用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗

摘要

本发明公开了用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗，将弓形虫缓殖子上的三个抗原基因SAG2C、SAG2D和SAG2X分别插入到真核载体pVAX1上，获得重组质粒pVAX1-SAG2C,pVAX1-SAG2D,pVAX1-SAG2X，将这三种重组质粒混合获得重组DNA疫苗。本发明采用DNA疫苗对BALB/c小鼠进行主动免疫后，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数小鼠弓形虫攻击实验后大脑中包囊的数量来评估疫苗的免疫保护性。本发明的DNA疫苗可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，有效地降低免疫小鼠在接受弓形虫PRU株（II型）攻击后大脑包囊的形成率。该疫苗可作为预防弓形虫慢性感染，控制宿主脑组织中包囊形成的有效候选疫苗。

权利要求

1.用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗，其特征在于：将弓形虫缓殖子上的三个抗原基因SAG2C、SAG2D和SAG2X分别插入到真核载体pVAX1上，获得重组质粒pVAX1-SAG2C,pVAX1-SAG2D,pVAX1-SAG2X，将三种重组质粒混合后获得重组DNA疫苗；是通过以下方法制备得到的：以弓形虫基因组作为模板，通过聚合酶链反应扩增获得SAG2C,SAG2D,SAG2X基因片段,并插入载体pVAX1的BamHⅠ和XbaⅠ位点间,产生pVAX1-SAG2C，pVAX1-SAG2D，pVAX1-SAG2X重组质粒，提取质粒并纯化，获得重组DNA疫苗；将三种质粒等质量混合，获得混合的重组DNA疫苗；

所述聚合酶链反应扩增所用的引物如下：

SAG2C:P15’-GC GGATCC ATGGTTCTGGCCTTGTCTCTTGC-3’；

P25’-GT TCTAGA TTAAACATATTCCCTGCCACCAA-3’；

SAG2D:P15’-GCGGATCCATGTTGAAGCTTCTGACCCAAAGA-3’；

P25’-GT TCTAGA TTACATATTCCCTGTCACCAATGC-3’；

SAG2X:P15’-GCGGATCC ATGTGGAGACTGCACACTCAACTG-3’；

P25’-GT TCTAGATTAATAATTTCCCTGTCGCCGTC-3’。

说明书

用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于弓形虫缓殖子抗原，用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗。

背景技术

[0002] 弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病。人食用被包囊污染的生的或未煮熟的肉以后，缓殖子会侵入肠上皮细胞，分化成快速增长的速殖子的形式，并传播到整个身体造成严重的急性症状。而包囊会规律的破裂或裂解宿主细胞并再次入侵其他细胞。由此在导致的慢性感染的宿主大脑中引起强烈的炎症反应进而形成胶质结节，宿主终身携带，可引起脑炎、癫痫和精神异常。因此，研制针对缓殖子时期抗原的新疫苗是非常迫切和必要的。

[0003] SAG2C，-2D，-2X主要表达于弓形虫的缓殖子上的特异性表面抗原，对于弓形虫包囊的形成有重要的作用。在这项研究中，我们构建了真核表达质粒pVAX1-SAG2C，pVAX1-2D，pVAX1-2X DNA疫苗，并观察这些DNA疫苗单独或混合肌肉注射免疫BALB/c小鼠的免疫原性和小鼠抗PRU株弓形虫（II型株，易形成包囊的虫株）攻击的保护效果。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术，本发明提供了一类编码弓形虫缓殖子特异性表面抗原SAG2CDX的DNA疫苗，可用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 用于预防人或动物慢性弓形虫病的DNA疫苗，将弓形虫缓殖子上的三个抗原基因SAG2C（序列如序列表中序列1所示）、SAG2D（序列如序列表中序列2所示）和SAG2X（序列如序列表中序列3所示）分别插入到真核载体pVAX1上，获得重组质粒pVAX1-SAG2C,pVAX1-SAG2D,pVAX1-SAG2X，这三种重组质粒单独构成重组DNA疫苗或将三种重组质粒混合后获得重组DNA疫苗。本发明的疫苗，可用于预防人或动物弓形虫慢性感染，控制宿主脑组织中包囊形成的有效候选疫苗。

