分离、能够实现连续化生产等特性。因此，固定化酶将能极大提升脂肪酶在工业生产中的应用范围。

[0003] 酶的固定化有吸附、交联、包埋以及共价结合等方法，其中交联和共价结合的固定化方式可能会影响到酶的活性中心导致固定化过程中酶活的损失。而靠物 理吸附来实现的固定化过程有着条件温和、吸附量可控、不存在酶活损失等优点。游离酶经固定化后，其载体表面的微环境对提高固定化酶的催化活力和稳定性有着重要的影响。脂肪酶在催化油脂类底物水解时在油水界面有明显的“界面激活”效应。这是由于在脂肪酶活性中心上方覆盖有一些二级结构（通常所称的“lid”盖子结构），当脂肪酶不在油水界面时，这些“lid”结构覆盖在活性中心上方，阻碍了催化底物进入到脂肪酶的活性中心，然而，当脂肪酶存在于一个疏水的界面时，它的分子构象发生了转变，活性部位从一种盖关闭的状态转化为敞开状态使得底物能够进入到活性中心。这个构象的改变同时也导致了脂肪酶暴露出其表面的疏水区域，通过与这些疏水区域的相互作用也可以使得脂肪酶的活力得到提高。由此看来，脂肪酶可以通过活性中心周围的疏水残基定向的吸附到一些经过修饰的疏水材料的表面。因此，这种脂肪酶的“界面激活”机制也可以作为一种脂肪酶固定化的工具，它提供了一种新的简便易行的脂肪酶定向固定化方式。

[0004] 固定化酶的载体材料一般有无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料等。一种良好的固定化酶载体材料要有一定的机械强度，良好的热稳定性、化学稳定性、生物相容性。近来兴起的二氧化钛介孔材料作为一种新型的高性能材料备受关注，在操作过程中二氧化钛介孔材料可以实现纳米级别孔径的可控调节。这种新型的介孔二氧化钛材料具有很高的比表面积、孔径均一等特点，并且表面富含丰富的活性羟基，容易对其表面进行活性修饰。

发明内容

[0005] 本发明的技术目的旨在提供一种高效、稳定、分散性好的固定化脂肪酶及其制备方法，使得该固定化脂肪酶可以在有机相中应用于水解、酯化、转酯等多种类型的反应。

[0006] 为了解决现有技术的技术问题，实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下。

[0007] 一、一种固定化脂肪酶的制备方法，是由固定化载体和吸附在固定化载体上的脂肪酶（lipase, EC 3. 1. 1. 3，甘油三酰酯水解酶）吸附结合而制得，其特征在于具体制备方法如下：

[0008] （1）载体制备：

[0009] 利用硅烷偶联剂对预处理后的介孔TiO2进行表面疏水改性，具体方法为：取预处理后的介孔TiO2，加入甲苯，预热5~20min, 再加入硅烷偶联剂，在N2保护下， 30~90℃搅拌，回流反应1~24h，离心弃上清，将沉淀用甲苯、丙酮、无水乙醇依次分别洗涤后，真空干燥得表面改性的介孔TiO2。考察其中，所述预处理的介孔TiO2与甲苯的质量体积比按g/mL计为1:100~500；优选范围为1:100~300，最优配比为1:200；

[0010] 所述预处理的介孔TiO2与硅烷偶联剂的质量摩尔比以g/mmol计为10~1:1，优选为2:1。

[0011] 其中，所述介孔TiO2预处理的具体方法为：向介孔TiO2中加入混合溶液，50~90℃搅拌回流1~5 h，离心弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤至pH值中性，真空干燥，得预处理后的介孔TiO2；

[0012] 所述混合溶液由浓硫酸与30%过氧化氢按体积比9~1：1组成；

[0013] 所述介孔TiO2与混合溶液的质量体积比以g/mL计为1:10~100。

[0014] 其中，所述的浓硫酸是质量浓度98%的浓硫酸，即本领域技术人员常用的浓硫酸试剂。

[0015] 所述硅烷偶联剂包括但不限于：3-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷、3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、或者3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷中的一种或两种以上；优选的硅烷偶联剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或者3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷；最优选的硅烷偶联剂是3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷。

