一株耐高渗出芽短梗霉及其应用

摘要

本发明公开了一株耐高渗出芽短梗霉。所述出芽短梗霉(Aureobasidium？pullulans)ER35于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC？No.7152。该菌株能以木糖为碳源发酵生产赤藓糖醇，且副产物较少，只有少量的木糖醇和麦芽糖醇。利用该菌株发酵生产赤藓糖醇，赤藓糖醇出产量高，提高了木糖的利用率，实现了可再生资源半纤维素（木糖）的充分利用，也为赤藓糖醇生产开发提供了新原料，可有效提高木质纤维素生物转化过程的原料利用率。为木糖的合理有效利用开辟了新的途径。

权利要求

1.一株耐高渗出芽短梗霉ER35，其特征在于，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ER35，保藏号为CGMCC No.7152，所述出芽短梗霉ER35利用以木糖为碳源的发酵培养基发酵生产赤藓糖醇。

2.根据权利要求1所述耐高渗出芽短梗霉ER35，其特征在于，所述耐高渗出芽短梗霉ER35以木糖为碳源时发酵生产赤藓糖醇产量达到26g/L-34g/L，转化率达到25%-42%。

3.根据权利要求1所述耐高渗出芽短梗霉ER35，其特征在于：所述发酵培养基组成为：木糖80-160g/L、酵母浸粉15-30g/L、KH2PO40.2-1g/L、ZnSO4·7H2O0.5-1.5g/L、L-酪氨酸

2-10g/L、柠檬酸2-10g/L。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述一株耐高渗出芽短梗霉ER35，其特征在于，所述发酵培养基选择木糖母液替换发酵培养基中的木糖，所述木糖母液组成成份如下：木糖

35-40%，阿拉伯糖8-16%，半乳糖9-15%，葡萄糖8-11%，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。

5.权利要求1-3任一权利要求所述耐高渗出芽短梗霉ER35在发酵生产赤藓糖醇中的应用。

说明书

一株耐高渗出芽短梗霉及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株耐高渗出芽短梗霉及其在生产赤藓糖醇中的应用。

背景技术

[0002] 工业上赤藓糖醇主要是用耐高渗酵母和其他生产赤藓糖醇的微生物利用淀粉原料发酵生产。能够产生赤藓糖醇的菌种有木兰假丝酵母（Candida magnoliae）、球拟酵母属（Torulopsis sp.）、短梗霉菌属（Aureobasidium sp.）、耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica），此外球拟酵母属（Torulopsis）、毛孢子菌属（Trichosporum）、三角酵母属（Trigonopsis）、毕赤酵母属（Pichia）等也能够生产赤藓糖醇。由于酵母具有耐高渗环境的优良特性，适合于在高浓度糖的条件下生长，所以耐高渗酵母是生产赤藓糖醇的理想菌种，而国内及国际上工业化生产所采用的菌种主要也是耐高渗的酵母。

[0003] 中国专利申请201210187067.1公开了一株产赤藓糖醇的菌株及用其生产赤藓糖醇的方法，发明提供了一株产赤藓糖醇的菌株，其分类命名为假丝酵母（Candida sp.）SK25.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011477。用其生产赤藓糖醇的方法包括：（a）在含葡萄糖的发酵培养基中利用该菌种进行发酵；（b）从所得发酵液中分离纯化赤藓糖醇。用本发明提供的假丝酵母（Candida sp.）CCTCC No：M2011477菌株，在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中经4d的发酵，残糖可达到10%以下，发酵液中的赤藓糖醇浓度达到10%-13%，为赤藓糖醇的工业化制备提供了新的方法。

[0004] 中国专利200510102929.6公开了一种解脂假丝酵母菌及用其生产赤藓糖醇的方法，该专利涉及微生物发酵领域,具体涉及高产赤藓糖醇的解脂假丝酵母(Candida lipolytica)和利用该酵母菌株生产赤藓糖醇的方法,该方法包括:(A)在含葡萄糖的发酵培养基中利用高产赤藓糖醇的解脂假丝酵母进行发酵,以得到含有赤藓糖醇的发酵液;(B)从上述发酵液中分离纯化赤藓糖醇。

[0005] 木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，木质纤维资源的转化利用已成为必然趋势。半纤维素占木质纤维原料的20%-35%，其水解液中的主要单糖为木糖，它是自然界中含量仅次于葡萄糖的单糖，因此寻找木糖发酵的天然微生物和选育高效的木糖发酵菌株成为了研究热点。迄今为止已发现一百多种微生物能代谢木糖,包括细菌、真菌和酵母菌，主要用来生产燃料乙醇。

发明内容

[0006] 本发明提供了一株耐高渗出芽短梗霉，该菌株可发酵木糖有效生产赤藓糖醇。

[0007] 本发明的技术方案：

[0008] 一株耐高渗出芽短梗霉ER35，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ER35于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7152，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

[0009] 耐高渗出芽短霉ER35以木糖为碳源的发酵培养基发酵生产赤藓糖醇，耐高渗出芽短便霉ER35发酵赤藓糖醇产量可达到26g/L-34g/L，转化率达到25%-42%；