[0007] 本发明的编码弓形虫缓殖子特异性表面抗原SAG2C，SAG2D，SAG2X的DNA疫苗，疫苗采用单独或混合的形式对BALB/c小鼠进行肌肉注射免疫。通过测定细胞和体液免疫反应指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数弓形虫攻击实验后小鼠大脑中包囊的数量来评估疫苗的免疫保护性。结果表明与对照组相比，各种DNA疫苗均能有效的加强体液免疫和细胞免疫反应，尤其是混合免疫组，更能有效地降低免疫小鼠在弓形虫PRU株（II型）攻击后大脑包囊的形成率。本发明的突出效果是：该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成的有效的候选疫苗。

[0008] 本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫原性的方式为：将DNA疫苗经肌肉注射免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周，分别于第1次免疫前和免疫后2周，第2次免疫后2周和4周，于免疫鼠眼内眦静脉取血，分离血清，通过测定血样中的IgG及细胞因子来评估该疫苗的的免疫原性。

[0009] 本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫保护性的方式为：小鼠于末次免疫后4周，用II型弓形虫PRU虫株包囊30个攻击。8周后处死小鼠，无菌条件下取脑，物理研磨制备脑组织匀浆液。显微镜下包囊计数。通过比较实验组和对照组小鼠脑的包囊数来评价疫苗的免疫保护性。

[0010] 本发明是针对编码特异性表达在缓殖子时期的抗原基因疫苗，目的在于减少脑组织内包囊的形成。另外，攻击实验所选择的弓形虫虫株是弓形虫II型弱毒株PRU株，其在宿主体内容易形成包囊，采用经口给予30个包囊来模拟弓形虫慢性感染过程。

附图说明

[0011] 图1：编码弓形虫缓殖子SAG2CDX的DNA疫苗的构建。以弓形虫基因组获作为DNA模板，通过聚合酶链反应扩增获得SAG2C,SAG2D,SAG2X基因片段,并插入载体pVAX1的BamHⅠ和Xba Ⅰ位点间,产生pVAX1-SAG2C，pVAX1-SAG2D，pVAX1-SAG2X。

[0012] 图2：重组质粒的凝胶电泳成像示意图，其中，A：pVAX1/SAG2C重组质粒的凝胶电泳成像示意图；B：pVAX1/SAG2D重组质粒的凝胶电泳成像示意图；C：pVAX1/SAG2X重组质粒的凝胶电泳成像示意图。凝胶电泳成像显示由相应限制性内切酶消化的重组质粒。

[0013] 图3：免疫鼠血清中抗弓形虫免疫球蛋白(Ig)含量的测定。分别在第0,14,35,49天免疫鼠内眼眦取血法取血,分离血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白（Ig）的含量。如图所示，在两次免疫接种后，与对照组，PBS和pVAX1组相比，疫苗免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第35天和第49天，DNA疫苗pSAG2C，pSAG2D，pSAG2X免疫组小鼠中均检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体（P<0.05）。特别是三种质粒pSAG2C/pSAG2D/pSAG2X混合免疫组的小鼠血清中检测到更高水平的弓形虫特异性IgG抗体（P<0.01）。

具体实施方式

[0014] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0015] 本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

[0016] 实例1.弓形虫缓殖子抗原DNA疫苗的构建

[0017] 根据弓形虫的基因序列，设计合成引物如下：

[0018] SAG2C:P15’-GC GGATCC ATGGTTCTGGCCTTGTCTCTTGC-3’；

[0019] P25’-GT TCTAGA TTAAACATATTCCCTGCCACCAA-3’；

[0020] SAG2D:P15’-GCGGATCCATGTTGAAGCTTCTGACCCAAAGA-3’；

[0021] P25’-GT TCTAGA TTACATATTCCCTGTCACCAATGC-3’；

[0022] SAG2X:P15’-GCGGATCC ATGTGGAGACTGCACACTCAACTG-3’；

[0023] P25’-GT TCTAGATTAATAATTTCCCTGTCGCCGTC-3’；如序列表中序列4-9所示。

[0024] 以弓形虫基因组作为模板，通过聚合酶链反应扩增获得SAG2C,SAG2D,SAG2X基因片段,并插入载体pVAX1的BamHⅠ和XbaⅠ位点间,产生pVAX1-SAG2C，pVAX1-SAG2D，pVAX1-SAG2X重组质粒（如图1所示）。重组质粒经酶切，PCR和测序鉴定。用质粒大提试剂盒大量提取质粒并纯化，获得弓形虫缓殖子抗原DNA疫苗。结果如图2所示，凝胶电泳显示重组质粒的构建和鉴定。将三种质粒等质量混合，即获得混合疫苗。