[0016] （2）脂肪酶的固定化：在表面改性后的介孔TiO2中加入脂肪酶溶液，在20~50℃下搅拌吸附反应3~36h，离心，将沉淀用磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出，冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。

[0017] 所述表面改性的介孔TiO2与脂肪酶溶液的质量体积比以g/mL计为1: 5~50。所述脂肪酶溶液的蛋白含量在0.05-5 mg/mL之间。

[0018] 其中，所述的脂肪酶溶液可以选自预处理后的脂肪酶发酵液，或者选自经缓冲液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液。

[0019] 根据本领域技术人员的公知常识可知，所述的脂肪酶发酵液，即是通过可分泌脂肪酶的微生物的发酵后，得到的发酵体系中包括水、微生物菌体、分泌在发酵体系中的脂肪酶、以及残余的培养基成分和其他痕量发酵副产物的体系。而所述的经缓冲液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液，即是将市售的、或者通过其他诸如赠与、制备等途径得到的脂肪酶的酶粉或酶液溶于缓冲液中，得到的酶溶液。

[0020] 进一步地，所述的预处理后的脂肪酶发酵液的制备方法是：将脂肪酶发酵液用10kDa分子量大小的超滤膜超滤浓缩，再用缓冲液稀释至蛋白含量在0.05-5 mg/mL，即得到预处理后的脂肪酶发酵液。根据本领域技术人员的公知常识可知，用于稀释酶液的缓冲液，可以选择蒸馏水、磷酸缓冲、Tris-HCl缓冲、PBS、或者TBS等，即只要能实现将酶液的蛋白含量和酶液pH值稀释至本发明设定的范围内的本领域技术人员常用的缓冲液的，都应当可以实现本发明的技术效果。

[0021] 或者，所述的经缓冲液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液，其蛋白含量同样为0.05~5mg/mL。

[0022] 二、本发明还提供一种采用上述方法制备得到的固定化脂肪酶。

[0023] 三、本发明所述的固定化脂肪酶在水相中催化水解反应的应用。

[0024] 作为本应用中的一个优选的实施方式可知，本发明提供了一个将所述的固定化脂肪酶在水相中催化油脂类化合物水解制备脂肪酸和甘油的应用实施例。具体地，所述的固定化脂肪酶在pH7.0的磷酸缓冲液中催化底物天然油脂进行油脂水解反应，反应温度为20~60℃，反应时间为3~48h，水解率可达20%~96%。

[0025] 其中，所述的天然油脂包括但不限于：蓖麻油、橄榄油、大豆油、玉米油以及牛油。

[0026] 四、本发明所述的固定化脂肪酶在有机相中催化酯化反应的应用。

[0027] 作为本应用中的一个优选的实施方式可知，本发明提供了一个将所述的固定化脂肪酶在有机相中催化乳酸酯合成的应用实施例。具体地，所述的固定化脂肪酶在有机溶剂叔丁醇体系中，催化底物乳酸和醇类进行酯化反应，反应温度为20~60℃，反应时间为24~48h，并向反应体系中加入质量分数为5%的4Å分子筛以除去反应过程中生成的水，在反应结束后底物乳酸的转化率可达50%~95%。

[0028] 其中，所述的有机溶剂、乳酸以及醇类均经预先脱水处理，所述的醇类包括但不限于：甲醇、乙醇、正丁醇。

[0029] 五、本发明所述的固定化脂肪酶在有机相中催化转酯反应的应用。

[0030] 作为本应用中的一个优选的实施方式可知，本发明提供了一个将所述的固定化脂肪酶在有机相中催化乙酸肉桂酯合成的应用实施例。具体地，所述的固定化脂肪酶在有机溶剂异丙醚体系中，催化底物肉桂醇和酰基供体进行酯交换反应，反应温度为20~60℃，反应时间为3~48h，转化率可达20%~96%。

