一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基

摘要

本发明涉及一种人间充质干细胞培养基。本发明的培养基，在基础培养基中添加有以下组分，各组分终浓度为：人血清白蛋白1～2g/L、转铁蛋白5～10mg/L、纤粘连蛋白2～8mg/L、层粘连蛋白1～4mg/L、Fe(NO3)3·9H2O50g/L、FeSO4·7H2O417g/L、雌二醇1～3μg/L、睾酮2～5μg/L、孕酮1～3μg/L、地塞米松39.25～117.74μg/L、胰岛素5～10mg/L、核黄素376.36mg/L、辅酶A80.96～242.87mg/L、丁二胺4.41～6.17mg/L、牛磺酸1～2mg/L、氨基乙醇0.61～1.85mg/L、丙酮酸8.81～26.42mg/L、硒酸钠3.78～7.56μg/L、L-谷氨酰胺292.3～584.6mg/L、血管内皮生长因子2～8μg/L、表皮生长因子4～10μg/L、碱性成纤维细胞生长因子4～10μg/L、白血病抑制因子1～5μg/L、胰岛素样生长因子-I1～5μg/L、干细胞因子2～8μg/L组成。本发明的培养基，不含动物血清，排除了动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒，方便应用于临床。

权利要求

1.一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于：在基础培养基中添加有以下组分，各组分终浓度分别为：人血清白蛋白1～2g/L、转铁蛋白5～10mg/L、纤粘连蛋白2～8mg/L、层粘连蛋白1～4mg/L、Fe(NO3)3·9H2O50g/L、FeSO4·7H2O417g/L、雌二醇1～3μg/L、睾酮2～5μg/L、孕酮1～3μg/L、地塞米松39.25～117.74μg/L、胰岛素5～10mg/L、核黄素376.36mg/L、辅酶A80.96～242.87mg/L、丁二胺4.41～6.17mg/L、牛磺酸1～2mg/L、氨基乙醇0.61～1.85mg/L、丙酮酸8.81～26.42mg/L、硒酸钠3.78～

7.56μg/L、L-谷氨酰胺292.3～584.6mg/L、血管内皮生长因子2～8μg/L、表皮生长因子4～10μg/L、碱性成纤维细胞生长因子4～10μg/L、白血病抑制因子1～5μg/L、胰岛素样生长因子-I1～5μg/L、干细胞因子2～8μg/L组成，还包括甲状旁腺激素35.74～

71.48ng/L、血小板源性生长因子AB0.5～2.5μg/L、转化生长因子α1～4μg/L，和/或转化生长因子β1～4μg/L；肿瘤坏死因子α0.5～2.5μg/L、白细胞介素20.5～2.5μg/L、氢化可的松0.36～1.09mg/L、非必需氨基酸10～30mg/L、大豆胰酶抑制剂1～2mg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3135mg/L、维生素C 176.13mg/L、NaHCO32.2g/L。

2.根据权利要求1所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于：所述的基础培养基为DMEM/F12。

说明书

一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人间充质干细胞培养基。

背景技术

[0002] 干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，可用于治疗白血病、先天性代谢疾病、某些实体肿瘤、糖尿病、心脏病和脑瘫等多种疾病，具有非常广阔的医疗用途，截止2012年12月，全球已开展了4178项干细胞临床实验研究，进入临床三期的项目多达602项。间充质干细胞(MSC)是目前在治疗方面最为安全有效和应用广泛的成体干细胞，主要来源于骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等。截止2013年4月，在世界范围内已经批准上市7种干细胞临床治疗产品，有5种为间充质干细胞来源。伴随着干细胞治疗快速发展，开发一种临床级的间充质干细胞培养基至关重要。

[0003] 临床级干细胞培养基首先避免使用动物来源血清。动物来源血清中存在潜在病毒感染的风险，且血清成分复杂，不容易定性研究每种成分对干细胞生长、分化的作用，且容易引起过敏反应。

[0004] 目前，市场上非常多的间充质干细胞培养基产品，缺点：1、使用动物来源血清，增加了病原体，异种抗原，批次间不稳定性。美国FDA正考虑禁止使用胎牛血清用于细胞治疗；2、干细胞容易分化，不能长期保持干性。3、未经过全套第三方病原体检测(14项检测)，不能提供全套第三方病原体检测的报告，培养的细胞存在病原体污染风险，没有达到临床级别。4、市场上可以购买到几种人间充质干细胞无血清培养基，但均为国外进口，且价格昂贵，每500ml价格在3000元以上，但培养效果却不甚理想，干细胞增值速度以及培养后干细胞表面标记物的表达均不理想。且仅供研究应用，不能用于人的诊断及治疗。

