本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否存在群体感应系统相关基因的PCR引物组。本发明所提供的PCR引物组为如下：由18条引物组成，分别为序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18所示的DNA单链组成。本发明通过PCR扩增群体感应系统三组分的基因，从而确认群体感应系统的存在，这使得从II类细菌素中大规模高通量筛选受群体感应调控的菌株成为了可能。
1.用于鉴定或辅助鉴定待测Ⅱ类细菌素产生菌是否存在群体感应系统相关基因的PCR引物组，由9个引物对组成，第一个引物对是由序列表中的序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对1；第二个引物对是由序列表中的序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对2；第三个引物对是由序列表中的序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对
3；第四个引物对是由序列表中的序列7和序列8所示的两条单链DNA组成为特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对4；第五个引物对是由序列表中的序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶的引物对5；第六个引物对是由序列表中的序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对6；第七个引物对是由序列表中的序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对7；第八个引物对是由序列表中的序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对8；第九个引物对是由序列表中的序列17和序列18所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因的引物对9。
2.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳酸菌。
3.根据权利要求2所述的PCR引物组，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的PCR引物组，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1或植物乳杆菌(L.plantarum)。
6.权利要求1所述PCR引物组的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1所述PCR引物组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
7.权利要求5所述PCR试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述PCR引物组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、4种dNTP和ddH2O。
8.权利要求1所述的PCR引物组在制备用于鉴定或辅助鉴定待测Ⅱ类细菌素产生菌是否含有群体感应系统相关基因的试剂盒中的应用，所述群体感应系统相关基因为自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因。
9.鉴定或辅助鉴定待测Ⅱ类细菌素产生菌是否含有群体感应系统相关基因的方法，所述群体感应系统相关基因为自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因，其特征在于：所述方法包括下述(1)和(2)的步骤：所述(1)为如下A)-I)：
A)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对1进行PCR反应；
B)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对2进行PCR反应；
C)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对3进行PCR反应；
D)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对4进行PCR反应；
E)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对5进行PCR反应；
F)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对6进行PCR反应；
G)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对7进行PCR反应；
H)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对8进行PCR反应；
I)以待测Ⅱ类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述引物对9进行PCR反应；
(2)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测Ⅱ类细菌素产生菌是否含有所述群体感应系统相关基因：若引物对1的PCR产物含有450bp的DNA片段，和/或引物对2的PCR产物含有114bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌含有自诱导肽基因或候选含有自诱导肽基因；
若引物对1的PCR产物不含有450bp的DNA片段，同时引物对2的PCR产物也不含有114bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌不含有自诱导肽基因或候选不含有自诱导肽基因；若引物对3的PCR产物含有165bp的DNA片段，和/或引物对4的PCR产物含有758bp的DNA片段，和/或引物对5的PCR产物含有927bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有1727bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌含有组氨酸蛋白激酶基因或候选含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对3的PCR产物不含有165bp的DNA片段，同时引物对
