VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法及其产品

摘要

本发明公开了VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，包括以下步骤：1)脂质体复合磷脂组成与比例的确定；2)CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备：3)VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面连接即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。本发明具有高稳定性、长循环、主动靶向、高效入胞等特性，能够保证抗血管瘤药物的减毒增效。本发明的研究成果将为抗血管瘤药物的临床靶向治疗提供制剂技术平台。

权利要求

1.血管内皮生长因子受体VEGFR-2单克隆抗体与细胞穿透肽CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）脂质体复合磷脂组成与比例的确定；所述脂质体复合磷脂采用二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化大豆卵磷脂作为高相变温度磷脂，采用二棕榈酰磷脂酰胆碱以及二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱为低相变温度磷脂，两两组合制备复合磷脂脂质体，共有4种组合；

2）CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备：

a)pNP-PEG-DPPE的合成；

b)CPP-PEG-DPPE的合成：取pNP-PEG-DPPE溶于氯仿中，置茄形烧瓶中，于旋转蒸发仪上减压除去氯仿，形成脂膜，真空浓缩除尽氯仿，将Arg8、Arg10、Tat (49-57)、Tat (48-60)四种CPP，分别溶于HCl溶液中，于室温孵育30min，轻摇使脂膜充分分散；于混悬液中加入pH为9.0的10 mM的Tris缓冲液20mL，混匀，氮气保护，于4℃孵育过夜；以5kD的透析袋透析缓冲液，再用去离子水透析缓冲液，取出透析袋内溶液，冷冻干燥，即得CPP-PEG-DPPE；

c)CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备：选定含5%摩尔比的DSPE-PEG2000的复合磷脂与普萘洛尔制成普萘洛尔隐形脂质体，于37℃水浴中温浴2h，将步骤b）中合成得到的 CPP-PEG-DPPE按照5%的摩尔比定向地插入到普萘洛尔隐形脂质体的外层膜上得到CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体；

3）VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面连接即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体，连接方法如下：先将VEGFR-2单克隆抗体溶解于HEPES pH8.0缓冲液中，与6.25 mg/ml的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP溶液混合，反应生成PDP-IgG，充分反应后，超滤离心去除未偶联的SPDP及副产物，收集PDP-IgG，加入二硫苏糖醇DTT使其终浓度为50 mmol/L，搅拌25℃反应25 min，使抗体上的PDP硫醇化，形成IgG-SH；将硫醇化的抗体IgG-SH溶液与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体混合，摩尔比范围为1：1000-1：50，暗处室温搅拌过夜，超滤离心去除去未结合的IgG-SH，即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。

2.根据权利要求1所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于：在上述4种组合制备的一种复合磷脂与DSPE-PEG2000的摩尔比为95：5，得到DSPE-PEG2000复合磷脂。

3.权利要求1-2任意一项所述的制备方法得到的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体，其特征在于：VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的包封率为80%，释放度：10h的累积释放度为15%，放样稳定性：放样70d稳定，靶向效率：60%。

说明书

VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质

体的制备方法及其产品

技术领域

[0001] 本发明涉及分子克隆与生物医学领域，具体地说涉及VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法及其产品及应用。

背景技术

[0002] 血管瘤（Hemangiomas）为常见的良性肿瘤，其发病存在明显的种族及性别差异，且其在低出生体重儿和早产儿中的发病率可能更高。血管瘤对患者特别是患儿生理及心理的潜在危害不容忽视，尤其是特殊部位、特殊类型的血管瘤，必须在其增殖期采取积极的干预治疗。学者提出血管瘤发生的主要机制为促血管形成因子及抑制因子的失衡引起的。血管发生是血管瘤形成的重要因素，其主要的特征是毛细血管的内皮细胞增生。促血管形成因子中最主要的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,BFGF）被认为是促进血管内皮细胞增殖活跃的血管形成因子。在增殖期的血管瘤内皮细胞中，血管生成的分子标记物如VEGF等呈现过度表达。

[0003] 目前临床治疗血管瘤药物往往副作用较大，为了达到减毒增效的目的，靶向治疗成为目前血管瘤治疗的热点。靶向治疗的特点就在于采用载体将药物包裹，给药后在修饰材料的作用下，载体能够特异性地将药物输送到作用部位，从而实现给药效率的最大。

