一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法

摘要

本发明公开了一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法。其技术方案是以冬虫夏草原草粉基因组DNA为模板，采用本发明设计的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种及其寄主蝠蛾的特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp和136bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测，确定产品的真实性。本发明可特异性识别冬虫夏草原草粉，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的真实性检测，操作简单、易于掌握、准确性高。

权利要求

1.一种冬虫夏草原草粉的鉴真方法，其特征在于：经过一次单管双重PCR同时检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因，实际扩增片断分别为320 bp和136 bp；所用于检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的引物分别为： 冬虫夏草菌种特征性持家基因扩增引物：

上游引物CICC-Oph-F1：5’-GCCAATCCCATCAACAT-3’ 下游引物CICC-Oph-R1：5’-CACCACCAACGACAAAA-3’ 冬虫夏草寄主蝠蛾特征性持家基因扩增引物：

上游引物CICC-Hep-F1：5’-GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’ 下游引物CICC-Hep-R1：5’-CAAATAATGGTATGCGGTCA-3 。

2.按照权利要求1所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于：PCR扩增反应体系为

25 μL，其中10×Taq reaction buffer 2.5 μL，浓度为10 μmol/L的4条引物各1 μL，浓度为10 μmol/L的dNTP 2 μL，2.5 U的Taq酶 0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 15 μL。

3.按照权利要求2所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5 min，进入循环：95℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，然后72℃延伸5 min。

说明书

一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法

技术领域

[0001] 本发明属于药材鉴真领域，具体涉及冬虫夏草原草粉的鉴真方法。 [0002] 冬虫夏草是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾幼虫上形成的子座及幼虫尸体的菌虫复合体，是一味名贵的中药材。为提高冬虫夏草功效成分的利用效率，目前较常见的加工方法是将其制成冬虫夏草原草粉，即不添加任何其他成分将冬虫夏草原草粉碎而成的粉末。冬虫夏草原草粉及其加工产品的鉴真研究，备受业内和广大消费者的关注，是促进冬虫夏草深加工产业转型升级的关键问题。

[0003] 目前已有利用分子生物学技术对冬虫夏草进行真伪鉴别的专利和文章，主要涉及利用PCR技术对冬虫夏草菌进行rDNA序列扩增和检测，这类方法存在以下问题：1)仅能检测样品中含有的冬虫夏草菌基因，没有对其寄主蝙蝠蛾进行检测，不能区分冬虫夏草原草粉和发酵菌丝粉；2)基于rDNA序列设计的引物特异性较低，在有近缘物种干扰时，方法的准确性和稳定性较差；3)需要对PCR产物进行序列测定，鉴别成本较高且费时费力。此前，本单位已向国家专利局提出名为“一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组DNA提取方法”的发明专利申请，申请号为“201210506674.X”，该发明提供了一种从冬虫夏草原草粉中提取高纯度基因组DNA的方法，可同时得到冬虫夏草菌及其寄主蝙蝠蛾的基因组模板，适用于双重PCR、Realtime-PCR等分子生物学分析。在此基础上尚需开发一种快速、准确、高效、可同时对冬虫夏草菌及其寄主蝙蝠蛾进行鉴定的PCR方法，实现对冬虫夏草原草粉及其加工产品的鉴真和质量控制。

[0004] 本发明的目的是提供一种可用于冬虫夏草原草粉鉴真的可靠方法。 [0005] 为达到上述目的，本发明根据冬虫夏草的组成特点，设计冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp和136bp。

[0006] 用于冬虫夏草原草粉鉴真的引物序列如下：

[0007] 冬虫夏草菌种特征性持家基因扩增引物：

[0008] 上游引物CICC-Oph-F1：5’-GCCAATCCCATCAACAT-3’

[0009] 下游引物CICC-Oph-R1：5’-CACCACCAACGACAAAA-3’

[0010] 冬虫夏草寄主蝠蛾特征性持家基因扩增引物：

[0011] 上游引物CICC-Hep-F1：5’-GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’