[0031] 其中，所述的酰基供体包括但不限于：乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸酐、乙酸乙酯、乙酸丁酯。

[0032] 六、本发明所述的固定化脂肪酶在有机相中催化手性拆分的应用。

[0033] 作为本应用中的一个优选的实施方式可知，本发明所述的固定化脂肪酶在正己烷体系中，催化底物1-（2-萘基）乙醇与脂肪酸乙烯酯进行酯交换反应转化为脂肪酸-1-（2-萘基）乙酯，反应温度为20~50℃，反应时间为12h~48h，转化率为50%，产物为R型脂肪酸-1-（2-萘基）乙醇，ees值>99.9%，拆分后底物为S型1-（2-萘基）乙醇，eep值>99.9%。

[0034] 其中，所述脂肪酸乙烯酯包括：乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯或者硬脂酸乙烯酯。

[0035] 七、本发明所述的经硅烷偶联剂疏水改性后的介孔TiO2载体在脂肪酶纯化中的应用。

[0036] 本发明采用疏水的硅烷偶联剂对介孔二氧化钛材料进行修饰后可实现二氧化钛微米级别颗粒在有机相中的均匀分散，避免其由于表面羟基的存在发生团聚，从而提高了将来在有机相中催化过程中的传质速率。通过这种疏水硅烷偶联剂修饰的介孔二氧化钛材料来对脂肪酶进行吸附来实现脂肪酶的定向固定化，不仅可以直接从脂肪酶发酵粗酶液中选择性的吸附脂肪酶，而且可能触发脂肪酶的“界面激活”效应，另外这种材料较小的颗粒和大的比表面积也使得固定化后的脂肪酶能很好的均匀分散在反应体系当中从而提高反应过程中的传质速率，使得脂肪酶的催化效率得到提升。

[0037] 本实验对固定化脂肪酶和游离酶的最适反应温度和温度稳定性进行考察：最适反应温度的测定在0.05 M Na2HPO4•12H2O-NaH2PO4•2H2O缓冲体系（pH 7.0）中进行，在不同的温度下以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物进行酶促反应。结果如图3所示，固定化脂肪酶的最适反应温度为50℃，与游离酶相同，与游离酶相比，固定化脂肪酶的温度适应范围更广。

[0038] 温度稳定性考察：将固定化脂肪酶和游离脂肪酶分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下水浴锅中保温1h和3h，测定其在40℃条件下的脂肪酶残余活力。由图4可以看出，固定化脂肪酶表现出了更好的稳定性，在60℃条件下处理3h后，固定化脂肪酶保留了大约84.4%的活力，而在此条件下的游离酶则仅保留了40.7%的初始酶活。固定化酶在60℃条件下处理3h相比处理1h仅下降了3.7%的酶活力，而游离酶在2h内下降了约
16%的活力。

[0039] 固定化脂肪酶和游离酶的最适反应pH和pH稳定性的检测：以不同pH缓冲液溶解的对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，以最高的酶活力为对照（100%）。不同pH体系中的酶活如图5所示，固定化脂肪酶YCJ01的最适反应pH为7.0，游离酶最适反应pH为7.5。以原始酶液的脂肪酶活力为对照，检测固定化脂肪酶和游离酶的pH稳定性。将固定化脂肪酶和游离酶加入到不同pH的缓冲溶液中30℃保温1h后测残余酶活，实验表明固定化脂肪酶在pH6.0~9.0的范围内具有较高的稳定性（如图6所示）。

[0040] 本发明的有益效果在于：

[0041] 1.本发明采用经硅烷偶联剂修饰的介孔TiO2为载体，对脂肪酶进行了固定化，经修饰后的载体可以选择性的从脂肪酶发酵粗酶液中选择性的吸附脂肪酶蛋白以达到纯化的目的且固定化过程中脂肪酶活力回收率高，并且载体表面的微环境对脂肪酶有一个明显的激活作用。

