表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用转让专利
申请号 : CN201310164451.4
文献号 : CN103255151B
文献日 : 2014-12-03
发明人 : 陈伟 , 张弓 , 熊盛 , 金静洁
申请人 : 暨南大学
摘要 :
本发明公开一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用。该编码序列如SEQ ID NO.1所示。该编码序列用于CVN突变体，包括如下步骤：将上述编码核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体。该编码序列显著促进了CVN在大肠杆菌中的可溶性表达，CVN突变体在大肠杆菌中可溶性表达的量显著高于野生型CVN。此外，由该编码序列得到的CVN突变体的体外抗流感病毒活性要好于野生型CVN，说明通过翻译暂停理论对蛋白质编码核苷酸序列理性设计和优化，不仅能够提高CVN的表达量，更为重要的是显著促进CVN可溶性表达，得到生物活性更好的CVN蛋白。
权利要求 :
1.一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列，其特征在于：如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于：由权利要求1所述的编码序列制备得到。
3.根据权利要求2所述的表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于通过如下方法制备得到：将权利要求1所述的编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体。
4.根据权利要求3所述的表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于：所述的表达载体为pET-28b；所述的宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
5.权利要求1所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，其特征在于包含如下步骤：(1)设计如下的引物：
F-sumo：5’-GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’；
R-CVN：5’-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’；
F1-mutant：5’-GACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3’；
R1-mutant：5’-GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3’；
(2)第一次PCR扩增：以pET-3c-SUMO-CVN质粒为模板，以F-sumo/R-CVN为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后使用NdeI和SalI双酶切；将双酶切后的PCR产物与经过NdeI和SalI双酶切的载体pET-28b，连接；连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN；
(3)第二次PCR扩增：以pET-28b-CVN为PCR扩增模板，F1-mutant/R1-mutant为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN-M1；
(4)诱导表达：将重组载体pET-28b-CVN-M1转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达菌株；
接着使用含有卡那霉素的LB培养基对该表达菌株于37℃、180～200rpm的条件下进行培养，在OD600＝0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导表达4h后，收集菌体；
(5)纯化：将菌体沉淀按体积比1：10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清；上清上样Ni-NTA亲和层析柱中，首先使用NTA-10缓冲液洗回基线，再用NTA-40缓冲液洗杂蛋白，最后用NTA-200缓冲液洗脱，得到目的蛋白CVN突变体；其中，NTA-10缓冲液的组成为20mmol/LTris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+10mmol/L咪唑，NTA-40缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑，NTA-200缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+200mmol/L咪唑。
6.根据权利要求5所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR条件为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸2min，进行28个循环；68℃延伸5min；
步骤(3)中所述的PCR条件为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、
68℃延伸12min，进行18个循环；68℃延伸5min；
