甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光RT-PCR技术对病毒RNA进行定性检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，为甲型H7N9禽流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。

权利要求

1.一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列如下：甲型流感病毒通用型检测体系（5’-3’）：Infa-F1(W)：CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG，Infa-R1(W)：AGGGCATTTTGGCAAAGC，Infa-FP1(W)：FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1，RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

H7检测体系：

rH7(S)-F5：CATTCCGACAAATGCAGACAA，rH7(S)-R5：CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT，rH7(S)-FP5：FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1，RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

N9检测体系：

rH7N9(S)-F5：CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT，rH7N9(S)-R5：TGGCAYACACATTCAGATTCCT，rH7N9(S)-FP5：FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1，RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

NP（2013）检测体系：

H7N9(NP)-F1：GAGGGAACACCAACCAACAGA，H7N9(NP)-R1：GCCATAATGGTTGCTCTTTCG，H7N9(NP)-FP1：FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1，RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1。

2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒的浓度和1人份测试用量标准为：

说明书

甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种H7N9病毒的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

[0002] 2013年3-4月份，我国华东多地突发人感染禽流感疫情，多人致死，并逐渐扩散传播到多地。截至5月1日，已确诊H7N9禽流感病例127例，26人死亡，涉及北京、上海、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、山东、福建和河南等省市。研究证实，该次疫情的致病源是一种新型的基因重组H7N9型禽流感病毒。目前均为散发病例，尚未发现病例间有流行病学关联。传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。

[0003] 甲型H7N9流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。该病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因分别为H7，N9型，但其他基因片段与H9N2流感病毒同源。

[0004] 此次人感染H7N9禽流感，目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

[0005] 综上，亟需能够实现快速、有效且准确检测H7N9禽流感病毒的产品，以用于人感染H7N9禽流感疫情的防控和流行病学调查。流感病毒检测的“金标准”是病毒培养，但病毒培养操作复杂，实验室硬件要求高，周期长，阳性率低，限制了其应用。目前尚无成型的快速检测试剂盒，本文描述了一种H7N9病毒快速检测试剂盒。该试剂盒采用一步荧光RT-PCR方法，可对鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水样本中甲型H7N9禽流感病毒(2013)RNA进行定性检测，可用于临床对甲型H7N9禽流感病毒(2013)感染的辅助诊断及药物治疗效果的监测。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，以实现快速检测该病毒。

[0007] 本发明提供的一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，是对甲型H7N9流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。该试剂盒包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列分别如下：

[0008] 甲型流感病毒通用型检测体系(5’-3’)：

[0009] Infa-F1(W)：CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG，

[0010] Infa-R1(W)：AGGGCATTTTGGCAAAGC，

[0011] Infa-FP1(W)：FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1，

[0012] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

[0013] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

[0014] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

[0015] H7检测体系：

[0016] rH7(S)-F5：CATTCCGACAAATGCAGACAA，

[0017] rH7(S)-R5：CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT，

[0018] rH7(S)-FP5：FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1，

[0019] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

[0020] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

[0021] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

[0022] N9检测体系：

[0023] rH7N9(S)-F5：CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT，

[0024] rH7N9(S)-R5：TGGCAYACACATTCAGATTCCT，

[0025] rH7N9(S)-FP5：FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1，

[0026] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

[0027] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

[0028] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

[0029] NP(2013)检测体系：

[0030] H7N9(NP)-F1：GAGGGAACACCAACCAACAGA，

[0031] H7N9(NP)-R1：GCCATAATGGTTGCTCTTTCG，

[0032] H7N9(NP)-FP1：FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1，

[0033] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

[0034] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

[0035] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1。

[0036] 所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统一标准为：

[0037] Infa-F1(W) 10pmoL/μL 1.5μL，

[0038] Infa-R1(W) 10pmoL/μL 1.5μL，

[0039] Infa-FP1(W) 2.5pmoL/μL 1.5μL，

[0040] rH7(S)-F5 10pmoL/μL 1.0μL，

[0041] rH7(S)-R5 10pmoL/μL 1.0μL，

[0042] rH7(S)-FP5 2.5pmoL/μL 1.5μL，

[0043] rH7N9(S)-F5 10pmoL/μL 2.0μL，

[0044] rH7N9(S)-R5 10pmoL/μL 2.0μL，

[0045] rH7N9(S)-FP5 2.5pmoL/μL 2.0μL，

[0046] H7N9(NP)-F1 10pmoL/μL 1.5μL，

[0047] H7N9(NP)-R1 10pmoL/μL 1.5μL，

[0048] H7N9(NP)-FP1 2.5pmoL/μL 1.5μL，

[0049] RnaseP-F1 10pmoL/μL 0.5μL，

[0050] RnaseP-R 10pmoL/μL 0.5μL，

[0051] RnaseP-FP1 2.5pmoL/μL 0.5μL。

[0052] 采用上述试剂盒的检测方法为：

[0053] (6)取样本：取鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水；

[0054] (7)样本处理：利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品，根据提取试剂盒的要求，吸取待检样本至离心管，震荡混匀后进行提取操作；