4的PCR产物不含有758bp的DNA片段，同时引物对5的PCR产物不含有927bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌不含有组氨酸蛋白激酶基因或候选不含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对6的PCR产物含有
108bp的DNA片段，和/或引物对7的PCR产物含有414bp的DNA片段，和/或引物对8的PCR产物含有1249bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有1727bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌含有感应调节蛋白基因或候选含有感应调节蛋白基因；若引物对6的PCR产物不含有108bp的DNA片段，同时引物对7的PCR产物不含有414bp的DNA片段，同时引物对8的PCR产物不含有1249bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测Ⅱ类细菌素产生菌不含有感应调节蛋白基因或候选不含有感应调节蛋白基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳酸菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳杆菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1或植物乳杆菌(L.plantarum)。
13.权利要求9的方法在获得存在或候选存在群体感应系统的Ⅱ类细菌素产生菌中的应用，所述应用为将利用权利要求9的方法鉴定得到的满足如下a)-c)条件的Ⅱ类细菌素产生菌作为存在或候选存在群体感应系统的Ⅱ类细菌素产生菌：a)含有或候选含有自诱导肽基因；
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳酸菌。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为乳杆菌。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述Ⅱ类细菌素产生菌为类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1或植物乳杆菌(L.plantarum)。
检测Ⅱ类细菌素产生菌是否存在群体感应系统的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否存在群体感应系统相关基因的PCR引物组，以及利用该PCR引物组鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否存在群体感应系统的方法。
背景技术
[0002] 群体感应(Quorum Sensing，QS)是指微生物群体某些基因的表达受到与群体密度相关的信号分子调控的现象。QS系统参与调控一系列生物学功能，如：菌体发光、抗生素的生物合成、毒性因子的产生、胞外多糖的合成、细菌丛集、生物膜形成、质粒接合转移、稳定生长期的进入等。
[0003] QS系统被认为参与调控II类细菌素的合成，该系统包括自诱导肽(autoinducing peptide，AIP)、组氨酸蛋白激酶和感应调节蛋白，又称为三组分系统。AIP作为信号分子，用于指示细胞密度。当AIP达到某一临界的浓度阈值时，便可激活一系列特定基因的表达。
[0004] Lactobacillus plantarum WCFS1、J51与L.plantarum C11具有相同的群体感应调节系统，该系统由编码自诱导肽的基因plnA、编码组氨酸蛋白激酶的基因plnB、编码感应调节蛋白的基因plnC和plnD组成。L.plantarum NC8与L.plantarum C11具有相似的操纵子，其中plNC8IF编码自诱导肽，plNC8HK编码组氨酸蛋白激酶，plnD编码感应调节蛋白。
[0005] 对G-群体感应的研究一般通过检测其信号分子——高丝氨酸内酯类来进行确认，而且其检测方法已有很多报道和专利。群体感应是调控II类细菌素合成的重要机制，产II类细菌素乳酸菌以小肽作为其信号分子，但目前其检测方法尚未确立，这也成为限制其群体感应研究的巨大障碍。虽然已发现许多产II类细菌素乳酸菌，但其细菌素的产生是否受到群体感应调控尚未形成一套有效的检测方法。
发明内容
[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否存在群体感应系统相关基因的PCR引物组。
[0007] 本发明所提供的PCR引物组由9个引物对组成，第一个引物对是由序列表中的序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对1；第二个引物对是由序列表中的序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对2；第三个引物对是由序列表中的序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对3；第四个引物对是由序列表中的序列7和 序列8所示的两条单链DNA组成为特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对4；第五个引物对是由序列表中的序列
9和序列10所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对5；第六个引物对是由序列表中的序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对6；第七个引物对是由序列表中的序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因基因的引物对7；第八个引物对是由序列表中的序列15和序列
16所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对8；第九个引物对是由序列表中的序列17和序列18所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因的引物对9。