[0042] 2.经固定化后的脂肪酶较游离酶相比展现出了更好的温度和pH稳定性。

[0043] 3.经固定化后的脂肪酶在非水相催化过程中的反应速率相比游离脂肪酶得到了很大提高，并且重复使用性能好。

[0044] 4.本发明中所制得的硅烷偶联剂修饰的介孔TiO2载体可用作一种专一性的脂肪酶纯化载体，并且该载体机械强度高，生物相容性好，粒径小而均匀，且可耐酸耐盐腐蚀。

[0045] 5.本发明的一个实施例，还证实了本发明所述的固定化脂肪酶能转移性地吸附脂肪酶发酵液中的脂肪酶，该技术效果使得发明的固定化脂肪酶中的固定化载体可以直接应用于脂肪酶发酵液中吸附脂肪酶直接制得固定化脂肪酶，而现有技术的固定化脂肪酶还无法直接在脂肪酶发酵液中直接制备，基本需要先将脂肪酶发酵液中的脂肪酶进行纯化后，再进行纯化酶的固定化。实施例证明，所述的载体经添加(NH4)2SO4的pH 7.25的Tris-HCl缓冲平衡后加入经上述缓冲透析处理后的脂肪酶发酵粗酶液上样，采用含有乙醇的Tris-HCl缓冲进行洗脱，收集脂肪酶活力洗脱峰，测定脂肪酶酶活以及蛋白含量，计算纯化过程中的参数。结果显示纯化前后脂肪酶的比活力可提升3.4~6倍，纯化过程中活性回收率可达40%~80%。

[0046] 6.本发明方法简单，易于操作，制备成本低廉，具有极大的应用价值。

附图说明

[0047] 图1 显示本发明中固定化脂肪酶和介孔TiO2的扫描电镜照片（SEM）；

[0048] 图2 显示本发明中固定化脂肪酶固定化过程中电泳图，其中泳道1：吸附前的粗酶液；泳道2：吸附后的酶液；泳道3：固定化脂肪酶解吸后蛋白溶液；泳道4：浓缩后脂肪酶粗酶液；

[0049] 图3 显示本发明中固定化脂肪酶和游离酶的最适反应温度，固定化脂肪酶（●）、游离酶（■）；

[0050] 图4 显示本发明中固定化脂肪酶和游离酶的温度稳定性（在各温度条件下分别放置1h和3h后的残余活力），固定化酶1h（▲）、游离酶1h（■）、固定化酶3h（▼）、游离酶3h（●）；

[0051] 图5 显示本发明中固定化脂肪酶和游离酶的最适反应pH，固定化酶（■）、游离酶（●）；

[0052] 图6 显示本发明中固定化脂肪酶和游离酶的pH稳定性（在各pH条件下分别放置1h后的残余活力），缓冲液为0.05M Citiric acid-citrate sodium(pH 5.0-6.0)（固定化酶（▲）、游离酶（△））、0.05M Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0-7.5)（固定化酶（◆）、游离酶（◇））、
0.05M Tris-HCl(pH 7.5-9.0)（固定化酶（■）、游离酶（□））、0.05M Glycine-NaOH（pH
9.0-10.6）（固定化酶（●）、游离酶（○））；

