一种亚洲雨林蝎抗菌肽及其用途

摘要

本发明提供了一种从亚洲雨林蝎中分离出的Peptocin抗菌肽，采用化学合成的方法获得该抗菌肽。该抗菌肽对临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌具有显著的抗菌效果，能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长，同时人的红细胞毒性实验也显示该抗菌肽的毒性小，能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中，尤其是治疗因耐药鲍曼不动杆菌而引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。本发明的抗菌肽对革兰氏细菌的抑制效果显著，其抗菌机制独特和毒性低，还能够应用于治疗或预防因藤黄微球菌、沙门氏菌等革兰氏细菌引起的疾病的药物中。

权利要求

1.一种抗菌肽的用途，该抗菌肽来自于亚洲雨林蝎，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于：应用于制备治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：应用于制备治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染的药物中。

说明书

一种亚洲雨林蝎抗菌肽及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及了一种来自于亚洲雨林蝎毒的抗菌肽，同时还涉及了该抗菌肽的基因，同时，本发明还公开了上述抗菌肽的用途，属于生物工程领域。

背景技术

[0002] 鲍曼不动杆菌属于不发酵糖的革兰阴性杆菌，广泛分布于环境及健康人的皮肤表面并且长期定植在住院病人的皮肤、咽、呼吸道及消化道，能在医疗设备表面顽强的生存，对温度和酸碱度有很好的耐受性，存活时间很长。鲍曼不动杆菌为条件致病菌，易引起医院感染，根据2006-2007年国内外院内感染监测数据资料显示，鲍曼不动杆菌在院内感染中的检出率居前四位，在免疫力低下的患者中，可以引起严重的甚至致死性的感染。它可以引起呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病。由于鲍曼不动杆菌感染引起的发病率和病死率增加，其被称为“革兰阴性的MRSA”。

[0003] 近年来，鲍曼不动杆菌不但临床检出率逐年增多，易在烧伤科、重症监护病房、血液病房引起爆发流行，更重要的是，由于广谱抗生素的滥用以及鲍曼不动杆菌易对常用抗菌药物耐药的特性，国内广泛出现多重耐药甚至是泛耐药鲍曼不动杆菌引起的各种医院感染流行或爆发情况。细菌耐药性监测协助组(CHINET)监测网资料显示，2007年中国不同地区，所有鲍曼不动杆菌中多重耐药的占47.7％，其中有2.8％的菌株为泛耐药株，并且对碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达37.6％和42.7％。自1991年美国报道首例碳青霉烯类耐药不动杆菌暴发流行以来，世界各地陆续出现此类菌株，国外有学者统计了连续几年在欧洲、北美、巴西、中国、台湾、香港、日本和韩国等地区分离出的多重耐药鲍曼不动杆菌对美罗培南的耐药率，发现呈递增情况。由于此类菌株一旦对碳青霉烯类耐药就意味着对现有的常用抗菌药物多数耐药甚至全部耐药。因其耐药机制复杂性和顽强的生存能力使得该菌的临床感染预防与治疗已经成为了一个棘手的问题。

[0004] 藤黄微球菌为专性需氧革兰氏阳性细菌，广泛分布于空气、水、土壤中，也见于人与动物皮肤、咽部、眼睛等部位，是人和动物的条件致病菌，能引起人的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎。近年来在抗生素选择压力下,条件致病菌日益增多,并且有继续增高的趋势,因此对藤黄微球菌应引起高度的重视。沙门氏菌是一类广泛分布于自然界、对人类和动物健康构成极大危害的革兰氏阴性致病菌,它极易污染食品、水源及畜产品,不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病, 还能引起人类人食物中毒、急性肠胃炎、伤寒、副伤寒、败血症。在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首。因为食品动物长期低剂量使用抗生素会增加耐药菌,并且细菌的耐药基因可以在人群中细菌、动物群中细菌和生态系统中细菌间互相传递,所以导致致病菌产生耐药性而引起人类和动物感染性疾病治疗的失败。

[0005] 蝎子是我国的一种传统名贵中药，具有抗肿瘤，杀虫，抑菌和抗菌功效，其作用主要来源蝎尾毒腺分泌的毒液。从多种蝎毒中鉴定了一类小分子抗菌活性肽，是一类由宿主生成在天然免疫中特异性发挥防御性作用的一类小分子多肽，通常由10-50个氨基酸构成，静电荷从+2到+9等。这样的抗菌肽在大多数生物的天然防御方面具有重要的功能，用于抵御革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、原虫及病毒感染。研究表明阳离子抗菌肽可选择性作用于细胞外膜或信号通路中不同的靶标。与传统抗生素相比较，这可能是细菌对阳离子抗菌肽更难产生抗性的原因。另有一些研究表明抗菌肽不仅具有抗菌活性，而且还作为信号分子参与免疫反应调节(尤其是感染和炎症)。阳离子抗菌肽具有分子量小、广谱抗菌活性及不易产生耐药性等特点，因此可以作为潜在的理想治疗因子。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种从亚洲雨林蝎中分离出的抗菌肽基因。