[0008] 含有上述PCR引物组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0009] 所述PCR引物组的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法包括将所述PCR引物组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0010] 上述PCR试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法包括如下步骤：将所述PCR引物组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、4种dNTP和ddH2O。
[0011] 上述PCR引物组在制备用于鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否含有群体感应系统相关基因的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述群体感应系统相关基因为自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因。
[0012] 鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否含有群体感应系统相关基因的方法也属于本发明的保护范围。所述群体感应系统相关基因为自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因。
[0013] 所述方法包括下述(1)和(2)的步骤：
[0014] 所述(1)为如下A)-I)：
[0015] A)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对1进行PCR反应；
[0016] B)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对2进行PCR反应；
[0017] C)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对3进行PCR反应；
[0018] D)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对4进行PCR反应；
[0019] E)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对5进行PCR反应；
[0020] F)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对6进行PCR 反应；
[0021] G)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对7进行PCR反应；
[0022] H)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对8进行PCR反应；
[0023] I)以待测II类细菌素产生菌的基因组DNA为模板，用所述引物对9进行PCR反应；
[0024] (2)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测II类细菌素产生菌是否含有所述群体感应系统相关基因，即所述自诱导肽基因、所述组氨酸蛋白激酶基因和所述感应调节蛋白基因：
[0025] 若引物对1的PCR产物含有(或为)450bp的DNA片段，和/或引物对2的PCR产物含有(或为)114bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有自诱导肽基因或候选含有自诱导肽基因；若引物对1的PCR产物不含有450bp的DNA片段，同时引物对2的PCR产物也不含有114bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有自诱导肽基因或候选不含有自诱导肽基因；若引物对3的PCR产物含有(或为)165bp的DNA片段，和/或引物对4的PCR产物含有(或为)758bp的DNA片段，和/或引物对5的PCR产物含有(或为)927bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有(或为)1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有组氨酸蛋白激酶基因或候选含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对3的PCR产物不含有165bp的DNA片段，同时引物对4的PCR产物不含有758bp的DNA片段，同时引物对5的PCR产物不含有927bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有组氨酸蛋白激酶基因或候选不含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对6的PCR产物含有(或为)108bp的DNA片段，和/或引物对7的PCR产物含有(或为)414bp的DNA片段，和/或引物对8的PCR产物含有(或为)1249bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有(或为)1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有感应调节蛋白基因或候选含有感应调节蛋白基因；若引物对6的PCR产物不含有108bp的DNA片段，同时引物对7的PCR产物不含有414bp的DNA片段，同时引物对8的PCR产物不含有1249bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有感应调节蛋白基因或候选不含有感应调节蛋白基因
[0026] 利用上述鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否含有群体感应系统相关基因的方法在获得存在或候选存在群体感应系统的II类细菌素产生菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0027] 所述应用为将利用上述方法鉴定得到的满足如下a)-c)条件的II类细菌素产生菌作为存在或候选存在群体感应系统的II类细菌素产生菌：
[0028] a)含有或候选含有自诱导肽基因；
[0029] b)含有或候选含有组氨酸蛋白激酶基因；
[0030] c)含有或候选含有感应调节蛋白基因。
[0031] 所述II类细菌素产生菌为乳酸菌，可为乳杆菌(如植物乳杆菌(L.plantarum))，在本发明的实施例中具体为类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1。