[0004] 大量的研究报道表面普萘洛尔是治疗血管瘤的有效药物。截止目前，已有关于应用普萘洛尔成功治疗颜面部、眼部、呼吸道、肝脏以及其他伴有并发症、多病变部位、甚至严重威胁患儿生命的重症血管瘤的大量报道，并证实了普萘洛尔能改变血管瘤的自然病史、阻滞其增殖、介导并促进IH的早期凋亡。进一步的研究表明：普萘洛尔对处于增殖期与消退期的血管瘤均有显著疗效。另外，单独使用普萘洛尔治疗血管瘤也已经被证实有确切疗效，从而消除了对其治疗效果是由其他治疗手段所主导的疑虑。诸多学者推荐其取代皮质类固醇激素成为血管瘤的一线治疗手段，中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会脉管性疾病学组也已确定普萘洛尔为治疗血管瘤的一线药物，并纳入《口腔颌面部血管瘤治疗指南》。

[0005] 普萘洛尔虽然治疗血管瘤有效，但对普萘洛尔用药可能存在的心动过缓、低血压、低血糖等严重不良反应，亦不可掉以轻心。一般而言，血管瘤患儿采取普萘洛尔治疗时应已基本形成正常的食物摄取，且在治疗初期应频繁喂食，并加强对重要生命体征与血 糖水平的监测力度，以尽量避免以上严重不良反应的发生。尤其值得注意的是，普萘洛尔用药的不良反应对于中国人来说可能有更高的发生率，因为华人对普萘洛尔的耐受能力较差，敏感性高。已有文献证明华人对β-受体阻断药的敏感性较白种人至少高2倍。普萘洛尔作为一种非选择性的β-受体阻断剂，有导致严重不良反应可能，盲目加大给药剂量往往会伴随更大的风险。此外，普萘洛尔的不良反应在很大程度上与给药途径有关，且口服给药已被证明生物利用度低（约为30%）、个体差异大，存在显著的首过效应，故真正到达患处并发挥疗效的药量有限。

[0006] 脂质体（liposomes）是目前TDDS中最受关注的载体之一，主要由磷脂和胆固醇等脂质材料组成，具有双分子层，能够包裹水溶性或脂溶性药物，在体内具有细胞亲和性和组织相容性，并且能够根据需要进行修饰。作为药物载体，脂质体在血管瘤治疗方面显示出良好的前景。

[0007] 隐形脂质体（stealth liposomes，又称为长循环脂质体）是目前抗肿瘤脂质体的主流。这种脂质体普遍采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，通过提高脂质体表面的亲水性，减少调理素（opsonin）与脂质体的结合，避免被体内免疫系统识别从而延长在循环系统中滞留的时间，增加被靶细胞识别并特异性结合的几率。

[0008] 必须指出的是，目前的主动靶向脂质体大多在脂质体表面PEG链末端进行修饰，虽然可以实现长循环和主动靶向双重效果，但是PEG链的空间位阻和强极性并不利于脂质体快速、完全地进入靶细胞。

[0009] 因此，如果单独采用VEGFR单克隆抗体修饰隐形脂质体，虽然能够实现长循环（长时间滞留在血液循环里）并且靶向结合到血管瘤病变的血管表面，但由于脂质体表面PEG链的阻碍以及血管瘤部位血管内皮细胞往往异常增殖，血管壁增厚，导致无法将脂质体内部所载药物传递进入血管瘤内部发挥作用。

[0010] 在脂质表面采用相应的抗体进行主动靶向修饰可以特异性地将药物定向输送到血管瘤部位。如果能够选出一个制造一种专一抗体的淋巴细胞进行培养，就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群，即单克隆。单克隆将合成针对一种抗原决定簇的抗体，这样的抗体成为单克隆抗体。

[0011] 由于血管形成是一个相当复杂的过程，受多种因子的正负调控，其中VEGF是作用最强的正性调控因子之一，它通过与相应的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）结合刺激新生血管的形成。VEGFR-2是分子量约210KD的Ⅲ型跨膜酪氨酸蛋白激酶，是三种血管内皮生长因子受体之一。VEGFR-2是由一个含7个免疫球蛋白样结构域的胞外区，一个跨膜区和一个带有酪氨酸激酶结构域的胞内区组成。VEGFR-2胞外区的第1个Ig结构域是VEGF配体结合所必须的，配体的结合位点在第2和第3个Ig结构域上，第4个Ig结构域是受体活化后形成同源二聚体所必须的，而其余几个Ig结构域与配体的结合并无多大关系。在增殖期的血管瘤内皮细胞中，血管生成的分子标记物如VEGF及VEGFR等呈现过度表达。