步骤(4)中所述的卡那霉素的终浓度为50mg/L；
步骤(5)中所述的离心的条件为4℃、25000g、30min。
7.权利要求2所述的表达量高和活性强的CVN突变体在制备预防和/或治疗抗病毒药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的表达量高和活性强的CVN突变体在制备预防和/或治疗抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述的病毒为流感病毒或艾滋病毒。
说明书 :
表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用。
背景技术
[0002] 蓝藻抗病毒蛋白N（cyanovirin-N，CVN）是Boyd等1997年在蓝藻中发现的一种抗病毒蛋白，能特异、高亲合性地结合与病毒表面衣壳蛋白gp120上的甘露寡糖结合，阻止病毒与宿主细胞表面的受体结合，并阻止病毒在感染细胞和正常细胞之间的传播，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，不易引起耐药性。CVN蛋白低浓度（0.1～36.8nM）能有效抑制HIV感染免疫细胞，高浓度（45～400nM）对正常细胞无直接的毒副作用。
[0003] 除HIV外，CVN对流感病毒、疱疹病毒和副流感病毒等都有拮抗作用，是一种作用广谱、高效、非常有应用价值的抗病毒候选药物，备受关注。但是，CVN的大规模制备一直是限制其应用的瓶颈技术。目前报道CVN在大肠杆菌中都是以包涵体形式表达，受到表达量低、产物不均一、错误修饰等多种因素限制（Mori,T.,Gustafson,K.R.,Recombinant Production of Cyanovirin-N,a Potent Human Immunodeficiency Virus-Inactivating Protein Derived from a Cultured Cyanobacterium.Protein Expression and Purification,1998,151-158）；也有人尝试在转基因植物中表达CVN，但是没有建立可实施的纯化工艺(Sexton,A.,Drake,P.M.,Mahmood,Transgenic plant production of Cyanovirin-N,an HIV microbicide.2006,Vol.20pp.356-358)。
[0004] 传统生化理论“安芬森原则”认为，蛋白质的折叠信息由其氨基酸序列在一定环境下唯一决定（Taniuchi H.,D.R.Davies,and C.B.Anfinsen,A comparison of the x-ray diffraction patterns of crystals of reconstituted nuclease-T and of native staphylococcal nuclease.J Biol Chem,1972.247(10):p.3362-4）。但本发明人的研究指出，这一传统理论有误。不同的DNA虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度（翻译速度）并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停（translational pausing或translational attenuation）翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。也就是说，蛋白质空间构象不仅由氨基酸的序列决定，也由核苷酸序列决定。（Zhang G.,M.Hubalewska,and Z.Ignatova,Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding.Nat Struct Mol Biol,2009.16(3):p.274-80.；Zhang G.and Z.Ignatova,Folding at the birth of the nascent chain:coordinating translation with co-translational folding.Curr Opin Struct Biol,2011.21(1):p.25-31.）。这一理论适用于蛋白组中绝大部分蛋白质（Zhang,G.and Z.Ignatova,Generic algorithm to predict the speed of translational elongation:implications for protein biogenesis.PLoS One,2009.4(4):p.e5036.；Fedyunin,I.,et al.,tRNA concentration fine tunes protein solubility.FEBS Lett,2012.586(19):p.3336-40.）。
发明内容
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列。
[0006] 本发明的另一目的在于提供通过上述编码序列得到的CVN突变体。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述的表达量高和活性强的CVN突变体的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列，如下所示：