[0032] 本发明通过PCR扩增群体感应系统三组分的基因，从而确认群体感应系统的存在，这使得从II类细菌素中大规模高通量筛选受群体感应调控的菌株成为了可能。
附图说明
[0033] 图1为鉴定或辅助鉴定待测II类细菌素产生菌是否存在群体感应系统相关基因的流程图。其中，QS表示群体感应系统。
[0034] 图2为鉴定或辅助鉴定类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1是否存在群体感应系统的电泳结果。其中，A为引物对1扩增出的自诱导肽基因特异性片段的电泳图；B为用引物对3扩增出的组氨酸蛋白激酶基因特异性片段的电泳图；C为用引物对5扩增出的组氨酸蛋白激酶基因特异性片段的电泳图；D为用引物对9扩增出的组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因特异性片段的电泳图；E为用引物对8扩增出的感应调节蛋白基因特异性片段的电泳图。A-E中，泳道M均为BM2000DNA ladder；泳道1均为相应基因PCR产物；泳道2均为阴性对照。
[0035] 图3为利用液体脱脂乳培养基检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象的流程图。
[0036] 图4为自诱导物诱导II类细菌素产生的抑菌活性实验结果。其中，A实验组(经自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；B为对照组1(用等量MRS液体培养基代替自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；C为对照组2(自诱导物的抑菌效果，浓度为5μL/10mL，用新鲜MRS培养基稀释))；D为对照组3(L.paraplantarum L-XM160h培养物与自诱导物(终浓度5μL/10mL)的混合物的抑菌效果)。
具体实施方式
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] MRS培养基：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，K2HPO4·3H2O 2g，柠檬酸三铵2g，NaAC 5g，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温801mL，溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌20min。
[0040] 实施例1、鉴定或辅助鉴定类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1是否存在群体感应系统
[0041] 一、利用本发明的方法鉴定或辅助鉴定类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1(原编号为Y1，现经鉴定正式命名为L.paraplantarum L-XM1，参见：桂萌，张晓琼，于沐洋，武瑞赟，李平兰.耐热乳酸菌肉品天然发酵剂的筛选鉴定.肉类研究，2011，25(8)：1-5)是否存在群体感应系统(实验流程如图1所示)。
[0042] 具体操作如下：
[0043] 1、基因组DNA提取
[0044] 将类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1以5％(体积比)的接种量接种到MRS培养基中，37℃培养24h，取2mL，13800×g离心1min，收集菌体。
[0045] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA kit)(天根生化科技(北京)有限公司目录号：DP302-02)提取基因组DNA，具体操作方法参见试剂盒说明书。
[0046] 2、PCR扩增
[0047] PCR扩增的目的基因涉及如下基因：编码群体感应系统组分自诱导肽(或自诱导肽前体)的基因；编码群体感应系统组分组氨酸蛋白激酶的基因；编码群体感应系统组分感应调节蛋白的基因。
[0048] PCR扩增所用的引物共涉及9个引物对：第一个引物对是由序列表中的序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对1；第二个引物对是由序列表中的序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的特异于自诱导肽基因的引物对2；第三个引物对是由序列表中的序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对3；第四个引物对是由序列表中的序列7和序列8所示的两条单链DNA组成为特异于组氨酸蛋白激酶基因的引物对4；第五个引物对是由序列表中的序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶的引物对5；第六个引物对是由序列表中的序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对6；
第七个引物对是由序列表中的序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对7；第八个引物对是由序列表中的序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的特异于感应调节蛋白基因的引物对8；第九个引物对是由序列表中的序列17和序列18所示的两条单链DNA组成的特异于组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因的引物对9。
[0049] 针对上述9个引物对的不同，设置9个不同的PCR反应体系。每个反应体系包括2×Taq PCR Master Mix，模板DNA(步骤(1)提取的基因组DNA)10ng，上下游引物(浓度均-1
为10pmolμL )各1μL，ddH2O补足至25μL。当上游引物为序列1所示引物时，下游引物为序列2所示引物；当上游引物为序列3所示引物时，下游引物为 序列4所示引物；当上游引物为序列5所示引物时，下游引物为序列6所示引物；当上游引物为序列7所示引物时，下游引物为序列8所示引物；当上游引物为序列9所示引物时，下游引物为序列10所示引物；当上游引物为序列11所示引物时，下游引物为序列12所示引物；当上游引物为序列13所示引物时，下游引物为序列14所示引物；当上游引物为序列15所示引物时，下游引物为序列16所示引物；当上游引物为序列17所示引物时，下游引物为序列18所示引物。上述
