一种白子菜总咖啡酰奎宁酸的制备方法和在抗糖尿病药物或保健品中的应用

摘要

本发明公开了一种白子菜总咖啡酰奎宁酸的制备方法及其在抗糖尿病药物或保健品中的应用。该白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位以菊三七属植物白子菜(Gynura divaricata)的地上部分为原料，制备方法包括将白子菜干燥地上部分经一定浓度乙醇回流提取，滤浓缩干燥，再以盐酸水溶解，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物经低浓度乙醇复溶，经大孔树脂水乙醇梯度洗脱，富集酚酸类成分，回收溶剂，干燥，得到总咖啡酰奎宁酸有效部位。本发明制备的白子菜总咖啡酰奎宁酸对肠道碳水化合物水解酶α-葡萄糖苷酶以及糖尿病研究的重要靶标一蛋白酪氨酸磷酸酶1B均具有显著的抑制作用，可作为辅助治疗糖尿病的药物或保健品进一步研究开发。本发明为白子菜治疗糖尿病的民间应用提供了一定的科学依据，而且为开发安全、高效的新型抗糖尿病药物或保健品提供了新资源。

权利要求

1.一种白子菜总咖啡酰奎宁酸的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：将白子菜地上部分干燥和粉碎后，以乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液的质量百分比浓度为

60-100%，用量为6-10倍药材质量体积，提取次数为1-3次，提取温度为50-80℃，提取时间为1-3小时；提取液过滤，减压浓缩至无醇味，真空干燥得到粗提物粉末；粗提物粉末先用一定体积的2~5%盐酸水溶液溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物；再经低浓度乙醇水复溶，流经大孔树脂柱D101吸附，先用去离子水冲洗树脂，再用水乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为40-60%之间的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到总咖啡酰奎宁酸。

说明书

一种白子菜总咖啡酰奎宁酸的制备方法和在抗糖尿病药物

或保健品中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种从中药白子菜中提取和制备总咖啡酰奎宁酸有效部位的方法及该有效部位在治疗糖尿病药物或保健品中的应用。

背景技术

[0002] 白子菜(Gynura bicolor DC.)为菊科(Compositae)三七草属多年生草本植物，又名白背三七，主要分布于我国南方地区。白子菜在江苏、浙江、四川和福建民间，摘取其新鲜叶片或以茎叶冲茶煮水服用，对治疗糖尿病有较好的疗效。2000年江苏省中国科学院植物研究所开始引种栽培，并针对糖尿病治疗开展化学成分的研究工作。

[0003] 化学成分研究表明，白子菜主要含有生物碱类、黄酮类、脑苷脂类、有机酸以及腺苷、尿苷等其它类型的化合成分。动物药理试验证实，白子菜的水提物具有显著的降血糖活性(胡勇等，西南林学院学报，2007，27(1)：55-58；马正东等，白背三七水提取物对2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其机制，中草药，2010，41(4)，623-626)。已公开的发明专利200710084533.2，200610052502.4，201110372288.1均指出白子菜具有抗糖尿病的作用。

[0004] 在2型糖尿病的临床治疗中，糖苷水解酶抑制剂诸如α-葡萄糖苷酶、麦芽糖酶和蔗糖酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。由于α-葡萄糖苷酶与糖尿病的紧密联系，药物学家一直致力于寻找该类酶的抑制剂，以开发更多的治疗糖尿病药物。目前，已进入市场并在临床上广泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药主要有：阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)、米格列醇(miglitol)等。

[0005] 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase-1B，PTP1B)是糖尿病研究中的一个重要靶标。作为典型的非受体型PTPase家族的成员之一，PTP1B在胰岛素信号通路中通过负向调节胰岛素受体(insulin receptor)，从而达到控制血糖的作用。寻找PTP1B的特异性抑制剂，通过抑制PTP1B的活性来提高胰岛素信号通路的敏感性，对糖尿病的治疗有着重要的应用前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的是发现并提供白子菜中的抗糖尿病有效化学部位。

[0007] 为了达到上述目的，本发明提供了白子菜总咖啡酰奎宁酸的制备方法及其在制备抗糖尿病药物或保健品中的用途。

[0008] 本发明提供的白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位，以白子菜的干燥地上部分为原料，通过以下操作步骤制备得到：

[0009] (1)将白子菜地上部分干燥和粉碎后，用质量百分比浓度为60-100％乙醇溶液回流提取，料液比6～10 倍(L/kg)，提取次数为1-3次，提取温度为50-80℃，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，真空干燥得到粗提物粉末。

[0010] (2)步骤(1)所述乙醇粗提物粉末，先用一定体积的2～5％盐酸水溶液溶解，过滤后滤液用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物。

[0011] (3)步骤(2)所述乙酸乙酯萃取物再经低浓度乙醇水复溶，流经大孔树脂柱D101吸附，先用去离子水冲洗树脂，再用水乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为40-60％之间的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到总咖啡酰奎宁酸有效部位。

[0012] 以上述方法制备得到的白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位，包括以下活性成分：3，4-O-二咖啡酰奎宁酸，3，5-O-二咖啡酰奎宁酸，4，5-O-二咖啡酰奎宁酸，3，4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯，3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯，4，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。以干品重量计算，该有效部位中总酚酸的质量百分含量＞50％。

[0013] 上述白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位具有α-葡萄糖苷酶、蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂作用，可以应用于制备抗糖尿病药物或保健品。