[0012] 尿素治疗血管瘤是临床最常用的方法之一。但是由于尿素治疗血管瘤缺乏靶向治疗作用，难于在瘤体内形成高浓度聚集，需多次注射治疗，使治疗周期延长，增加患者痛苦；并且由于尿素浓度过高，单位时间内用药量过大，局部注射可引起皮肤组织坏死，亦可造成邻近正常组织器官的发育畸形。以VEGFR的单克隆抗体作为偶联抗体修饰尿素脂质体，使其主动靶向作用于血管瘤的血管内皮细胞，体外实验发现，空白脂质体本身对人血管瘤内皮细胞无任何伤害作用，2.6%尿素组的细胞杀伤率为27.94%，2.6%尿素脂质体组的细胞杀伤率为84.01%，采用单克隆抗体主动修饰后的尿素免疫脂质体组的细胞杀伤率为99.91%，可见采用主动靶向修饰载体包裹尿素后，对靶细胞的杀伤作用显著提高。

[0013] 细胞穿透肽（cell-penetrating peptide,CPP）是一类能够快速穿透细胞脂质膜的小于30个氨基酸的短肽。CPP可以携带难以穿透细胞膜的大分子生物活性物质甚至纳米载体进入细胞，并且毒性低，不会损伤细胞膜，因而被广泛应用于肿瘤靶向治疗。CPP与大分子的结合物是通过能量依赖性的内吞作用进入细胞的。

[0014] CPP的应用极大地提高了从药物分子到纳米载体通过细胞膜的效率。大量研究表明，CPP具有很强大的运载潜能，关于其内化穿膜机制一直以来存在争议，但CPP与膜相互作用中，CPP所带正电荷使其易于与细胞膜中的诸如磷脂类通过静电作用相互结合。目前认为CPP穿膜作用的主要三方面机制为：A.通过静电作用直接渗透到细胞膜；B.通过易位形成的一个暂时性的结构促进渗透；C.通过内吞作用介导入膜。目前报道的主要CPP如下表所示：

[0015] 常见的细胞穿膜肽氨基酸序列

[0016]

[0017] 大量研究表明，CPP可以通过非共价键和共价键连接的方式，携带蛋白质、多肽、DNA、化学小分子物质、寡核苷酸、脂质体等物质。王薇等将八聚精氨酸（Arg8）与DPPE-PEG（二棕榈酰乙醇胺-聚乙二醇）合成Arg8-PEG-DPPE，用于修饰脂质体，结果发现：未经Arg8修饰的普通脂质体即使与肺癌细胞NCI-H446共同培养24h也不能进入细胞，而经Arg8修饰的脂质体与癌细胞共同培养1h后即有明显的细胞摄取。

[0018] CPP缺乏细胞特异性，如果采用主动靶向修饰与CPP联合修饰，可以解决这一问题，当主动靶向修饰的配体与细胞表面特异的受体结合后，隐藏在PEG链中的CPP由于与细胞膜的距离接近，也可以发挥穿膜作用，从而同样解决了细胞特异性问题，并且同时也解决了主动靶向修饰脂质体穿透细胞膜效率低下的问题。

发明内容

[0019] 发明目的：本发明的目的是提供VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，本发明的另一个目的提供前述方法获得的产品，本发明还有一个目的是提供前述方法在制备用于治疗血管瘤药物上的应用。

[0020] 技术方案：为实现上述目的，本发明的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

[0021] 1）脂质体复合磷脂组成与比例的确定；

[0022] 2）CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备：

[0023] a）pNP-PEG-DPPE的合成；

[0024] b）CPP-PEG-DPPE的合成；

[0025] c）CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备；

[0026] 3）VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面连接即得VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。

[0027] 所述脂质体复合磷脂采用二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化大豆卵磷脂作为高相变温度磷脂；采用二棕榈酰磷脂酰胆碱以及二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱为低相变温度磷脂，两两组合制备复合磷脂脂质体，共有4种组合。

[0028] 所述脂质体复合磷脂组成为二棕榈酰磷脂酰胆碱与氢化大豆卵磷脂。

[0029] 所述二棕榈酰磷脂酰胆碱与氢化大豆卵磷脂比例为6：4。

[0030] 在上述4中组合制备的一种复合磷脂与DSPE-PEG2000的摩尔比为95：5，得到DSPE-PEG2000复合磷脂。

[0031] 选定含5%摩尔比的DSPE-PEG2000复合磷脂与普萘洛尔制成普萘洛尔隐形脂质体，于37℃水浴中温浴2h，将步骤2）中合成得到的CPP-PEG-DPPE按照5%的摩尔比定向地插入到普萘洛尔隐形脂质体的外层膜上得到CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体。

