禽流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及禽流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法。目的是提供的检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点，提供的方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。技术方案是：一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针；一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：（1）提取RNA；（2）进行RT-PCR反应；（3）对RT-PCR反应产物进行荧光检测。

权利要求

1.一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、禽流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；

其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’；

下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’；

特异性探针N9-P:5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’，其中FAM-为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

所述禽流感病毒N9基因标准品序列如下：

GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGG；

所述检测试剂盒中各组分的含量是：

。

2.一种非诊断目的的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：(1)提取待测样品RNA；

(2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成反应体系进行RT-PCR反应：上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、DNA聚合酶；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’特异性探针N9-P:5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果；若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有禽流感H7型病毒。

3.根据权利要求2所述非诊断目的的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应体系中各成分含量如下：其余是DEPC水，将反应体系补足至25μl。

4.根据权利要求3所述非诊断目的的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50℃40min，95℃2min进行逆转录，然后

95℃10s，55℃35s，在55℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

说明书

禽流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及流感病毒N9型核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于流感病毒N9型引起暴发疫情的实验室应急检测。

背景技术

[0002] 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。以往研究发现可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。目前，全球首次发现人感染H7N9禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。据报道，自2013年2月以来，我国上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例，其中确诊人感染H7N9禽流感3例，2例死亡。3例均为散发病例，目前尚未发现3例病例间有流行病学关联。此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。

[0003] 流行病学调查显示H9N2禽流感病毒的传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。H7N9禽流感病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染，现尚无人与人之间传播的确切证据。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

[0004] 根据流行病学调查结果发现，H7N9禽流感病毒感染致死率较高，且暂时并没有相应的保护性疫苗可供使用。因此，疾病防控机构强烈需要快速、有效的H7N9禽流感病毒检测方法来加强对禽流感感染疑似病例及相关禽类中的H7N9禽流感病毒检测，从而提高我们对H7N9禽流感病毒感染的防制能力。目前，实验室病原学检测方法主要是病毒分离：从患者呼吸道标本中分离H7N9禽流感病毒。上述检测方法的不足是检测速度尚不能满足要求（通常需要5天左右）；而且操作比较复杂。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点。

[0006] 本发明的另一目的是提供一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，该方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。

[0007] 本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：

[0009] 上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’；

[0010] 下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’；

[0011] 特异性探针N9-P:5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’，其中FAM-为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

[0012] 所述禽流感病毒N9基因标准品序列如下：

[0013] GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACG GAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTAT CATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCA AGTACTAGTTGCCATGATGG。

[0014] 所述检测试剂盒中各组分的含量是：

[0015]

[0016] 一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：

[0017] （1）提取待测样品RNA；

[0018] （2）以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成反应体系进行RT-PCR反应：上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、DNA聚合酶；

[0019] 所述特异性引物和荧光探针序列如下：

[0020] 上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’

[0021] 下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’

[0022] 特异性探针N9-P:5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’

[0023] （3）对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果；若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有禽流感N9型病毒。

[0024] 所述步骤（2）中PCR反应体系中各成分含量如下：

[0025]

[0026] 其余是DEPC水，将反应体系补足至25μl。

[0027] 所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50℃40min，95℃2min进行逆转录，然后95℃10s，55℃ 35s，在55 ℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

[0028] 本发明的有益效果是：所提供的检测试剂和方法不但对于流感病毒N9型特异性强、灵敏度高（0.1TCID50浓度下即有灵敏反应），而且检测快速（通常只需4-5小时），能够及时满足疾病防控需求；另外，采用一步法检测，步骤简单，操作方便易行。

附图说明

[0029] 图1是甲型N9禽流感病毒荧光定量RT-PCR特异性检测结果示意图。

[0030] 纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线H表示阈值线。A：该体系对甲型H7流感病毒核酸检测扩增结果；B-G：该检测体系对其他病毒（季节性H1N1流感病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H9N2流感病毒）及空白对照的扩增检测结果。

[0031] 图2是甲型N9禽流感病毒荧光定量RT-PCR灵敏度检测结果示意图。

[0032] 纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线F表示阈值线。图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、1、0.1TCID50/ml浓度甲型N9流感病毒进行扩增检测的结果。

[0033] 图3是甲型N9流感病毒荧光定量RT-PCR临床样本检测结果示意图。

[0034] 纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线E表示阈值线。图中B、C、D表示采用本扩增体系对不同临床样本的扩增检测结果；图中A表示采用本扩增体系对甲型N9流感病毒核酸（阳性对照）的扩增结果。

具体实施方式

[0035] N9基因是H7N9禽流感病毒的重要抗原基因，可用作该禽流感病毒特异性检测鉴定的靶点。本发明通过基于荧光定量RT-PCR技术，建立针对N9基因的H7N9禽流感病毒快速检测方法。

[0036] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0037] 实施例1：

[0038] 1材料与方法

[0039] 病毒株与临床标本：

[0040] 甲型H1N1、SWH1N1、季节性H1N1、季节性H3N1病毒株来源于香港和浙江省疾病预防控制中心分离株。临床样本来源于近期浙江省甲型H7N9病毒爆发疫情疑似患者的咽拭子、及环境样本，样本采集后带冰运送到实验室。