[0009] CTTGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGAAAACGTTGACGGTTCTCTGAAATGGCAGCCGTCTAACTTCATCGAAACCTGCCGTAACACCCAGCTGGCTGGTTCCTCTGAACTGGCTGCTGAATGCAAAACCCGTGCTCAGCAGTTCGTTTCTACCAAAATCAACCTAGACGACCATATAGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAA。
[0010] 一种表达量高和活性强的CVN突变体，由上述编码序列制备得到；
[0011] 所述的的表达量高和活性强的CVN突变体，通过如下方法制备得到：将上述编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体；
[0012] 所述的表达载体优选为pET-28b；
[0013] 所述的宿主细胞优选为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）；
[0014] 所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，包含如下步骤：
[0015] （1）设计如下的引物：
[0016] F-sumo：5’-GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’；
[0017] R-CVN：5’-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’；
[0018] F1-mutant：5’-GACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3’；
[0019] R1-mutant：5’-GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3’；
[0020] （2）第一次PCR扩增：以pET-3c-SUMO-CVN质粒为模板，以F-sumo/R-CVN为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后使用NdeI和SalI双酶切；将双酶切后的PCR产物与经过NdeI和SalI双酶切的载体pET-28b，连接；连接产物转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN；
[0021] （3）第二次PCR扩增：以pET-28b-CVN为PCR扩增模板，
[0022] F1-mutant/R1-mutant为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN-M1；
[0023] （4）诱导表达：将重组载体pET-28b-CVN-M1转入大肠杆菌BL21（DE3），得到表达菌株；接着使用含有卡那霉素的LB培养基对该表达菌株于37℃、180～200rpm的条件下进行培养，在OD600=0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导表达4h后，收集菌体；
[0024] （5）纯化：将菌体沉淀按体积比1：10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清；上清上样Ni-NTA亲和层析柱中，首先使用NTA-10缓冲液洗回基线，再用NTA-40缓冲液洗杂蛋白，最后用NTA-200缓冲液洗脱，得到目的蛋白CVN突变体；其中，NTA-10缓冲液的组成为20mmol/LTris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+10mmol/L咪唑，NTA-40缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑，NTA-200缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+200mmol/L咪唑；
[0025] 步骤（2）中所述的PCR条件优选为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸2min，进行28个循环；68℃延伸5min；
[0026] 步骤（3）中所述的PCR条件优选为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸12min，进行18个循环；68℃延伸5min；
[0027] 步骤（4）中所述的卡那霉素在LB培养基中的终浓度优选为50mg/L；
[0028] 步骤（5）中所述的离心的条件优选为4℃、25000g、30min；
[0029] 所述的表达量高和活性强的CVN突变体在制备预防和/或治疗抗病毒药物中的应用；
[0030] 所述的病毒指的是流感病毒或艾滋病毒。
[0031] 本发明的创新性在于根据蛋白质结构域和翻译暂停之间的关系，利用翻译暂停理论对CVN的核苷酸序列进行合理优化和设计，在CVN的结构域中引入翻译暂停位点，构建了CVN的突变体，促进了CVN在大肠杆菌中的可溶性表达，最终纯化出了重组蓝藻抗病毒蛋白；并通过抗流感病毒实验证明了所制备的重组蛋白具有良好的抗病毒活性。
[0032] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0033] （1）本发明提供的编码CVN突变体的核苷酸序列提高了CVN在大肠杆菌中的表达水平；特别是促进CVN在大肠杆菌中的可溶性表达，CVN突变体在大肠杆菌中可溶性表达的量显著高于CVN。