[0032] 所述步骤3）VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面的连接方法如下：先将VEGFR-2单克隆抗体溶解于HEPESpH8.0缓冲液中，与6.25mg/ml的SPDP溶液混合，反应生成PDP-IgG，充分反应后，超滤离心去除未偶联的SPDP及副产物，收集PDP-IgG，加入DTT使其终浓度为50mmol/L，搅拌25℃反应25min，使抗体上的PDP硫醇化，形成IgG-SH；将硫醇化的抗体IgG-SH溶液与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体混合，摩尔比范围为1：1000-1：50，暗处室温搅拌过夜，超滤离心去除去未结合的IgG-SH，即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。

[0033] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的包封率为80%，释放度：10h的累积释放度约为15%，放样稳定性：放样70d稳定，靶向效率：60%。

[0034] 所述的制备方法得到的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体在制备用于治疗血管瘤药物上的应用。

[0035] 有益效果：本发明采用复合磷脂脂质体技术保证脂质体在血液循环中的稳定性，隐形脂质体技术实现静脉注射后载药脂质体在血液循环中的长循环效果，从而为靶向传递提供了可能；采用VEGFR-2单克隆抗体修饰载药脂质体实现主动靶向输送药物到达血管瘤部位；采用CPP修饰脂质体实现靶向输送后的高效入胞，因此本发明具有高稳定性、 长循环、主动靶向、高效入胞等特性，能够保证抗血管瘤药物的减毒增效。本发明的研究成果将为抗血管瘤药物的临床靶向治疗提供制剂技术平台。

附图说明

[0036] 图1是本发明的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰载药脂质体与靶细胞的作用机制示意图；

[0037] 图2是本发明复合磷脂比例与脂质体相变温度的数学规律图。

具体实施方式

[0038] 实施例1

[0039] 建立测定体液普萘洛尔浓度的HPLC-FID分析方法：

[0040] 采用HPLC-FID（荧光）检测法测定血液、组织以及细胞培养液中普萘洛尔的浓度。

[0041] 具体方法：以卡维地洛为内标。检测波长：激发光290nm，发射光340nm。色谱柱：C18柱（250×4.6mm，2.5μm）。生物样品加入内标溶液10微升，加入50μL饱和碳酸钠及
2.5mL的混合溶剂（正己烷-二氯甲烷-异丙醇=65:30:5）涡旋混合3min，4000rpm离心
10min，分取上清，氮气吹干，100μL甲醇复溶进样50μL测定。

[0042] 实施例2

[0043] 复合磷脂组成与比例的确定：采用二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、氢化大豆磷脂（HSPC）作为高相变温度磷脂；采用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）以及二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）为低相变温度磷脂，两两组合制备复合磷脂脂质体（共有4种组合），在加入隐形修饰材料DSPE-PEG2000的情况下比较不同组合以及相同组合下不同复合磷脂比例对普萘洛尔的载药效果并比较其在血浆中的稳定性（即普萘洛尔的泄漏率）。最终确定载药效果与稳定性俱佳的复合磷脂组成及比例用于后面脂质体的研究。得到最佳比例为：二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、氢化大豆磷脂（HSPC）作为高相变温度磷脂，摩尔比为4：6，二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）以及二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）为低相变温度磷脂，摩尔比为6：4。

[0044] 实施例3

[0045] 复合磷脂脂质体的制备：采用薄膜-超声法制备。称取磷脂材料120mg溶于10mL氯仿，置于50mL茄形瓶内60℃减压旋转蒸发形成薄膜，取出茄形瓶，于真空干燥箱中55℃放置12h。向茄形瓶中加入硫酸铵5mL，60℃旋转水合40min，所得脂质体混悬液于60℃水浴探头超声（400W，50次），1000rpm低速离心除去钛粉，采用pH7.4PBS 透析除去外水相硫酸铵，加入普萘洛尔粉末混合，60℃20min，即得。载药脂质体上葡聚糖凝胶G-50柱（内径-11cm，长度27cm），用pH7.4PBS洗脱，流速1mL·min ，上柱后收集脂质体部分和游离部分，分别测定普萘洛尔的浓度，计算包封率（%）=脂质体中药物含量/（游离药物含量+脂质体中药物含量）×100%。计算得到包封率为81.2±1.0%。