[0007] 本发明的另一个目的是提供一种亚洲雨林蝎抗菌肽。

[0008] 本发明的再一个目的在于提供一种亚洲雨林蝎抗菌肽在制备治疗或预防耐药鲍曼不动杆菌和革兰氏细菌药物中的应用。该抗菌肽对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长，并且该抗菌肽的毒性小。

[0009] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

[0010] 一种抗菌肽，该抗菌肽来自于亚洲雨林蝎，该抗菌肽由83个氨基酸残基组成，共包括三部分：22个氨基酸残基长的信号肽，43个氨基酸残基长的成熟肽，以及18个氨基酸残基长的前肽。其中成熟肽的氨基酸序列为：GVWDWLKKTAKNVWNSDIVKQLKGKAINAAKNYVAEKIGATPS，见SEQ ID NO 1所示，对成熟肽通过NPSA server和HeliQuest软件结构预测，发现该抗菌肽具有以下抗菌肽的结构特征：α螺旋并有疏水和亲水面。将该抗菌肽命名为Peptocin。

[0011] 本发明还提供了一种编码上述抗菌肽的基因，由402个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。经过同源性比较发现该基因和报道的Opistoporin-1、Opistoporin-2、Pandinin-1和Con13等抗菌肽基因的同源性分别为72.1%、72.1%、64.7%和60.5%，结果表明是个新抗菌肽基因。

[0012] 通过化学合成的方法合成Peptocin抗菌肽，经试验发现Peptocin抗菌肽具有良好的抗菌性，对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，其中对革兰氏阴性细菌： E.coli DH5α，Pseudomonas fluorence，Pseudomonas putida，Salmonella enterica和 Enterobacter cloacae的最小抑制菌生长浓度分别为25 μM、26 μM、27 μM，15 μM和 40μM对革兰氏阳性细菌Bacillus magaterium 和Micrococcus luteus 的最小抑制菌生长浓度均为4 μM，Staphylococcus aureus的最小抑制菌生长浓度为42 μM，。因此本发明所提供的Peptocin抗菌肽可应用于治疗或预防革兰氏病菌的药物中。本发明所提供的Peptocin抗菌肽对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和沙门氏菌(Salmonella enterica)具有良好的抗菌性，能够运用于治疗或预防因藤黄微球菌和沙门氏菌而引起的疾病的药物中。尤其是应用于治疗因藤黄微球菌而引起的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎和脑脓肿等疾病的药物中；以及治疗因沙门氏菌而引起的鸡白痢、仔猪副伤寒、流产疾病以及人的食物中毒、急性肠胃炎、伤寒、副伤寒和败血症等疾病的药物中。

[0013] 本发明所提供的Peptocin抗菌肽对从北京朝阳医院分离的耐药鲍曼不动杆菌的菌株（17488、17498、17191和17286）的MIC均为4 μM，在低浓度的条件下就能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长。能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中，尤其是治疗因耐药鲍曼不动杆菌而引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。

[0014] 本发明所提供的Peptocin抗菌肽和传统抗生素相比，在广谱抗菌和耐药性方面上具有无可比拟的优点。其具有多抗菌机制作用且抗菌机制独特，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，并且对人的正常细胞无害，因此在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下，成为抗生素的最佳替代物。

附图说明

[0015] 图1为本发明提供的抗菌肽Peptocin的基因及其氨基酸序列示意图。

[0016] 图中cDNA序列下方为推断的对应氨基酸序列; 信号肽氨基酸以单下划线标记;成熟肽氨基酸以黑体标记;阴影部分氨基酸为C端前体肽; 多聚腺苷酸化信号以双下划线标记。

[0017] 图2为本发明提供的Peptocin抗菌肽毒性示意图。

具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护内容并不局限于以下实施例。

[0019] Peptocin抗菌肽基因的制备：

[0020] A：蝎毒腺总RNA的提取（RNAiso Plus，购于Takara）

[0021] 1、取电击过好的蝎尾腺迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量）。向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的 RNAiso Plus，充分匀浆。2、 将匀浆液转移至离心管中，室温（15-30℃）静置 5 分钟。3、 向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。4、 室温静置 5 分钟。5、12,000 g 4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含 RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为 DNA）及带有颜色的下层有机相。6、 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。7、 向上清中加入 0.5-1 倍 RNAiso Plus 体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置 10分钟。8、 12,000 g 4℃离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现 RNA 沉淀。9、RNA 沉淀的清洗。小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与 RNAiso Plus 等量的 75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500×g 4℃离心 5 分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。10、RNA 的溶解。打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀。整个过程参照RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）推荐方法进行。制备的蝎毒腺总RNA采用用琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖+溴乙锭）分析检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总RNA。