[0034] （2）本发明提供的CVN突变体的体外抗流感病毒活性要好于CVN。说明通过翻译暂停理论对蛋白质核苷酸序列理性设计和优化，不仅能够提高CVN的表达量，更为重要的是显著促进CVN可溶性表达，得到生物活性更好的CVN蛋白。
附图说明
[0035] 图1是CVN-M1翻译暂停曲线图；1是蓝线，2是红线。
[0036] 图2是CVN及其突变体的可溶性表达分析图；其中，图（a）为SDS-PAGE图，箭头所示即是CVN目的蛋白条带；图（b）是Western blot图，仅检测CVN；泳道M为蛋白Marker，单位为KDa；泳道1是未诱导表达的CVN-BL21；泳道2是诱导表达的CVN-BL21；泳道3是诱导表达的CVN-M1-BL21。
[0037] 图3是CVN及其突变体蛋白纯化后的SDS-PAGE图，泳道M为蛋白Marker，单位为KDa，箭头所示即是CVN目的蛋白条带。
[0038] 图4是CVN及其突变体抗人流感病毒A/HK/8/68(H3N2)的活性结果图，纵坐标为抑制病毒的百分比，柱状图越高说明对病毒抑制效果越好。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0040] 本发明实施例涉及的主要材料如下：宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）（Merck）、质粒pET-28b（Merck）、pET3c-SUMO-CVN（本实验室构建，已在专利号为ZL200810198926.0、名称为“重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用”公开详细制备过程，目前最简单的方法为直接通过测序公司合成SUMO-CVN融合序列，连入pET3c载体即可得到pET3c-SUMO-CVN）；pfu mix酶、限制性内切酶NdeⅠ、SalI、DpnI、预染蛋白Marker购自Fermentas公TM
司，引物由华大基因科技有限公司合成；Ni Sepharose 6Fast Flow购自GE公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国SIGMA公司。其它试剂均为分析纯试剂。NTA-10缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+10mmol/L咪唑），NTA-40缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑），NTA-200缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+200mmol/L咪唑）。
司，引物由华大基因科技有限公司合成；Ni Sepharose 6Fast Flow购自GE公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国SIGMA公司。其它试剂均为分析纯试剂。NTA-10缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+10mmol/L咪唑），NTA-40缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑），NTA-200缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+200mmol/L咪唑）。
[0041] 实施例1CVN密码子优化及表达载体构建
[0042] 利用翻译暂停理论，对编码CVN蛋白的核苷酸序列进行优化，合理设计翻译暂停位点，利用突变PCR技术对CVN的核苷酸序列进行同义突变。
[0043] CVN蛋白的编码核苷酸序列如下：
[0044] CTTGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGAAAACGTTGACGGTTCTCTGAAATGGCAGCCGTCTAACTTCATCGAAACCTGCCGTAACACCCAGCTGGCTGGTTCCTCTGAACTGGCTGCTGAATGCAAAACCCGTGCTCAGCAGTTCGTTTCTACCAAAATCAACCTGGACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAA。
[0045] （1）通过翻译暂停理论设计编码CVN突变体的核苷酸序列，在不改变CVN氨基酸序列的情况下，将CVN最后20个密码子中翻译速度较快的密码子（ATC、ACC、CTG）替换成翻译速度较慢的密码子（ATA、ACA、CTA），以制造翻译暂停位点（RiboTempo软件计算确定，http://bioinformatics.jnu.edu.cn/software/ribotempo），突变体经RiboTempo软件计算得到的翻译暂停曲线分别如图1所示，翻译暂停曲线红线在预定的区域（最后20个密码子）形成了翻译暂停位点（红线低于蓝线），符合要求。设计得到的编码CVN突变体的核苷酸序列如下：
[0046] 突变体1（CVN-M1）的编码核苷酸序列：
[0047] CTTGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGAAAACGTTGACGGTTCTCTGAAATGGCAGCCGTCTAACTTCATCGAAACCTGCCGTAACACCCAGCTGGCTGGTTCCTCTGAACTGGCTGCTGAATGCAAAACCCGTGCTCAGCAGTTCGTTTCTACCAAAATCAACCTAGACGACCATATAGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAA。