9个不同的PCR反应体系，均同时设置以ddH2O代替模板的阴性对照。
[0050] 扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(不同引物的退火温度不同，具体见表1)，72℃延伸，延伸时间依据扩增片段长度确定，约1000bp/min，共30个循环，最后72℃延伸10min，得到PCR反应产物。
[0051] 表1PCR扩增所用引物
[0052]
[0053]
[0054] 3、电泳检测
[0055] (1)根据电泳结果判断待测II类细菌素产生菌(L.paraplantarum L-XM1)是否存在或候选存在群体感应系统的方法为|：
[0056] 首先，利用上述9对引物序列进行PCR反应，判断待测II类细菌素产生菌(L.paraplantarum L-XM1)是否含有或候选含有自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因或感应调节蛋白基因。具体如下：若引物对1的PCR产物含有450bp的DNA片段，和/或引物对2的PCR产物含有114bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有自诱导肽基因或候选含有自诱导肽基因；若引物对1的PCR产物不含有450bp的DNA片段，同时引物对2的PCR产物也不含有114bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有自诱导肽基因或候选不含有自诱导肽基因；若引物对3的PCR产物含有165bp的DNA片段，和/或引物对
4的PCR产物含有758bp的DNA片段，和/或引物对5的PCR产物含有927bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有组氨酸蛋白激酶基因或候选含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对3的PCR产物不含有165bp的DNA片段，同时引物对4的PCR产物不含有758bp的DNA片段，同时引物对5的PCR产物不含有927bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有组氨酸蛋白激酶基因或候选不含有组氨酸蛋白激酶基因；若引物对6的PCR产物含有108bp的DNA片段，和/或引物对7的PCR产物含有414bp的DNA片段，和/或引物对8的PCR产物含有1249bp的DNA片段，和/或引物对9的PCR产物含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌含有感应调节蛋白基因或候选含有感应调节蛋白基因；若引物对6的PCR产物不含有108bp的DNA片段，同时引物对7的PCR产物不含有414bp的DNA片段，同时引物对8的PCR产物不含有1249bp的DNA片段，同时引物对9的PCR产物不含有1727bp的DNA片段，则所述待测II类细菌素产生菌不含有感应调节蛋白基因或候选不含有感应调节蛋白基因。
[0057] 其次，根据上述判断所述待测II类细菌素产生菌(L.paraplantarum L-XM1)是否 含有或候选含有自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因或感应调节蛋白基因的结果，进一步判断所述待测II类细菌素产生菌是否存在或候选存在群体感应系统。具体如下：若所述待测II类细菌素产生菌同时含有或候选含有自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因，则所述待测II类细菌素产生菌存在或候选存在群体感应系统；若所述待测II类细菌素产生菌不同时含有或候选含有自诱导肽基因、组氨酸蛋白激酶基因和感应调节蛋白基因，则所述待测II类细菌素产生菌不存在或候选不存在群体感应系统。
[0058] (2)制备1.0％琼脂糖凝胶，将上述步骤2所得的PCR产物进行电泳检测。电压为100V，电泳时间为20min。电泳结果如图2所示，用引物对1扩增出了大小约为450bp的目的条带，与预期结果相符；用引物对3扩增出了大小约为170bp的目的条带，与预期结果相符；用引物对5扩增出了大小约为900bp的目的条带，与预期结果相符；用引物对9扩增出了大小约为1700bp的目的条带，与预期结果相符；用引物对8扩增出了大小约为
1200bp的目的条带，与预期结果相符。而上述四个引物对所对应的阴性对照均未扩增出相应的目的条带。综合分析上述结果，利用所述9个引物对进行PCR扩增，筛选类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1群体感应相关基因，结果同时扩增出了作为群体感应系统自诱导肽(或自诱导肽前体)编码基因的特异片段(用引物对1)、组氨酸激酶编码基因的特异片段(用引物对3、5、9)以及感应调节蛋白编码基因的特异片段(用引物对8、9)。而用其他引物对则未扩增到目的条带。由此得出结论，类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1中存在或候选存在群体感应系统。
[0059] 二、另一种方法检测或辅助检测类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1中是否受群体感应调控系统调控
[0060] 此方法所用各种液体培养基的配方如下：
[0061] 液体脱脂乳培养基：称取脱脂乳(哈尔滨美华生物技术股份有限公司原料脱脂乳粉)11g，溶于100mL蒸馏水中，6.5～7.0，115℃灭菌10～13min。
[0062] 液体MRS培养基：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，K2HPO4·3H2O 2g，柠檬酸三铵2g，NaAC 5g，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温801mL，溶于1000mL蒸馏水中，pH6.5～7.0，121℃灭菌20min。
[0063] 液体1/2MRS培养基：除蒸馏水外，其他各种MRS培养基成分×1/2，pH6.5～7.0，121℃灭菌20min。
[0064] 液体1/5MRS培养基：除蒸馏水外，其他各种MRS培养基成分×1/5，pH6.5～7.0，121℃灭菌20min。
[0065] 液体1/10MRS培养基：除蒸馏水外，其他各种MRS培养基成分×1/10，pH6.5～7.0，121℃灭菌20min。
[0066] 固体MRS培养基：为MRS液体培养基加入15g/L琼脂粉。