[0046] 血浆中稳定性研究：精密吸取1mL已经葡聚糖凝胶柱除去游离药物的普萘洛尔脂质体，加入含有9mL小牛血清-PBS（1:1，v/v）的释放介质中，混匀，在不同温度下恒温磁力搅拌，转速为500rpm，于不同时间点取样超速离心除去脂质体，取上清液加等体积乙腈涡旋、高速离心后测定其中普萘洛尔的浓度。以释放出的普萘洛尔的总量除以脂质体中普萘洛尔的含量计算泄漏率。计算得到泄漏率为12.4±0.5%。

[0047] 实施例4

[0048] 相变温度的测定：采用差示扫描量热分析（DSC）测定载药前后脂质体相变温度的差异，考察在不同体液中相变温度的变化。

[0049] DSC测定：称取一定量的脂质体混悬液置于不锈钢坩埚内，密封，参比坩埚内放入等量的PBS，在氮气氛围中，以1℃/min的速度从20℃升温至60℃，测定相变温度。在此基础上尝试测定普萘洛尔脂质体在血液、血管瘤组织液、血管瘤内皮细胞培养液中的相变温度，比较其变化。

[0050] 在研究中发现，陈军等在专利一种可以调节相变温度的脂质体复合磷脂及其应用中采用复合磷脂脂质体技术可以灵活调节相变温度，根据他的研究，如图2，我们对相变温度（Tm）与复合磷脂比例之间的拟合表明，测得的相变温度（绝对温度，单位为K）的倒数与复合磷脂比例（DPPC所占摩尔比）之间存在明显的线性关系。

[0051] 根据拟合的公式制备一定相变温度的复合磷脂脂质体，采用钙黄绿素释放测定相变温度，从表1可以看出，根据公式计算的预测值与实际测定值非常吻合。

[0052] 表1相变温度的预测值与实际测定值

[0053]

[0054] 实施例5

[0055] 普萘洛尔隐形脂质体的制备：以载药效果（包封率）为评价指标，在比较确定制备方法（薄膜法，乙醇注入法，逆向蒸发法和脱水-水化法等）的基础上，采用星点-效应面法优选制备工艺确定采用上述薄膜法，乙醇注入法，逆向蒸发法和脱水-水化法相结合的方法，具体制备工艺见是实施例6。

[0056] 采用葡聚糖G50凝胶柱分离载药脂质体与游离包合物，测定包封率，作为评价指标。

[0057] 确定制备方法后，采用星点-效应面法优选制备工艺，需要考察的因素有：药脂比、磷脂包合物比例、制备温度等。

[0058] 实施例6

[0059] CPP修饰隐形脂质体的工艺的考察：比较不同CPP，包括Arg8-12、Tat(49-57)、Tat(48-60)等不同穿膜肽对隐形脂质体穿膜作用影响差异；评价CPP修饰隐形脂质体的工艺。

[0060] pNP-PEG-DPPE的合成，取DPPE氯仿溶液，置于圆底烧瓶中，滴加三乙胺，将(pNP)2-PEG3400加入上述混合液中，吹入氮气，密闭，避光，于室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂，真空除尽残留氯仿，加入HCl溶液，超声处理形成透明的胶束溶液。Sepharose分离，除去未反应的(pNP)2-PEG3400和释放的pNP，收集含pNP-PEG-DPPE胶束的洗脱液，冷冻干燥，对其进行定性检查。

[0061] CPP-PEG-DPPE的合成，取pNP-PEG-DPPE溶于氯仿中，置茄形烧瓶中，于旋转蒸发仪上减压除去氯仿，形成脂膜，真空浓缩除尽氯仿，将Arg8、Arg10、Tat(49-57)、Tat(48-60)四种CPP，分别溶于HCl溶液中，于室温孵育30min，轻摇使脂膜充分分散。于混悬液中加入10mM(pH 9.0)的Tris缓冲液20mL，混匀，氮气保护，于4℃孵育过夜。以5kD的透析袋透析缓冲液，再用去离子水透析缓冲液，取出透析袋内溶液，冷冻干燥，即得CPP-PEG-DPPE。

[0062] 以选定的复合磷脂组成（含5%摩尔比的DSPE-PEG2000）制成普萘洛尔隐形脂质体，于37℃水浴中温浴2h，使CPP-PEG-DPPE定向地插入到脂质体的外层膜上，获得CPP修5
饰的普萘洛尔隐形脂质体。取对数生长期的人血管瘤内皮细胞（HEC）以l×10/孔细胞接种于24孔细胞培养瓶中，24h后吸去完全培养基，换为无血清的RPMI1640培养基培养4h，分别加入CPP修饰前后的普萘洛尔隐形脂质体37℃孵育不同时间（0.5h、1h、2h、4h、8h），用冷的D-hanks液洗涤3次除去未摄取的脂质体，将细胞破碎，测 定细胞内药物浓度并计算摄取效率。根据摄取效率确定最优CPP。根据CPP在脂质体中占总脂质成分的摩尔比不同，确定最佳CPP-PEG-DPPE用量为6%。