[0048] 针对于突变体1（CVN-M1）的编码核苷酸序列，设计的突变PCR引物如下：
[0049] F1-mutant：5’-GACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3’；
[0050] R1-mutant：5’-GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3’。
[0051] （2）构建pET-28b-CVN的表达质粒
[0052] 以pET-3c-SUMO-CVN质粒为PCR扩增模板，F-sumo/R-CVN为引物进行PCR扩增，扩增体系为：引物（10μmol/L）各2μL，pfu mix25μL，模板1μL，灭菌超纯水20μL；扩增条件为：反应混合物94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸2min，进行28个循环；68℃延伸5min。
[0053] F-sumo：5’-GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’
[0054] R-CVN：5’-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’。
[0055] 将得到的PCR产物使用DNA纯化试剂盒（OMEGA）回收，得到纯化后的PCR产物和质粒pET-28b分别用NdeI和SalI双酶切（10×Fastdigest buffer，37℃水浴30min），酶切产物进行质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，用T4DNA连接酶（按说明书推荐标准体系配制反应体系），16℃连接过夜，把这两个酶切产物连接起来，构建成重组质粒pET-28b-CVN。重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（Merck），涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，将筛选得到的阳性克隆送华大基因科技股份有限公司测序，得到符合预期设计的CVN克隆pET-28b-CVN。
[0056] （3）表达CVN突变体的重组载体的构建
[0057] 目的基因的获得：以pET-28b-CVN为PCR扩增模板，F1-mutant/R1-mutant为引物进行PCR扩增，扩增体系为：引物各2μL，pfu mix25μL，模板1μL，灭菌超纯水19μL；扩增条件为：反应混合物94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸
12min，进行18个循环；68℃延伸5min。
12min，进行18个循环；68℃延伸5min。
[0058] 将得到的PCR产物使用DNA纯化试剂盒（OMEGA）回收，得到纯化后的PCR产物经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒（OMEGA）纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（Merck），涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，将筛选得到的阳性克隆送华大基因科技股份有限公司测序，得到符合预期设计的含有编码CVN突变体1核苷酸序列的克隆，为pET-28b-CVN-M1。
[0059] 实施例2
[0060] （1）表达菌株的制备：
[0061] ①大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备：制备过程详见《分子克隆实验指南》第三版；[美]J.莎姆布鲁克著，黄培堂译。
[0062] ②将表达载体pET-28b-CVN和pET-28b-CVN-M1分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞：转化过程详见《分子克隆实验指南》第三版；[美]J.莎姆布鲁克著，黄培堂译。
[0063] （2）CVN及其突变体诱导表达和可溶性分析
[0064] ①将步骤（1）得到的表达菌株CVN-BL21和CVN-M1-BL21分别接种到20mL含50μg/mL卡那霉素含量的LB培养基中，37℃、180rpm培养，当OD600=0.8时，加IPTG，终浓度为1mM，37℃诱导表达4h后，分别测定OD600，保证CVN及其突变体收菌时的体积×OD600的值是相同的，5000g、4℃离心10min收集菌体。菌体用20mmol/L Tris-HCl（pH8.0，0.15mol/L NaCl）缓冲液重悬，高压（1000bar）均质破碎细胞，18000g、4℃离心30min，上清和沉淀分别留样待后续的SDS-PAGE电泳（5%浓缩胶、12%分离胶）及Western blot分析。
[0065] BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司）测定CVN及其突变体菌体破碎离心上清中总蛋白含量，保证蛋白上样量相同，western blot（实验步骤见《精编分子生物学实验指南》第五版；（美）奥斯伯主编，金由辛译）分析上清中CVN蛋白的含量。结果表明（图2），CVN突变体可溶性表达的量显著高于CVN。
[0066] （3）CVN及其突变体摇瓶发酵和纯化