发明内容

[0005] 本发明的目的是解决现有的间充质干细胞培养基存在的上述问题，提供一种临床级人问充质干细胞无血清完全培养基。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，在基础培养基中添加有以下组分，各组分终浓度分别为：人血清白蛋白1～2g/L、转铁蛋白5～10mg/L、纤粘连蛋白2～8mg/L、层粘连蛋白1～4mg/L、Fe(NO3)3·9H2O50g/L、FeSO4·7H2O417g/L、雌二醇1～3μg/L、睾酮2～5μg/L、孕酮1～3μg/L、地塞米松39.25～117.74μg/L、胰岛素5～10mg/L、核黄素376.36mg/L、辅酶A80.96～242.87mg/L、丁二胺4.41～6.17mg/L、牛磺酸1～2mg/L、氨基乙醇0.61～
1.85mg/L、丙酮酸8.81～26.42mg/L、硒酸钠3.78～7.56μg/L、L-谷氨酰胺292.3～
584.6mg/L、血管内皮生长因子(VEGF)2～8μg/L、表皮生长因子(EGF)4～10μg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)4～10μg/L、白血病抑制因子(LIF)1～5μg/L、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)1～5μg/L、干细胞因子(SCF)2～8μg/L组成。

[0007] 所述基础培养基为DMEM/F12。

[0008] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为0.5～2.5μg/L的血小板源性生长因子AB。

[0009] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为1～4μg/L的转化生长因子α，和/或终浓度为1～4μg/L转化生长因子β。

[0010] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为0.5～2.5μg/L的肿瘤坏死因子α。

[0011] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为0.5～2.5μg/L的白细胞介素2(IL-2)。

[0012] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为0.5～2.5μg/L的促红细胞生成素。

[0013] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为35.74～71.48ng/L的甲状旁腺激素。

[0014] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为0.36～1.09mg/L的氢化可的松。

[0015] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为88.07～352.26mg/L的维生素C。

[0016] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为10～30mg/L的非必需氨基酸。

[0017] 所述的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基还包括：终浓度为1～2mg/L的大豆胰酶抑制剂。

[0018] 本发明提供了一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，DMEM/F12提供了细胞生长基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，并添加了以下物质，来替代血清的作用：1)、提供结合蛋白：结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用，如人血清白蛋白和转铁蛋白。结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。2)、添加激素：胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。胰岛素促进细胞利用葡糖糖和氨基酸，胰岛素和胰岛素样生长因子对于大多数类型细胞的存活和生长有重要作用。甲状旁腺激素可以调节细胞外液中钙离子浓度。3)、添加和各种生长因子：如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等等。4)、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤，如：纤粘连蛋白(fibronectin，FN)，是细胞外基质的粘着糖蛋白，能使细胞和细胞外基质互相粘连，铆钉细胞，同时又介导细胞运动迁移。层粘连蛋白(Laminin，LN)作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用，主要功能就是在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上，在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动，是重要的促进贴壁物质。

[0019] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基中铁含量为一般培养基的两倍，同时加入转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性，并及时被干细胞利用，促进细胞生长。

[0020] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基中添加了硒酸钠，是无血清培养基的配方常含有抗氧化剂。硒是谷胱甘肽产生的合作因子，促进过氧化物和超氧化物的水解，在代谢解毒中起重要作用。过氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培养基中过氧化物和超氧化物的累积，同时，维生素E和丙酮酸，也是过氧化物清除剂。维生素C可以抗氧化，保护细胞。

[0021] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基中添加了大豆胰酶抑制剂，是抗蛋白酶成分，起到中和作用，目的是目的的使用终止传代过程中胰蛋白酶的消化作用(胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代)。

[0022] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基中添加了辅酶A，是乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起着重要的作用，如：三羧酸循环、肝糖原积存、乙酰胆碱合成、降低胆固醇量、调节血脂含量及合成甾体物质等。

[0023] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基中添加了丁二胺，丁二胺可以合成精胺，精胺与亚精胺都存在于细菌和大多数动物细胞中，是促进细胞增殖的重要物质，使DNA分子具有更大的稳定性与柔韧性，是细胞培养液中必要组分之一。

[0024] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，该培养基添加适合人间充质干细胞快速扩增且可以保持干细胞未分化潜能的细胞因子组合：其中VEGF通过受体VEGFR-2特异性细胞内的信号级联，导致细胞增殖，迁移，生存和增加通透性；EGF和bFGF是最重要的促有丝分裂原，可促进干细胞增值；TGF-α和TGF-β是调节细胞生长和分化；TNF-α可刺激干细胞分泌VEGF、FGF2和IGF-2等；PDGF-AB是一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可调控细胞的生命活动，包括细胞的分裂、增殖等；LIF可抑制干细胞分化；
IGF-I、SCF、IL-2、EPO等分别具有不同的刺激干细胞增值和抑制分化功能。