[0063] 取CPP修饰后的脂质体，超滤分离未结合到脂质体中的CPP-PEG-DPPE。取超滤液20μL于25mL量瓶中，加入2μg/mL9,10-菲醌荧光衍生化试剂（9,10-菲醌溶于二甲基甲酰胺，新鲜配制）2.5mL和1mol/L氢氧化钠溶于0.25mL，室温放置45min，加入1mol/L盐酸
0.25mL，用水定容至刻度，于荧光分光光度计上（激发光波长260nm，发射光波长405nm）测定荧光强度，进行线性回归，计算脂质体中CPP的摩尔含量约为6%。

[0064] 实施例7

[0065] VEGFR-2单克隆抗体的制备及其与载药CPP修饰隐形脂质体表面的连接：

[0066] VEGFR-2单克隆抗体的制备，以纯化的VEGFR-2为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，进行3次免疫注射30μg/只，采用B淋巴细胞杂交瘤融合技术，与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在50%PEG介导下融合，以常规杂交瘤技术制备获得鼠抗人VEGFR-2分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将抗VEGFR-2的杂交瘤细胞注射至BALB/c小鼠腹腔内，7-10天后抽取腹水，破碎细胞，经过Western blot识别抗原鉴定，测定VEGFR-2抗体活性，纯化VEGFR-2抗体蛋白，最终获得VEGFR-2单克隆抗体。

[0067] VEGFR-2单克隆抗体修饰载药CPP隐形脂质体，采用异型双功能试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）交联抗体与脂质体，将Anti-human VEGFR-2抗体溶解于HEPES缓冲液（pH8.0）中，与6.25mg/ml的SPDP溶液混合，反应生成PDP-IgG。充分反应后，超滤离心去除去未偶联的SPDP及副产物。收集PDP-IgG，加入二硫苏糖醇（DTT）使其终浓度为50mmol/L，搅拌25℃反应25min，使抗体上的PDP硫醇化，形成IgG-SH；将硫醇化的抗体IgG-SH溶液与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体混合（摩尔比约为1：1000），暗处室温搅拌过夜。超滤离心去除去未结合的IgG-SH，可得与VEGFR-2单克隆抗体结合的长循环脂质体即VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。

[0068] 以荧光探针罗丹明-磷脂酰乙醇胺（Rhodamine-PE，用量为磷脂总摩尔数的0.1%）标记脂质体，VEGFR-2单克隆抗体修饰载药CPP隐形脂质体在体外与人血管瘤内皮细胞共同培养，采用流式细胞仪测定，以细胞结合的荧光强度评价修饰效果，确定最合理的修饰材料用量。采用激光共聚焦显微镜观察结合效果。

[0069] 与细胞靶向结合的测定方法。人血管瘤内皮细胞（HEC细胞）生长层单层，经胰酶消化后用新鲜的培养液洗1次，吸取一定量的细胞混悬液分别与VEGFR-2单克隆抗体修饰的荧光标记的复合磷脂脂质体（修饰材料用量不同）在37℃水浴中孵育2h，孵育完毕后用冷的PBS洗3次，流式细胞仪测定与细胞结合的罗丹明荧光强度（激发光540nm，发射光625nm）。

[0070] 激光共聚焦显微镜观察。细胞种植于盖玻片上，贴壁生长至50%汇集，加入EGFR2单克隆抗体修饰的荧光标记的复合磷脂脂质体（修饰材料用量不同），置于37℃、5%CO2培养箱内培养1h，依次用PBS漂洗3次，95%乙醇固定，30%PBS甘油封片。用激光共聚焦显微镜进行图像分析。

[0071] 实施例8

[0072] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体的药剂学性质评价：

[0073] 采用原子力显微镜观察形态，采用Zetasizer测定粒径与电位，采用凝胶柱层析分离脂质体与游离包合物并计算包封率，采用透析法测定释放度，长期放样观察存放稳定性。

[0074] 外观形态的观察（原子力显微镜（AFM））：AFM实验在Seiko SPM3800N原子力显微镜上进行，工作模式采用轻敲式(Tapping Mode)模式，探针采用硅探针(NSG10,NT2MDT)，其共振频率大约为300kHz，AFM实验样品制备采用将脂质体混悬液滴在新剥离的云母片上，在室温下真空干燥24h，检测。