[0067] 下面为另一方法检测或辅助检测类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1产生II类细菌素是否受群体感应调控系统调控(实验流程如图3所示)的具体操作步骤：
[0068] 1、制备自诱导物(发酵上清液)
[0069] 将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/mL)中的类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1以0.5％(体积比)的接种量接种到液体MRS培养基中，37℃培养24h(类植物乳杆菌(L.paraplantarum)L-XM1处于稳定期末期)，13800×g离心5min，收集发酵上清液，作为自诱导物。
[0070] 2、获得具有不产II类细菌素细胞表型的L.paraplantarum L-XM1
[0071] 将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/mL)中的L.paraplantarum L-XM1以0.5％(体积比)的接种量分别接种到液体脱脂乳培养基(同时设置如下四种液体培养基作为液体脱脂乳培养基的对照：液体MRS培养基、液体1/2MRS培养基、液体1/5MRS培养基和液体1/10MRS培养基)中，并在37℃条件下培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后，分别检测此时五种液体培养基的培养物中是否存在II类细菌素。具体方法为：分别收集不同培养时间的五种液体培养基的培养物，13800×g离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5～7.0，取100μL备用。以可被所述待检细菌所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(L.plantarum)PL2为指示菌用杯碟法测定上述不同培养时间的五种液体培养基培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素。具体操作为：取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌6
(L.plantarum)PL2，用无菌生理盐水稀释至10CFU/mL，取1mL与冷却至50℃的20mL的MRS固体培养基混匀倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100μL/杯的用量，加入经上述处理的上清液，37℃培养24h，观察抑菌效果。
[0072] 结果显示，经过72h培养，加入了液体脱脂乳培养基培养物上清液的平板仍未产生抑菌圈，而加入作为对照的四种液体培养基(MRS培养基、1/2MRS培养基、1/5MRS培养基和1/10MRS培养基)平板均产生抑菌圈(表2)。这一结果表明，包括对照培养基在内的共五种培养基中，只有所述液体脱脂乳培养基的培养物上清液中不存在II类细菌素，进而说明利用所述液体脱脂乳培养基获得了不产II类细菌素细胞表型的L.paraplantarum L-XM1。
[0073] 表2不同培养基对L.paraplantarum L-XM1合成II类细菌素的影响
[0074]培养时间 12h 24h 36h 48h 60h 72h
脱脂乳培养基 - - - - - -
MRS + ++ ++ ++ ++ ++
1/2MRS - + ++ ++ ++ ++
1/5MRS - + ++ ++ ++ ++
1/10MRS - + ++ ++ ++ ++
[0075] 注：“-”表示无抑菌圈；“+”表示抑菌圈直径介于6mm和10mm之间；“++”表示抑菌圈直径大于10mm。
[0076] 3、诱导
[0077] 按照每10mL培养物中加入5μL的用量，向步骤2培养有L.paraplantarum L-XM1(L.paraplantarum L-XM1处于对数生长期末期)的液体脱脂乳培养基的培养物中加入步骤1制备的自诱导物(发酵上清液)(实验组)，进行诱导(同时设置以等量液体MRS培养基替代自诱导物进行诱导的对照，对照组1)，继续培养至60h。
[0078] 4、检测
[0079] 分别收集步骤3中液体培养基的培养物，13800×g离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5～7.0，取100μL备用。以可被所述待检细菌所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(L.plantarum)PL2(武朋朋，刘国荣，畅晓渊，张香美，李平兰.抗猪链球菌戊糖乳杆菌素的纯化及特性研究.中国农业大学学报，2011，16(5)：121-126)为指示菌，用杯碟法测定上述培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素，进而判定所述L.paraplantarum L-XM1经自诱导物(发酵上清液)处理后，是否恢复产生II类细菌素。具体操作为：取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌(L.plantarum)PL2，用无菌生理6
盐水稀释至10CFU/mL，取1mL与冷却至50℃的20mL的MRS固体培养基混匀倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100μL/杯的用量，加入经上述处理的上清液，同时以等浓度的自诱导物(5μL/10mL，用新鲜MRS培养基稀释)(对照组2)以及L.paraplantarum L-XM160h培养物加自诱导物(5μL/10mL)(对照组3)作为对照，37℃培养24h，观察抑菌效果。
[0080] 结果显示，用等量液体MRS培养基诱导的对照组1未产生抑菌圈，自诱导物(对照组2)以及L.paraplantarum L-XM1 60h培养物加自诱导物(5μL/10mL)(对照组3)也未产生抑菌圈，而实验组出现抑菌圈(图4)。这一结果表明，所述液体脱脂乳培养基的培养物上清液中存在II类细菌素，且此II类细菌素是由自诱导物诱导产生的。
[0081] 本实施例的实验结果表明，利用脱脂乳培养基可以获取L.paraplantarum L-XM1不产生II类细菌素的细胞表型，再通过自诱导物的诱导，可以使L.paraplantarum L-XM1恢复产生II类细菌素(即相应的培养物上清中存在II类细菌素)，进而验证了L.paraplantarum L-XM1菌株产生II类细菌素存在群体感应调控现象。