[0053] 图7 显示本发明中固定化脂肪酶和脂肪酶粉在乙酸肉桂酯合成中的重复利用率。

具体实施方式

[0054] 下面结合具体详细实例对本发明所采用的固定化方法及其带来的技术效果作进一步的说明，但本发明的保护范围不仅限于此：

[0055] 实施例一

[0056] 本实验说明脂肪酶粗酶液的制备过程。

[0057] 以Burkholderia ambifaria YCJ01（保藏编号CCTCC NO：M 2011058，专利公开号为CN102329745A，专利申请号为201110211402.2）为生产菌株，在装有3L发酵培养基（培养基为蛋白胨5g/L， 酵母粉5g/L，尿素5 g/L，橄榄油5ml/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4•7H2O 0.5g/L，Triton X-100 0.5mL/L）的发酵罐中，按5%的接种量接种，然后先于150rpm、30℃条件下培养12h，随后将搅拌速度提升至300rpm直至整个发酵过程结束，在发酵过程中视情况流加消泡剂防止泡沫产生，300rpm下培养48h，得脂肪酶YCJ01发酵液。将脂肪酶发酵液离心，将上清通过GE 10kDa的超滤膜在冰上超滤浓缩，制得脂肪酶YCJ01粗酶液。

[0058] 以Burkholderia cepacia RQ-3（保藏编号CCTCC NO：M 2010330，专利公开号为CN102174432A，专利申请号为201110007349.4）为生产菌株，在装有3L发酵培养基（培养基为蔗糖5 g/L，大豆粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，K2HPO4·3H2O 1.8 g/L，Tween 80 5 mL/L，橄榄油7.5 mL/L，pH8.0）的发酵罐中，按5%的接种量接种，然后先于150rpm、30℃条件下培养12h，随后将搅拌速度提升至300rpm直至整个发酵过程结束，在发酵过程中视情况流加消泡剂防止泡沫产生，300rpm下培养48h，得脂肪酶RQ-3发酵液。将脂肪酶发酵液离心，将上清通过GE 10kDa的超滤膜在冰上超滤浓缩，制得脂肪酶RQ-3粗酶液。

[0059] 以Pseudomonas stutzeri LC2-8（保藏编号CCTCC NO：M 2010279，专利公开号为CN102174422A，专利申请号为201010553292.3）为生产菌株，在装有3L发酵培养基（培养基为玉米浆15 mL/L，尿素5 g/L，葡萄糖8 g/L，玉米油5 mL/L，K2HPO4 2 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L，pH 8.0）的发酵罐中，按5%的接种量接种，在30℃、300rpm条件下发酵培养48h，在发酵过程中视情况流加消泡剂防止泡沫产生，得脂肪酶LC2-8发酵液。将脂肪酶发酵液离心，将上清通过GE 10kDa的超滤膜在冰上超滤浓缩，制得脂肪酶LC2-8粗酶液。

[0060] 将购自sigma公司的来源于Burkholderia sp.的冻干酶粉采用pH7.0的磷酸缓冲溶解，使溶液中的蛋白含量为0.5mg/ml，制得Burkholderia sp脂肪酶溶液。

[0061] 实施例二

[0062] 本实验说明介孔TiO2表面预处理过程。

[0063] 称取约2g的介孔二氧化钛粉末于250mL的圆底烧瓶中，向其中加入约100mL的浓硫酸/30%过氧化氢（V/V=70/30）的混合溶液，在90℃条件下磁力搅拌、加热回流1h，随后自然降温，将混合液离心，弃上清，再用去离子水将沉淀洗涤至中性，最后将沉淀物在120℃真空干燥箱中干燥12h，以确保完全除水，得预处理介孔TiO2。

[0064] 实施例三

[0065] 本实验说明以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0066] 称取500mg上述预处理过后的介孔二氧化钛于100mL圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，70℃预热10min，随后加入0.25mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在N2保护下加热回流8h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0067] 准确称取上述3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 100mg于100mL烧杯中，量取上述浓缩后的脂肪酶粗酶液5mL，采用50mM pH7.0磷酸缓冲液稀释到5倍后加入烧杯中，密封，将烧杯置于磁力搅拌器上30℃条件下搅拌吸附12h。随后离心，将沉淀用pH7.0的磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出。收集离心后上清与洗涤液，检测上清中的残余酶活和蛋白含量。将沉淀于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶活力为1574.86U/g，比活为80.19U/mg，固定化过程中活力回收率为85.46%。