[0075] 粒径及表面zeta电位的测定：Zetasizer 3000HS分析仪（英国马尔文仪器有限公司），激光波长：He-Ne激光器，测试角：90度，温度：室温。

[0076] 包封率的测定。采用葡聚糖凝胶G50为填料，装柱，采用PBS为洗脱液，流速1mL/min，分别收集脂质体部分和游离的包合物部分，测定药物含量，计算包封率（EE，encapsulation efficiency）EE%=脂质体中药物含量/（脂质体中药物含量+游离药物含量）×100%。

[0077] 释放度的测定。以等渗的pH7.4的磷酸盐缓冲液为释放介质，将载药脂质体置于透析袋中，恒温磁力搅拌，于不同时间点取介质测定药物浓度同时补充新鲜介质，测定不同时间点的释放百分数。为了评价血液成分对脂质体稳定性的影响，将等体积的载药脂质体与新鲜大鼠血浆置于透析袋中测定释放度。测定10h的累积释放度为15.6±0.4%。

[0078] 放样稳定性的测定。将液态载药脂质体于4℃避光放置，测定放置不同时间点的泄漏率，泄漏率为11.5±0.8%。

[0079] 实施例9

[0080] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体的靶向分布评价：

[0081] 以荷血管瘤裸鼠为动物模型，比较普萘洛尔溶液，未经修饰的普萘洛尔隐形脂质体以及VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体静脉注射后对体内各组织（尤其是血管瘤部位）中分布的影响，计算靶向效率。靶向效率为74.3±2.8%。

[0082] 在无菌条件下手术切除患儿血管瘤组织，用组织切块机切成5mm×4mm×3mm的小块，用UW液漂洗3次，分别经皮肤切口置入所有实验裸鼠双前肢腋下，颈部及左臀部皮下组织内，每只4处。移植后每周给动物于右腿肌肉处注射雌二醇1次，每次0.1mg。于接种后45天分组。分别静脉注射普萘洛尔溶液，未经修饰的普萘洛尔隐形脂质体以及VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体，给药后取血管瘤和心、肝、脾、肺、肾、脑组织，加生理盐水制备匀浆，然后处理后测定组织中药物浓度，计算靶向效率，得到的靶向效率为86.3±3.1%。

[0083] 实施例10

[0084] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体的药效学评价：A.体外对人血管瘤内皮细胞抑制作用与机制研究；B.人血管瘤细胞内药物动力学的研究；C.对荷血管瘤裸鼠模型的药效学评价；D.对荷血管瘤裸鼠模型的安全性评价（测定肝、肾、免疫器官、血液等生理指标）。以上均以普萘洛尔溶液，未经修饰的普萘洛尔隐形脂质体作为对照。

[0085] 采用人血管瘤内皮细胞为模型，将细胞在96孔板中孵育24h（37℃,5%CO2），然后在每孔中加入普萘洛尔溶液或普萘洛尔脂质体，密闭，在37℃或42℃水浴放置15min，然后再培养细胞24h后，MTT法测定细胞活力。同法通过倒置显微镜观察肿瘤细胞的外观形态；经Hoechst33258和AO/EB染色，再通过荧光显微镜观察其细胞核形态变化；通过透射电子显微镜观察其细胞的超微结构变化，琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA的ladder；流式细胞术进行细胞凋亡率的测定和细胞周期分析。

[0086] 测定不同时间点（0.5、1、2、4、7、12h）药物在人血管瘤内皮细胞内的分布。实验中细胞与受试制剂混合后，培养不同时间后，10mL TBS(Tris-buffered saline)清洗细胞，1500×g离心5min收集肝癌细胞，沉淀加入1mL TBS液混悬，在微量离心机上混旋15s后，小心移去TBS液。沉淀加入400μL冷的buffer A(10mM HEPES pH 7.9,10mM KCl,0.1mM EDTA,0.1mM EGTA,1mM DTT,0.5mM PMSF)混悬，冰浴15min后加入25μL NP-40(0.5%)充分混匀10s。匀浆离心30s后，取上清液用于测定细胞浆中的药物浓度。 取沉淀加入50μL冰浴的buffer C(20mM HEPES pH 7.9,400mM NaCl,1mM each of DTT,EDTA,EGTA and PMSF)混悬，在旋转的摇床上振摇15min后11000×g离心5min，取上清液作为细胞核内的药物待测溶液。以上两种待测溶液处理后测定其中普萘洛尔的药物浓度。表2为不同时间点（0.5、
1、2、4、7、12h）测定的在细胞浆和细胞核中的普萘洛尔的药物浓度。