[0010] 所述发酵培养基以木糖为主要碳源，添加其他氮源和微量元素组成；

[0011] 优选的发酵培养基组成为：

[0012] 木糖80-160g/L、酵母浸粉15-30g/L、KH2PO40.2-1g/L、ZnSO4·7H2O0.5-1.5g/L、L-酪氨酸2-10g/L、柠檬酸2-10g/L。

[0013] 所述发酵培养基中木糖可以用木糖母液代替，组成成份（质量百分比）如下：木糖35-40%，阿拉伯糖8-16%，半乳糖9-15%，葡萄糖8-11%，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。木糖母液是木糖生产的下脚料，木糖母液为木糖生产过程中木糖结晶后留下的废液。

[0014] 有益效果：

[0015] 本发明通过紫外诱变结合耐高渗特性筛选得到耐高渗、可提高赤藓糖醇产量的出芽短梗霉突变株ER35，并且通过发酵培养基和发酵条件优化，有效提高了该突变株以木糖为碳源时的赤藓糖醇产量。应用本发明菌种可将木糖有效转化为赤藓糖醇，分别以木糖和木糖母液为碳源发酵赤藓糖醇产量可达到31.42g/L和26.35g/L,转化率分别为38.59%和25.36%；5L发酵罐木糖和木糖母液发酵赤藓糖醇产量分别可达到33.78g/L和28.46g/L,转化率分别为41.75%和28.43%本发明为木糖的有效利用开辟了新途径，也为赤藓糖醇生产开发提供了新原料，可有效提高木质纤维素生物转化过程的原料利用率。

具体实施方式

[0016] 实施例1：耐高渗、可利用木糖生产赤藓糖醇的出芽短梗霉突变株ER35的诱变筛选

[0017] 以能利用木糖的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC3.00837为出发菌株，选择致死率为85%的紫外诱变剂量（照射240s）对出芽短梗霉进行诱变，将诱变后的菌液均匀涂布于含有30g/L木糖的高渗平板上，30℃避光培养2-3d后挑选生长快、菌落大的单菌落点接于TTC固体平板上，最后获得120株颜色比较深的突变株，命名为ER1-ER120。将突变株进行赤藓糖醇发酵实验，发酵144h后测定发酵液中赤藓糖醇含量，与出发株做对照，得到一株赤藓糖醇产量明显提高的突变株ER35，赤藓糖醇产量较出发菌株提高
50.92%；转化率提高20.71%，结果见表1。出发菌株和突变株ER35赤藓糖醇耐受情况见表
2。

[0018] 表1：赤藓糖醇高产突变株与出发菌株的对比

[0019]

[0020] 表2出发菌株和突变株ER35赤藓糖醇耐受情况

[0021]

[0022] “+++”表示生长良好；“++”表示生长一般；“+”表示生长较弱；“－”表示不生长[0023] 实施例2：摇瓶发酵

[0024] 以突变株ER35为实验菌株，以木糖为碳源，通过培养基和发酵条件优化，得到优化木糖发酵培养基1为：木糖120g/L、酵母浸粉20g/L、KH2PO40.5g/L、ZnSO4·7H2O1g/L、L-酪氨酸5g/L、柠檬酸5g/L，0.1MPa灭菌15min；优化发酵条件为：接种量10%，装液量50mL/250mL，摇床转速180r/min，温度30℃，pH值6.5，培养时间为144h。也可选择木糖发酵培养基2，制备方法如下：将木糖母液稀释4倍左右，使其木糖浓度为121g/l，同时含有葡萄糖44g/L、阿拉伯糖46g/L、半乳糖18g/L，按照所述木糖发酵培养基1的组成，添加除木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖之外的其他培养基成分。

[0025] 从活化斜面上挑取一环ER35菌体接种至装有50mL一级种子培养基的250mL三角瓶中培养，30℃180r/min摇床培养12h，得一级种子液。将一级种子液以10%的接种量，接入二级种子培养基中，30℃、180r/min摇床培养14h，得二级种子液；一、二级种子培养基组成为：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L。种子液以10%接种量，接入上述木糖发酵培养基1或2中，30℃180r/min摇瓶发酵，培养144h，结果见表3。

[0026] 表3.突变株ER35摇瓶发酵实验结果

[0027]

[0028] 由表3可知，突变株ER35能够有效利用木糖生产赤藓糖醇，虽然还有少量木糖没有被利用，但相比于其它生产赤藓糖醇的菌株来说木糖的利用率还是比较高的。

[0029] 实施例3：5L发酵罐发酵

[0030] 在摇瓶发酵的基础上，通过5L发酵罐进行ER35木糖发酵产赤藓糖醇实验，考察了发酵罐培养中赤藓糖醇生产和菌体生物量情况。种子培养基和种子培养方法，木糖发酵培养基1和2组成与实施例2中相同。

[0031] 5L发酵罐发酵条件具体为：发酵罐装液量为罐容的60%，接种量10%，初始pH值为6.5，发酵温度为30℃，溶氧为60%，发酵120h。间隔一定时间取样，测定赤藓糖醇产量、残糖量和生物量，结果见表3。

[0032] 表3.突变株ER355L罐发酵实验结果