[0067] 将步骤（1）得到的表达菌株CVN-BL21、CVN-M1-BL21分别接种到1L、卡那霉素含量为50μg/mL的LB培养基中，按前述的表达条件进行摇瓶发酵并诱导。4℃、6000×g、10min离心收集菌体，然后将菌体沉淀按体积比1：10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液，高压（1000bar）均质破碎细胞。4℃、25000×g、30min离心收集上清。
[0068] 上清上样至柱床体积为20mL的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.6mL/min，NTA-10缓冲液洗回基线，流速为1mL/min，NTA-40缓冲液洗杂蛋白，NTA-200缓冲液洗脱目的蛋白；纯化后的CVN蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑以及3KDa的超滤管浓缩，SDS-PAGE电泳鉴定纯化的CVN蛋白的纯度。
[0069] 根据CVN蛋白质结构域和翻译暂停之间的关系，CVN结构域中引入翻译暂停的CVN突变体，在37℃条件下诱导表达之后从菌体破碎离心上清中可以用Western blot检测出CVN突变体蛋白（图2b）。未经优化的天然序列CVN由于可溶性表达的量极低，经纯化获得CVN蛋白的量极低，以至于不能用考马斯亮蓝染色检测到；而优化过后的CVN突变体（图3中的标识为CVN-M1）虽然没有氨基酸序列变化，却可以纯化出大量CVN蛋白（图3）。这说明通过在CVN结构域中合理引入翻译暂停位点来降低CVN的翻译速度，促进CVN的可溶性表达是切实可行的。
[0070] 实施例3
[0071] CVN抗流感病毒A/HK/8/68(H3N2)活性研究
[0072] 狗肾上皮细胞MDCK细胞（美国ATCC）经质量体积比0.25%的胰酶溶液消化后，以5
2.5×10 细胞/孔加入96孔细胞培养板中（MEM培养基，含有体积百分比10%的小牛血清），待细胞长成单层后弃生长液，用维持液（MEM培养基，不含小牛血清）分别将药物CVN蛋白（实验室保存，可按公开号为CN101638435、名称为“一种蓝藻病毒蛋白N突变体,其修饰衍生物及应用”公开的步骤进行制备）及实施例2纯化得到的CVN突变体蛋白稀释成6个系列浓度（100、50、25、12.5、6.25、3.125μM），每个稀释度设3个复孔，同时设正常细胞对照组，阳性药物（利巴韦林）对照组，37℃、5%CO2培养箱内培养48h，每天观察细胞的变化，MTT法测各孔细胞OD值，计算半数中毒浓度TC50。
2.5×10 细胞/孔加入96孔细胞培养板中（MEM培养基，含有体积百分比10%的小牛血清），待细胞长成单层后弃生长液，用维持液（MEM培养基，不含小牛血清）分别将药物CVN蛋白（实验室保存，可按公开号为CN101638435、名称为“一种蓝藻病毒蛋白N突变体,其修饰衍生物及应用”公开的步骤进行制备）及实施例2纯化得到的CVN突变体蛋白稀释成6个系列浓度（100、50、25、12.5、6.25、3.125μM），每个稀释度设3个复孔，同时设正常细胞对照组，阳性药物（利巴韦林）对照组，37℃、5%CO2培养箱内培养48h，每天观察细胞的变化，MTT法测各孔细胞OD值，计算半数中毒浓度TC50。
[0073] 在无毒浓度范围内（TC50>50μM）将药物稀释成不同浓度，取药物稀释液各50μL，人流感毒株A/HK/8/68(H3N2)（ATCC公司，Influenza A virus(H3N2)，ATCCTM
VR-1679 ））的病毒稀释液（100TCID50）50μL混合后直接加到单层MDCK细胞上，每个浓度
3个复孔，设阳性药物组，病毒对照组，阴性对照组。置于37℃、5%CO2，培养48h后，加10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，小心吸弃上清液，每孔加100μL DMSO避光摇床放置15min，酶标仪（Bio-Rad550）读取OD值，测量波长490nm，参考波长630nm。
VR-1679 ））的病毒稀释液（100TCID50）50μL混合后直接加到单层MDCK细胞上，每个浓度
3个复孔，设阳性药物组，病毒对照组，阴性对照组。置于37℃、5%CO2，培养48h后，加10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，小心吸弃上清液，每孔加100μL DMSO避光摇床放置15min，酶标仪（Bio-Rad550）读取OD值，测量波长490nm，参考波长630nm。
[0074] 计算各药物浓度下的抑制率%=（OD药物组-OD病毒对照组）/（OD细胞对照组-OD病毒对照组）。
[0075] CVN及其突变体抗流感病毒H3N2活性结果（图4）表明：CVN及其突变体对人流感毒株A/HK/8/68(H3N2)有显著的抑制作用，并且CVN突变体对人流感毒株A/HK/8/68(H3N2)的抑制作用优于CVN，这说明利用利用蛋白质结构域和翻译暂停的关系，在蛋白质结构域中合理引入翻译暂停，并且利用翻译暂停理论对CVN核苷酸序列进行重新设计和优化，不仅可以促进CVN的可溶性表达，而且可以得到活性更好的CVN蛋白。
[0076] 综上所述，本发明构建的CVN突变体，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达成功，并且可溶性表达的量显著高于CVN；克服了CVN易形成包涵体，纯化困难等缺点。CVN及其突变体抗人流感毒株A/HK/8/68(H3N2)活性结果表明：CVN突变体的活性要好于CVN。
[0077] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。