[0012] 下游引物CICC-Hep-R1：5’-CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’

[0013] 本发明采用的技术方案如下：

[0014] 1)获取样品基因组DNA；

[0015] 2)采用上述引物在PCR仪上进行PCR扩增；

[0016] PCR扩增反应o系为25μL，其中10×Taq reaction buffer2.5μL，4条引物(10μmol/L)各1μL，10μmol/L的dNTP2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O15μL。

[0017] PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。

[0018] 3)PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测。

[0019] 4)样品的真实性判断

[0020] 在紫外灯下查看电泳条带，在136和320bp处有明亮条带的为冬虫夏草原草，仅在320bp具有明亮条带的是冬虫夏草菌丝体产品，在136和320bp处均无条带为伪品。 [0021] 本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用一次单管多重PCR反应后，通过电泳检测便可鉴别产品真伪，操作简单，成本低，准确度高，具有很好的应用前景。

[0022] 图1和图2分别为冬虫夏草菌种MAT1-2-1基因及其寄主蝠蛾COI基因的特异性引物设计示意图，其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合位点。

[0023] 图3为PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中的电泳图谱，1-DL2000Marker，2-冬虫夏草原草粉，3-冬虫夏草菌粉，4-蝙蝠蛾拟青霉菌粉，5-蛹虫草菌粉，6-阴性对照，7-DL2000Marker。

[0024] 具体实施案例

[0025] 下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。

[0026] 实施例一：PCR引物的设计及其对样品的检测

[0027] 1PCR引物的设计

[0028] 1.1冬虫夏草菌种MAT1-2-1基因特异性引物的设计

[0029] 根据GenBank上公开登录的冬虫夏草MAT1-2-1基因序列信息进行引物设计(见图1)。

[0030] 参 考 序 列 的 GenBank 登 录 号 为：FJ654171(Ophiocordyceps sinensis，MAT1-2-1gene，complete cds，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ654171)。 [0031] 在18-34处设计上游引物，命名为CICC-Oph-F1。序列为：5’-GCCAATCCCA TCAACAT-3’。

[0032] 在 320-337 处 设 计 下 游 引 物，命 名 为 CICC-Oph-R1。 序 列 为：5’-CACCACCAACGACAAAA-3’。

[0033] 1.2冬虫夏草寄主蝠蛾COI基因特异性引物的设计

[0034] 根据GenBank上公开登录的冬虫夏草寄主蝠蛾COI基因序列信息进行引物设计(见图2)。

[0035] 参考序列的GenBank登录号为：HM595857(Ahamus yushuensis，cytochrome oxidase subunit I(COI)gene，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM595857)。 [0036] 在 346-365 处 设 计 上 游 引 物，命 名 为 CICC-Hep-F1。 序 列 为：5’-GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’。

[0037] 在461-481处设计下游引物，命名为CICC-Hep-R1。序列为：5’-CAAATAATGG TATGCGGTCA-3’。

[0038] 2样品的检测

[0039] 2.1样品的收集

[0040] 购买市售冬虫夏草原草粉、冬虫夏草菌粉、蝙蝠蛾拟青霉菌粉、蛹虫草菌粉。 [0041] 2.2样品基因组DNA提取

[0042] 采用改良CTAB法提取基因组DNA，并使用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒对其进行纯化。详细步骤参照中国发明专利201210506674.X。

[0043] 2.3基因组DNA的多重PCR扩增

[0044] PCR扩增反应体系为25μL，其中10×Taq reaction buffer2.5μL，4条引物(10μmol/L)各1μL，10μmol/L的dNTP2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O15μL。

[0045] PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。

[0046] 2.4PCR产物检测

[0047] PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，在136和320bp处出现明亮条带的为冬虫夏草原草，仅在320bp具有明亮条带的是冬虫夏草菌丝体产品，在136和320bp处均无条带为其他样品(详见图3)。