[0041] 1.2引物与探针

[0042] 从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的禽流感N9型病毒序列。对其进行了同源性比较，在所有禽流感病毒基因组N9基因区设计禽流感N9型病毒特异性引物与特异性探针，序列如下：

[0043] 上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’

[0044] 下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’

[0045] 特异性探针N9-P:5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’

[0046] 特异性引物和特异性探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。

[0047] 1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取：

[0048] 以确证患者标本分离的禽流感N9型病毒为标准毒株，用狗肾传代细胞（MDCK）进3
行病毒效价滴定（1×10TCID50/ml）后作为参考株。将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID50每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA备用。

[0049] 1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

[0050] RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one stepRT-PCR缓冲液。1×one step RT-PCR Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：Q40101。

[0051] 反应体系为25μl，其中RT-PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR Reaction Buffer7.5ul，脱氧三磷酸核苷5ul，DNA聚合酶4U，MMLV逆转录酶200U，RNA酶抑制剂20U，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,模板RNA2-3μl，反应体-4系中MgCl2浓度为5mmol/L（净含量为1.25×10 mmol），DEPC水补足25μl。反应条件为
50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，55℃30s，在55℃进行单点荧光检测，共进行40个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。

[0052] 1.5荧光RT-PCR特异性、灵敏度和重复性试验

[0053] 选择甲型H1N1、季节性H1N1、猪H1N1流感病毒毒株和2009年浙江省爆发疫情确诊患者的咽拭子临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用甲型N9流感病毒荧光3
RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID50的甲型流感病毒（1×10TCID50/ml）稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。

[0054] 2结果

[0055] 2.1荧光RT-PCR反应体系及条件

[0056] 反应体系为25μl；其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer7.5ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,模板RNA2-3μl，DEPC水补足25μl。用Rotor-Gene6000荧光检测系统进行检测，反应参数为：反应条件为50℃30min，
95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，55℃30s，在55℃进行单点荧光检测，共进行40个循环，可获得最低Ct值和最高荧光强度。

[0057] 2.2特异性试验

[0058] 本发明建立的荧光RT-PCR方法对禽流感N9型病毒具有较好的特异性，近期流行的禽流感N9型患者的咽拭子也显示阳性反应;而与其他流感病毒如季节性H1N1、猪H1N1、H3N1、H5N1、H9N1流感病毒等均无交叉反应（见图1）。

[0059] 2.3灵敏度试验

[0060] 对禽流感N9型病毒毒株，采用MDCK细胞进行病毒效价测定（100TCID50/ml），将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID50。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA。用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测灵敏度达到0.1TCID50（见图2）。

[0061] 2.4重复性试验

[0062] 禽流感N9型病毒毒株按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性（表1）。

[0063] 表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒的重复性试验

[0064]

[0065] 2.5临床样本的检测

[0066] 从近期浙江省各地报告的禽流感H7N9爆发疫情疑似患者的咽拭子、含漱液及环境标本共20份样本中直接提取病毒RNA，用本发明甲型禽流感N9病毒荧光RT-PCR方法检测病毒核酸，结果本发明方法检测出N9禽流感病毒核酸阳性14份（如图3所示）。本发明荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果。

[0067] 序列表

[0068] <110>浙江省疾病预防控制中心

[0069] <120>流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

[0070] <160>4

[0071] <170>WinBlast v.0.2.0

[0072] <210>1

[0073] <211>核苷酸23

[0074] <212>DNA/PRT

[0075] <213>人工序列

[0076] <220>

[0077] <222>核苷酸序列（1）…（23）

[0078] <223>上游引物

[0079] <400>1

[0080] ACAATACACGATAGRTCCCAGTA 23

[0081] <110>浙江省疾病预防控制中心

[0082] <120>流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

[0083] <160>4

[0084] <170>WinBlast v.0.2.0

[0085] <210>2

[0086] <211>核苷酸22

[0087] <212>DNA/PRT

[0088] <213>人工序列

[0089] <220>

[0090] <222>核苷酸序列（1）…（22）

[0091] <223>下游引物

[0092] <400>2

[0093] CTAGTACTTGACCACCCAATGC 22

[0094] <110>浙江省疾病预防控制中心

[0095] <120>流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

[0096] <160>4

[0097] <170>WinBlast v.0.2.0

[0098] <210>3

[0099] <211>核苷酸23

[0100] <212>DNA/PRT

[0101] <213>人工序列

[0102] <220>

[0103] <222>核苷酸序列（1）…（23）

[0104] <223>特异性探针

[0105] <400>3

[0106] FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1 23

[0107] <110>浙江省疾病预防控制中心

[0108] <120>流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

[0109] <160>4

[0110] <170>WinBlast v.0.2.0

[0111] <210>4

[0112] <211>核苷酸107

[0113] <212>DNA

[0114] <213>甲型流感病毒属

[0115] <220>

[0116] <222>核苷酸序列（445）…（551）

[0117] <223>目的片段

[0118] <400>4

[0119] acaatacacg ataggtccca gtatcgcgct ctgataagct ggccactatc atcaccgccc 60[0120] acagtataca acagcagggt ggaatgcatt gggtggtcaa gtactag 107