[0014] 所述抗糖尿病药物或保健品分别为含有治疗有效剂量或功效成分的白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位在药学上可接受的载体和保健食品。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0016] 实施例1：

[0017] 取白子菜干燥地上部分300g，粉碎，用质量百分比浓度为80％的乙醇溶液3000mL在70℃下回流提取2次，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，真空干燥得到粗提物粉末；

[0018] 将上述粗提物粉末，先用一定体积的2％的盐酸水溶液溶解，过滤后滤液用500mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物。

[0019] 称取大孔吸附树脂(D101)600g，加入蒸馏水在室温下放置过夜，使树脂充分溶胀，湿法装柱，用95％乙醇流动清洗柱子至流出液与水的体积比为1∶5混合时不呈白色浑浊，然后用蒸馏水充分淋洗柱子至流出液无乙醇味，放置过夜；

[0020] 上述乙酸乙酯提取物经10％乙醇水(v/v)溶解，过滤，滤液缓缓流过上述处理和平衡过的大孔树脂柱，先用去离子水冲洗，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为40-60％之间的洗脱液，流出液经TLC展开，喷洒5％的FeCl3乙醇溶液显蓝绿色；减压浓缩收集液，冷冻干燥，得到总咖啡酰奎宁酸有效部位。以干品重量计算，该部位中总酚酸的质量百分含量＞50％。

[0021] 以上得到的总咖啡酰奎宁酸有效部位用一定体积色谱纯甲醇溶解，45μm微孔滤膜过滤，进行制备型高效液相色谱(Agilent Prep-HPLC1100)分离，色谱方法如下：

[0022] 流动相：A水(0.1％甲酸)，B乙腈；洗脱方法：等度洗脱，20％B，0-30mmin；线性洗脱，20-30％B，30-55min；线性洗脱30-20％，55-57min；流速6mL/min，室温，检测波长325nm，进样体积每次250μL， 运行时间57mins，C18柱(21.2mm ID×150mm，5μm)分离，自动馏分收集器峰触发模式收集馏分。

[0023] 分别收集馏分，减压浓缩并经高真空干燥，得到6个咖啡酰奎宁酸类化合物，根据MS和NMR数据与文献比较，鉴定它们的结构分别为：3，4-O-二咖啡酰奎宁酸(1)，3，5-O-二咖啡酰奎宁酸(2)，4，5-O-二咖啡酰奎宁酸(3)，3，4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(4)，
3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(5)，4，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(6)；除化合物3，5-O-二咖啡酰奎宁酸(2)外，其它5个咖啡酰奎宁酸衍生物均为首次从白子菜中分离得到。各化合物的结构如下所示：

[0024]

[0025] 实施例2：白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位的总酚酸含量测定(比色法)[0026] 以3，4-O-二咖啡酰奎宁酸(自制，HPLC检测其纯度＞95％)为对照品测定标准曲线，将标准品溶于丙酮-水溶液配成系列浓度，在10mL容量瓶中，加入8mL对照品溶液，加入Folin-Ciocalteau试剂0.5mL，摇匀，放置1min。再加入20％Na2SO4溶液1.5mL，摇匀，放置1h，于分光光度计在750nm处测定吸收度，绘制标准曲线。

[0027] 精确称取白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位样品，按上述方法，在750nm处测定样品吸收度。按照标准曲线计算，白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位中，以3，4-O-二咖啡酰奎宁酸计，总酚酸的质量百分含量＞50％。

[0028] 实施例3：白子菜总咖啡酰奎宁酸有效部位及其咖啡酰奎宁酸衍生物的体外降血糖活性测定

[0029] (1)对α-葡萄糖苷酶的抑制实验

[0030] α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，Type I)购于sigma公司，Infinite F50型酶标仪(Tecan，瑞士)；各单体化合物样品分别取出一定量，溶于纯甲醇中，配成浓度为100mg/mL的高浓度母液；采用96孔板筛选体系，反应体系参照文献报道的方法，稍做改动，经改进优化后的反应体系为：28μL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS，pH＝6.8)中加入α-葡萄糖苷酶(1U/mL)10μL，加入一定浓度的样品溶液2μL，37℃恒温10min，然后加入对硝苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，PNPG，
10mM in PBS)10μL，37℃恒温反应35min，于405nm波长下测定吸光度值(A值)。阿卡波糖(acarbose，拜糖平)购白德国拜耳公司，为本法的阳性对照，同时设定空白对照(只加缓冲液)和阴性对照(只加缓冲液和酶液)， 酶活性抑制率按下式计算：酶活性抑制率(Inhibitory，％)＝(A阴性对照-A样品)/(A阴性对照-A空白对照)×100％。阳性对照药品阿卡波糖(acarbose)。经计算，阳性对照阿卡波糖对的α-葡萄糖苷酶的IC50为
1.38mM。

[0031] (2)对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制实验

[0032] PTP1B酶购自于Enzo Life Science公司，所有化合物称量后配制成10mg/mL的甲醇溶液，在每孔中加入2μl而不影响酶活性。采用96孔板筛选，反应体系参照文献报道的方法，稍做改动，加入以下试剂配制成100μL的反应溶液：0.05μg PTP1B酶、1.5mM胰岛素受体βresidues(IR5)和100mM MES缓冲液(300mM氯化钠，2mM EDTA，2mM DTT，