[0055] (8)体系配制：引物和探针由焦碳酸二乙酯水溶解至所需浓度；

[0056] (9)检测：利用荧光定量PCR仪上机检测：

[0057] (10)结果判定：

[0058] A、对于InfA结果为阳性，H7、N9和NP结果均为阴性，判定为甲型流感病毒非H7N9型；

[0059] B、对于InfA、H7和N9结果为阳性，NP结果为阴性，判定为甲型流感病毒H7N9型；

[0060] C、对于InfA、H7、N9和NP结果均为阳性，判定为甲型流感病毒H7N9(2013)，即2013年人感染H7N9型禽流感病毒。

[0061] 本发明提供了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒和检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明采用一步法RT-PCR技术与Taqman荧光探针技术相结合，病毒RNA模板首先反转录为cDNA，然后在Taq酶的作用下对靶区域进行扩增，同时利用Taqman荧光探针技术实时监测扩增产物的累积。Taqman探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR过程中，Taq酶在延伸DNA链的同时，可通过自身的5’→3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个PCR过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。同时本发明采用人源化内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标选择人源化的基因，针对人核糖核酸酶P(RNase P)设计的引物探针，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，120分钟可以出结果，检测结果准确，为甲型H7N9流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。

附图说明

[0062] 图1为2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；

[0063] 图2为非2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；

[0064] 图3为甲型H7N2型流感病毒样本检测结果；

[0065] 图4为甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果；

[0066] 图5为试剂盒灵敏度评估(仅显示NP基因扩增曲线)。

具体实施方式

[0067] 下面对本发明的试剂盒和检测方法作进一步说明。

[0068] 实施例1

[0069] 试剂盒包括四个指标，即一个样本含四管检测，其引物和探针的浓度，体积以及核苷酸序列如下：

[0070] 1、体系(1)：甲型流感病毒通用型检测

[0071] 甲型流感病毒通用型检测引物和探针具体组成如表1

[0072] 表1通用型检测引物及探针浓度和体积

[0073]依次加入 加入成份 1人份测试用量
① Infa-F1(W)(10pmoL/μL) 1.5μL
② Infa-R1(W)(10pmoL/μL) 1.5μL
③ Infa-FP1(W)(2.5pmoL/μL) 1.5μL
④ RnaseP-F1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑤ RnaseP-R1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑥ RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) 0.5μL

[0074] 序列

[0075] 表2通用型检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列

[0076]Infa-F1(W) CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG
Infa-R1(W) AGGGCATTTTGGCAAAGC
Infa-FP1(W) FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1

[0077] 通用型检测体系内标基因引物、探针的核苷酸序列为：

[0078] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC

[0079] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA

[0080] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1

[0081] 引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScriptIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如表1，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。

[0082] 2、体系(2)：H7检测体系

[0083] H7检测体系引物及探针浓度和体积见表3

[0084] 表3H7检测体系引物及探针浓度和体积

[0085]依次加入 加入成份 1人份测试用量
① rH7(S)-F5(10pmoL/μL) 1.0μL
② rH7(S)-R5(10pmoL/μL) 1.0μL
③ rH7(S)-FP5(2.5pmoL/μL) 1.5μL
④ RnaseP-F1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑤ RnaseP-R1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑥ RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) 0.5μL

[0086] H7检测体系引物核苷酸序列如表4所示。

[0087] 表4H7检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列

[0088]rH7(S)-F5 CATTCCGACAAATGCAGACAA
rH7(S)-R5 CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT
rH7(S)-FP5 FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1

[0089] H7检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列

[0090] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC

[0091] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA

[0092] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1

[0093] 引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如上，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。

[0094] 3、体系(3)：N9检测体系

[0095] N9检测体系中的引物浓度及体积见表5

[0096] 表5N9检测体系引物浓度及体积

[0097]

[0098]

[0099] 表6N9检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列

[0100]rH7N9(S)-F5 CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT
rH7N9(S)-R5 TGGCAYACACATTCAGATTCCT
rH7N9(S)-FP5 FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1

[0101] N9检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列

[0102] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC

[0103] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA

[0104] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1

[0105] 引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScriptIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如上，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。

[0106] 4、体系(4)：NP(2013)，即H7N9禽流感病毒(2013)检测体系

[0107] NP(2013)检测体系引物及探针浓度和体积见表7

[0108] 表7NP(2013)检测体系引物及探针浓度和体积

[0109]依次加入 加入成份 1人份测试用量
① H7N9(NP)-F1(10pmoL/μL) 1.5μL
② H7N9(NP)-R1(10pmoL/μL) 1.5μL
③ H7N9(NP)-FP1(2.5pmoL/μL) 1.5μL
④ RnaseP-F1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑤ RnaseP-R1(10pmoL/μL) 0.5μL
⑥ RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) 0.5μL