[0025] 实例2.BALB/c鼠的免疫接种

[0026] SPF级雌性BALB/c鼠(6-8周)购自山东大学实验动物中心。60只小鼠随机分成6组，实验组每组小鼠经后腿肌肉注射100μl重组质粒(1μg/μl)（对于混合疫苗组而言，三种质粒各100μg），对照组注射免疫100μg空质粒和100μl PBS。小鼠共免疫两次，间隔三周。

[0027] 实例3.免疫鼠体液免疫水平的测定

[0028] 分别在第0,14,35,49天小鼠内眼眦取血法取血,血样先在室温下静置3h,然后3000rpm，离心30min，收集血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白（Ig）的含量。结果如图3所示。在两次免疫接种后，与对照组，PBS和pVAX1组相比，疫苗免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第35天和第49天，DNA疫苗pSAG2C，pSAG2D，pSAG2X免疫组小鼠中均检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体（P<0.05）。特别是三种质粒pSAG2C/pSAG2D/pSAG2X混合免疫组的小鼠血清中检测到更高水平的弓形虫特异性IgG抗体（P<0.01）。

[0029] 实例4.免疫鼠细胞因子水平测定

[0030] 在末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液。使用红细胞裂解缓冲液除去脾细胞中的红细胞后，重悬于含有10％FCS，100U/ml青霉6
素和100U/ml链霉素的DMEM培养基中，调整细胞悬浮液的浓度为5×10 个细胞/ml，刺激
24小时后收集细胞上清液并测定白细胞介素-2（IL-2）的浓度，刺激72小时后收集上清液测IL-10浓度。IL-2，IL-10浓度的测定使用相应的ELISA试剂盒。（表1）。

[0031] 表1.ELISA法测脾细胞培养上清的细胞因子（mean±SD，n=3）

[0032]* **

[0033] P<0.05, P<0.01,和对照组相比。

[0034] 结果表明，pSAG2C，pSAG2D，和pSAG2X DNA疫苗免疫组的小鼠脾细胞培养上清液中检测出大量的IL-2，明显高于对照组（P<0.05）。尤其是三种DNA疫苗混合免疫组小鼠血清中检测出最高水平的IL-2表达。然而，IL-10细胞因子的水平在免疫组和对照组间没有显着差异（P>0.05）。提示该DNA疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答。

[0035] 实例5.DNA疫苗免疫保护性研究

[0036] 末次免疫后4周，免疫小鼠进行攻击实验。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊30个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混均，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS或pVAX1组相比，pSAG2C，pSAG2D，pSAG2X免疫组的小鼠脑中检测到包囊数量显著减少（P<0.05）。尤其是混合免疫组小鼠脑中的包囊的数量减少到263±50，明显少于单基因免疫组（表2）（P<0.01）。

[0037] 表2免疫鼠经弓形虫包囊攻击后脑中形成包囊的数量

[0038]

[0039] *P<0.05,**P<0.01,和对照组比较。

[0040] 综上所述，编码缓殖子特异性抗原SAG2C，-2D，-2X的基因疫苗单独或者混合均可以有效的诱导小鼠产生有效的体液和细胞免疫应答。混合疫苗（pSAG2C+pSAG2D+pSAG2X）免疫不仅可以更成功地提升体液免疫和细胞免疫反应，而且更为有效的包护免疫小鼠对弓形虫包囊的攻击，减少免疫小鼠的大脑包囊形成的数量，优于单基因疫苗的免疫效果。该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成的有效的候选疫苗，用于人和动物弓形虫病的预防。