[0068] 实施例四

[0069] 本实验说明以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0070] 称取500mg上述预处理过后的介孔二氧化钛于100mL圆底烧瓶中，加入50mL甲苯，30℃预热5min，随后加入0.05mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在N2保护下加热回流1h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0071] 准确称取上述3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 50mg于100mL烧杯中，量取上述浓缩后的脂肪酶粗酶液0.25mL，采用2.5mM pH7.0磷酸缓冲液稀释到5倍加入烧杯中，密封，将烧杯置于磁力搅拌器上20℃条件下搅拌吸附3h。随后离心，将沉淀用pH7.0的磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出。收集离心后上清与洗涤液，检测上清中的残余酶活和蛋白含量。将沉淀于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶活力为1186.75U/g，比活为91.34U/mg，固定化过程中活力回收率为75.74%。

[0072] 实施例五

[0073] 本实验说明以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0074] 称取500mg上述预处理过后的介孔二氧化钛于100mL圆底烧瓶中，加入150mL甲苯，90℃预热20min，随后加入0.5mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在N2保护下加热回流24h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0075] 准确称取上述3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 50mg于100mL烧杯中，量取上述浓缩后的脂肪酶粗酶液2.5mL，采用25mM pH7.0磷酸缓冲液稀释到5倍后加入烧杯中，密封，将烧杯置于磁力搅拌器上50℃条件下搅拌吸附36h。随后离心，将沉淀用pH7.0的磷酸缓冲液洗涤直至无蛋白检出。收集离心后上清与洗涤液，检测上清中的残余酶活和蛋白含量。将沉淀于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶活力为1374.86U/g，比活为75.19U/mg，固定化过程中活力回收率为81.47%。

[0076] 实施例六

[0077] 本实验说明以γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0078] 准确称取500mg上述预处理过后的介孔TiO2于100mL圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，70℃预热10min，随后加入0.25mmol的γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷，在N2保护下加热回流8h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0079] 准确上述γ-（2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 100mg，按照实施例三所述方法，制备固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶活力为1407.11U/g，比活力为59.55U/mg，固定化过程中活力回收率为79.15%

[0080] 实施例七

[0081] 本实验说明以3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0082] 称取500mg上述羟基化处理过后的介孔TiO2于100mL圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，70℃预热10min，随后加入0.25mmol的3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷，在N2保护下加热回流8h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0083] 准确上述3-（2-氨乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 100mg，按照实施例三所述方法制备固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶的活力为971.51U/g，比活力为91.82U/mg，固定化过程中活力回收率为72.39%。

[0084] 实施例八

[0085] 本实验说明以十六烷基三甲氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0086] 称取500mg上述羟基化处理过后的介孔TiO2于100mL圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，70℃预热10min，随后加入0.25mmol的十六烷基三甲氧基硅烷，在N2保护下加热回流8h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得十六烷基三甲氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0087] 准确上述十六烷基三甲氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 100mg，按照实施例三所述方法制备固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶的活力为922.94U/g，固定化酶比活力为43.78U/mg，固定化过程中活力回收率为70.54%。

[0088] 实施例九

[0089] 本实验说明以3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷修饰介孔TiO2以及固定化酶的制备。

[0090] 称取500mg上述羟基化处理过后的介孔TiO2于100mL圆底烧瓶中，加入100mL甲苯，70℃预热10min，随后加入0.25mmol的3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷，在N2保护下加热回流8h。反应结束后离心弃上清，将沉淀分别用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，除去没有成功反应的硅烷偶联剂。最后在70℃真空干燥箱中干燥12h，得3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷修饰的介孔TiO2。

[0091] 准确上述3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷修饰后的介孔TiO2 100mg，按照实施例三所述方法制备固定化脂肪酶。所得固定化脂肪酶活力为5344.32U/g，固定化酶比活力为416.55U/mg，固定化过程中活力回收率为129.26%。