[0110] NP(2013)检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列：

[0111] H7N9(NP)-F1 GAGGGAACACCAACCAACAGA

[0112] H7N9(NP)-R1 GCCATAATGGTTGCTCTTTCG

[0113] H7N9(NP)-FP1 FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1

[0114] NP(2013)检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列：

[0115] RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC

[0116] RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA

[0117] RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1

[0118] 实施例2应用实施例1的试剂盒检测甲型H7N9流感病毒的方法如下：

[0119] 1、取样本：

[0120] 人鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰、胸水。

[0121] 2、样本处理：

[0122] 利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品。根据提取试剂盒的要求，吸取待检样本至1.5ml离心管(无菌/RNase-Free)，震荡混匀后进行提取操作，具体操作参见该试剂盒说明书。建议使用QIAGen RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒(catalog#74104)。

[0123] 3、配制反应体系

[0124] 按实施例1配制反应体系。

[0125] 4、上机检测

[0126] 取样本提取液各分别加入四组反应管中，低速离心数秒后，加入ABI7500荧光定量PCR仪中，

[0127] 根据表8操作条件进行反应。

[0128] 表8PCR反应条件

[0129]

[0130] 样本推荐摆放位置如表9所示。

[0131] 表9推荐样本摆放位置

[0132]名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
InfA ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ STD NTC
H7 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ STD NTC
N9 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ STD NTC
NP(2013) ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ STD NTC

[0133] 注：①至⑩代表样本；STD代表阳性质控品，阳性质控品为灭活的病毒培养物；NTC代表阴性质控品

[0134] 五、结果判定

[0135] 根据每个反应管结果是阳性还是阴性，按表10进行判断。

[0136] 表10不同反应结果病毒类型判断标准

[0137]

[0138] 实验例

[0139] 为考察实施例1试剂盒按实施例2的方法进行检测，其特异性和灵敏度，进行如下实验。

[0140] 实施例(一)

[0141] 选择2例2013H7N9型禽流感病毒，1例非2013H7N9型禽流感病毒，1例甲型H7N2流感病毒，1例甲型H1N1(2009)流感病毒，1例甲型H3N2流感病毒，1例季节性H1N1流感病毒咽拭子样本进行检测。为了验证检测方法的特异性，收集乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本，对该方法的特异性进行验证。

[0142] 检测方法如上所述，检测结果如下：

[0143] (1)2013H7N9型禽流感病毒样本四个检测指标，即MP，HA，NA，NP均为阳性。

[0144] (2)非2013H7N9型禽流感病毒样本MP，HA，NA检测阳性，NP检测阴性。

[0145] (3)甲型H7N2型流感病毒样本MP，HA检测阳性，NA和NP检测阴性。

[0146] (4)甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本仅MP检测阳性，HA，NA，NP检测阴性。

[0147] (5)乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本检测四个指标，即MP，HA，NA，NP均为阴性。

[0148] 上述检测结果证明了该方法的准确性和特异性。

[0149] 实施例(二)

[0150] 取较高浓度2013H7N9型禽流感病毒培养物(灭活后)，将其浓度稀释至如下梯5 5 4 3 3
度：5.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，1.0×10PFU/mL，
2 5 5
1.0×10PFU/mL，然后利用上述方法进行检测。结果5.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，
4 3 3
2.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，1.0×10PFU/mL浓度样本四个基因指标检测均为阳性，
2 3
1.0×10PFU/mL浓度样本检测阴性。所以该方法的最低检出限为1.0×10PFU/mL。

[0151] 图1为2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果，图中左边4条S型曲线与右边四条S型曲线分别代表2例2013H7N9型禽流感病毒样本的MP，HA，NA，NP基因检测结果。平直线为阴性质控的检测结果，显示无扩增。

[0152] 图2为非2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果，图中S型曲线分别代表非2013H7N9禽流感病毒的MP，HA，NA基因检测结果，平直线代表NP基因和阴性质控的检测结果，显示无扩增。。

[0153] 图3为甲型H7N2型流感病毒样本检测结果，图中S型曲线分别代表M和HA基因检测结果，平直线为NA，NP基因和阴性质控的检测结果，显示无扩增。

[0154] 图4为甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果。S型曲线分别代表甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒M基因阳性扩增结果，平直线为HA，NA、NP基因和阴性质控，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果，显示无扩增。

[0155] 图5为试剂盒灵敏度评估(仅显示NP基因扩增曲线)。将高浓度2013H7N9型5 5 4
禽流感病毒培养物进行稀释，结果5.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，2.0×10PFU/mL，
3 3 2
2.0×10PFU/mL，1.0×10PFU/mL浓度样本四个基因指标检测均为阳性，1.0×10PFU/mL浓
3
度样本检测阴性。显示该方法的最低检出限为1.0×10PFU/mL。