[0025] 本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，不含动物血清，所有成分均来自人(如白蛋白、细胞因子等等)，排除了动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒，安全性高，方便应用于临床。

附图说明

[0026] 图1是采用三种不同培养基培养的人脂肪间充质干细胞的生长曲线图；

[0027] 图2是应用本发明的培养基培养的人脂肪间充质干细胞集落(P0-40×)；

[0028] 图3是应用本发明的培养基培养的人脂肪间充质干细胞(P3-100×)；

[0029] 图4是应用本发明的培养基培养的人骨髓间充质干细胞(P0-40×)；

[0030] 图5是应用本发明的培养基培养的人骨髓间充质干细胞(P3-200×)；

[0031] 图6是应用本发明的培养基培养的人脐带间充质干细胞(P0-40×)；

[0032] 图7是应用本发明的培养基培养的人脐带间充质干细胞(P3-40×)。

具体实施方式

[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。

[0034] 实施例1本发明提供的一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，组成成分及浓度如表1，将下列各组分按其各自特性用进行溶解，混合，HEPES定容，0.22μm过滤膜过滤除菌，4度保存。

[0035] 表1本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基组成成分及浓度[0036]

[0037]

[0038] 实施例2本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，经第三方质量检测，各项指标均达标，见表2：

[0039] 表2本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基第三方质量检测项目及结果

[0040]

[0041] 由表2可知，本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基，各项检测指标均合格。经检测合格的培养基方可在临床使用。

[0042] 实施例3、采用本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基培养人间充质干细胞实验(以脂肪干细胞为例说明)。

[0043] (一)脂肪干细胞的制备(与大部分文献描述相同)：实验用脂肪取自腹部吸脂手术者。无菌条件下，获得脂肪生理盐水混合物50mL，离心，PBS清洗两遍去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。0.1％胶原酶37℃恒温摇床消化60min，1500r/min，离心10min，去上层未消化的脂肪组织及油脂，沉淀重悬100um滤器过滤，再次离心，红细胞裂解液裂解红细胞5min、磷酸盐缓冲液洗涤两遍，分别应用下述三种培养基培养：

[0044] 1、传统含血清培养基(DMEM/F12+10％FBS+8ng/mlbFGF)；

[0045] 2、人间充质干细胞生长无血清培养基(品牌LONZA，货号00190632)；

[0046] 3、本发明的培养基；

[0047] 以5×104/cm2接种至T175培养瓶中。以第1次接种的细胞为0代，记作P0，细胞90％融合后0.25％胰酶消化，1∶3传代接种，第3代细胞记为P3。

[0048] (二)细胞增值速度对比：

[0049] 取生长状态良好的P3人脂肪间充质干细胞，消化制作成单细胞悬液，按5×104/2
cm接种于96孔培养板中，每孔分别加上述三种培养基100μl，同时取培养板一列加入生长培养基但不加细胞，每孔培养基为100μl，作为空白对照组。每12h取4孔，MTT比色法测570nm波长光吸收值(D570值)，连续测3天，绘制细胞生长曲线。

[0050] 方法如下：终止培养时，每孔加入MTT溶液20μl(浓缩液5mg/ml)，37℃孵育4h，吸掉上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜，室温振荡10min，选择570nm波长调空白对照组一列均值为零，在酶联免疫检测仪上测定各孔的D570值，求其平均值。以时间为横轴，D570值为纵轴绘制细胞的生长曲线，如图1。

[0051] 从图1可以看出，采用本发明的培养基培养间充质干细胞时，细胞增值速度明显优于传统含血清培养基和人间充质干细胞生长无血清培养基(品牌LONZA，货号00190632)。

[0052] (三)流式细胞术鉴定表面标志

[0053] 取P3，待细胞生长至90％融合时，0.25％胰蛋白酶常规消化收集细胞，取5
1×10(100ul)个细胞，分别加入20ul CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLA-DR抗体，混匀，避光孵育30min，PBS洗涤两次，美国Backman Clouter FC500流式细胞仪检测，检测结果如表3：

[0054] 表3三种培养基培养的人间充质干细胞免疫表型表达

[0055]

[0056] 从表3可以看出，用本发明的培养基培养的间充质干细胞，流式检测阳性标志物表达高于传统含血清培养基和人间充质干细胞生长无血清培养基，而阴性标记物表达低于传统含血清培养基和人间充质干细胞生长无血清培养基。说明本发明的培养基获得的间充质干细胞纯度高，质量好。

[0057] 实施例4采用本发明的临床级人间充质干细胞无血清完全培养基分别培养人脂肪间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞，细胞均呈现良好生长状态，增殖速度快，P0代即可形成明显的集落，如图2、图4、图6所示；经三次传代，细胞呈旋涡状生长，如图3、图5、图7所示。