[0092] 所制备的固定化脂肪酶与空白介孔TiO2的扫描电镜照片如图1所示，固定化过程中溶液电泳图谱如图2所示。

[0093] 实施例十

[0094] 本实验说明固定化脂肪酶在水相催化橄榄油水解反应的应用。

[0095] 以1M橄榄油作为水解反应底物，以pH7.0的磷酸缓冲液作为溶剂，并向其中添加质量百分比0.1%的阿拉伯树胶粉以及0.6%的Triton-X 100，反应体系为4mL；加入50mg固定化脂肪酶，40℃，转速180rpm条件下反应，定时取样。样品经0.1M NaOH标准溶液滴定后计算反应水解率。结果表明，在反应24h后底物橄榄油的水解率可达91.73%。

[0096] 实施例十一

[0097] 本实验说明固定化脂肪酶在非水相中合成乳酸乙酯的应用。

[0098] 以300mM的乳酸和2.4M的乙醇作为反应底物；以叔丁醇作为溶剂，反应体系为4mL；加入50mg固定化脂肪酶，40℃，转速180rpm条件下反应，定时取样。样品经pH3.0的磷酸缓冲稀释适当倍数，采用HPLC进行检测。结果表明，36h后底物乳酸的转化率可达
94.87%。上述所有试剂在使用前均需经脱水处理。

[0099] 实施例十二

[0100] 本实验说明固定化脂肪酶在非水相中合成乙酸肉桂酯的应用。

[0101] 以400mM的肉桂醇和2.4M的乙酸乙烯酯作为反应底物；以异丙醚作为溶剂，反应体系为4mL；加入50mg固定化脂肪酶，40℃，转速180rpm条件下反应，定时取样。样品经甲醇稀释适当倍数，采用HPLC进行检测。结果表明，6h后底物肉桂醇的转化率可达96.89%。经过10个批次的反应后，底物肉桂醇的转化率仍可以达到81.7%。表明固定化酶相比脂肪酶粉有着很好的催化活力和操作稳定性（图7）。

[0102] 实施例十三

[0103] 本实验说明固定化脂肪酶在非水相中拆分手性化合物的应用。

[0104] 以180mM的(R,S)-1-（2-萘基）乙醇和1.08M的辛酸乙烯酯作为反应底物；以正己烷作为溶剂，反应体系为4mL；加入50mg固定化脂肪酶，40℃，转速180rpm条件下反应，定时取样。样品经流动相（正己烷：异丙醇=85:15）稀释适当倍数，采用HPLC进行检测。结果表明，反应24h后，转化率达到50%，产物为R型乙酸-1-（2-萘基）乙酯，ees>99.9%；拆分后底物为S型1-（2-萘基）乙醇，eep>99.9%，达到了理论极限拆分效果。表明固定化酶保持了游离酶良好的对映体选择性，在手性拆分中具有良好的应用前景。

[0105] 实施例十四

[0106] 本实验说明经硅烷偶联剂疏水改性后的介孔TiO2载体在脂肪酶纯化中的应用。

[0107] 以实施例七中所制得的经3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷修饰介孔TiO2为载体，采用Tris-HCl缓冲湿法装柱，用0.05 M Tris-HCl（pH7. 5，(NH4)2SO4含量为0.7mol/L）缓冲平衡，取脂肪酶发酵粗酶液用上述缓冲做透析处理，将上述透析后的酶液上样，待未与载体结合的蛋白完全透过后，分别以含有20%乙醇和40%乙醇的pH7.5的Tris-HCl缓冲进行阶段洗脱。收取活力峰后用Tris-HCl缓冲透析处理，测定蛋白含量和脂肪酶活力，计算纯化过程中的各项参数。结果显示，纯化前脂肪酶发酵粗酶液的比活力为114.5U/mg，纯化后的脂肪酶比活力为543.2U/mg，经过一步简单过柱后，脂肪酶的比活力提升了4.74倍，纯化过程中的活性回收率为60.3%。结果表明该载体可用作一种专一性的脂肪酶纯化载体。