[0087] 表2不同时间点测定的在细胞浆和细胞核中的普萘洛尔的药物浓度。

[0088]时间（h） 0.5 1 2 47 12
细胞浆药物浓度μg/ml 12.5±1.2 26.7±2.4 45.1±1.8 52.7±3.871.9±5.6 80.0±2.8细胞核药物浓度μg/ml 0 8.1±2.0 11.2±7.1 20.6±1.125.6±2.5 29.3±2.4

[0089] 在无菌条件下手术切除患儿血管瘤组织，用组织切块机切成5mm×4mm×3mm的小块，用UW（the University of Wisconsin solution）液漂洗3次，分别经皮肤切口置入所有实验裸鼠双前肢腋下，颈部及左臀部皮下组织内，每只4处。移植后每周给动物于右腿肌肉处注射雌二醇1次，每次0.1mg。于接种后45天分组，分别静脉注射不同普萘洛尔受试制剂，于给药后观察并测得血管瘤形态与大小，每2d给药1次，给药15d，给药后每天肉眼观察局部血管瘤的充血情况和血管瘤体积，并于体视显微镜下观察局部血管的变化以判断疗效。

[0090] 结束给药后，取生物样品检测毒性。取血分离血清，测定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、总胆固醇（CHOL）等生化指标。按体重折算肝、肾脏器系数（脏器重g/100g体重），将肝、肾脏置于10%的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，进行组织形态学观察，肝小叶略呈六边形，结构清晰。肝细胞无变性、坏死。中央静脉周围有极少量炎细胞浸润，门管区无炎症或纤维组织增生，小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管无病变。组织形态学观察发现，肝脏与肾脏均无病变。

[0091] 实施例11

[0092] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体的安全性评价：

[0093] A.测定静脉注射途径下的过敏性；B.测定溶血性；C.测定长期毒性。以上均以普萘洛尔溶液，未经修饰的普萘洛尔隐形脂质体作为对照。

[0094] 注射过敏性评价：取体重250-300g的豚鼠，隔日肌内注射受试制剂，共3次，然后将动物均分为2组，第一组于首次注射后的第14天静脉注射受试制剂，观察并评价过敏反应，第二组于首次注射后的第21天同样静脉注射并进行观察。观察无明显过敏症状。

[0095] 溶血性评价：取2%兔血红细胞混悬液与不同体积的待试药液混合，水浴37℃放置3h，肉眼观察溶血情况。100%和0%溶血对照液分别为蒸馏水和生理盐水。结果表明隐形脂质体没有发生溶血现象。

[0096] 长期毒性评价：按抗有效剂量尾静脉注射给药于大鼠，每3天1次，共3个月，给药期间及给药结束后，逐日观察动物的一般状况，每周称体重1次，分别于给药后不同时间点，采用大鼠代谢笼收集大鼠尿液，测定尿蛋白、尿糖；用尿分析试纸定性分析尿糖、尿酮、尿胆红素、尿蛋白、尿胆原等。同时取血分离血清，测定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、总胆固醇（CHOL）等生化指标。实验结束后处死动物，按体重折算肝、肾脏器系数（脏器重g/100g体重）。将肝、肾脏置于10%的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，进行组织形态学观察，肝脏与肾脏均无病变。

[0097] 实施例12

[0098] VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体的药物动力学评价：

[0099] 比较普萘洛尔溶液，未经修饰的普萘洛尔隐形脂质体以及VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰普萘洛尔隐形脂质体静脉注射于大鼠后的体内药物动力学行为。

[0100] 健康SD大鼠，雌雄各半，200～250g，尾静脉注射给予不同普萘洛尔制剂，于给药前和给药后不同时间点取血分离血浆，处理后测定药物浓度。将血药浓度-时间数据采用DAS2.0软件进行处理，拟合房室模型并计算出相应的药物动力学参数，统计学比较分-1析。AUC0-∞为17.61±3.84μg·h·mL ，平均驻留时间MRT为3.12±1.19h，清除率CL为-1 -1 -1
0.32±0.06L·h ·kg ，表观分布容积Vss为0.49±0.34L·kg 。统计学比较显示修饰的
普萘洛尔脂质体与未经修饰的普萘洛尔脂质体比较AUC，MRT，CL均有显著性差异（P<0.05）[0101] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。