[0022] B：mRNA的分离纯化

[0023] 采用PolyA Tract mRNA分离系统（Promega, USA）分离和纯化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3ˊ端poly（A）尾的互补配对特性，用生物素标记oligo（dT），通过它与mRNA3ˊ端poly（A）的退火形成杂合体，然后用标有亲和素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo（dT）/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的ddH2O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。具体步骤如下：1、样品的制备：将RNA加入到含有32 μl β-巯基乙醇的800 μl的GTC中。2、探针的退火：取250pM浓度Oligo（dT）5 μl，加入蒸馏水至50 μl；加入1.6 ml预热的dilution buffer （dilution buffer 中已加入32 μl β-巯基乙醇），与RNA混匀，70℃温浴5分钟。3、磁珠的活化：取1.2ml的磁珠SA-PMPS（购自Promega）于1.5 ml的离心管中；用0.5×SSC重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS三次。4、mRNA的获取：将70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟后放在磁架上吸附磁珠，弃上清液；取2ml的0.5×SSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH2O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心（12000g×3分钟）或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA.通过电泳和此外测定mRNA的浓度和纯度。 5、mRNA的沉淀：将上步骤获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，所得沉淀即为mRNA，mRNA将用于cDNA合成。

[0024] C：第一链cDNA合成

[0025] 1、将1000 ng mRNA和1μl 3′SMARTer CDS Primer II A(12 μM)分别加入到0.5 mL PCR管中，用无RNase水的水补足溶液体积至4.5 μl；混匀，简短离心十几秒。2、放在PCR仪中孵育，72℃孵育3 分钟，然后将温度降至42℃孵育2 分钟。3、按照以下的顺序混合试剂。

[0026]

[0027] 混合时要使用混合试剂前才加入反转录酶，混合物应放在微量离心机上短暂离心混合。

[0028] 4、在0.5 mL PCR管加入5.5 μl 上述混合物。上下吹打混匀后短暂离心，在PCR仪上42℃孵育90 分钟。5、在70℃加热10 分钟后终止反应；向其中加入40 μl的TE缓冲液 (pH8.0的10 mM Tris，0.1 mM EDTA)。第一链合成产物至此合成完成，并用于第二链的合成。

[0029] D：第二链cDNA合成

[0030] 1、将 PCR仪预热到95℃，取30 μl cDNA第1链放人1.5 mL的反应管中，加入222 μl超纯水、30 μl 10×Advantage 2 PCR缓冲液、6 μl 50×dNTP聚合物(10 mM)、6 μl5 ˊ PCR引物II A(12 μM)和6 μl 50×Advantage 2酶聚合物，短暂离心后充分混匀，
2、每个样本分成3管并标记为A，B，C，各100 μl进行PCR反应。PCR反应条件为95℃ 1 分钟，95℃15 s，65℃30 s，68℃3 分钟，共15个循环。3、当每个反应管进行15个循环时，在C管中取30 μl到另一个0.5mL反应管标记为优化，在4℃下保存A，B及C管中余下的
70 μl。分别在13，15，18，21，24个循环时从优化管中取走PCR产物5 μl。4、用1.2％琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液，对所留取的5 μl产物进行电泳，根据其结果来决定最佳循环数及PCE产物质量及纯度。5、取出4℃储存的15个循环的A，B，C管加到优化的循环数，6、将各样本混合到1.5mL离心管中。

[0031] E：双链cDNA与pMD19-T载体的连接和转化

[0032] 1、在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

[0033] pMD®19-T Simple Vector*1 1 μl

[0034] cDNA 1 μl

[0035] dH2O 3 μl

[0036] 2、加入5 μl（等量）的Solution I。3、在16℃反应30分钟。4、全量（10 μl）加入至100 μlDH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。5、42℃加热45s后，再在冰中放置1分钟。6、加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。7、 在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8、挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

[0037] H: 用PCR策略筛选cDNA文库

[0038] 使用pMD19-T载体的载体引物，正向引物：5’- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’反向引物：5’-CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC-3’，菌液PCR确认载体中中插入片段的长度大小。将PCR产物为300bp-700bp大小的克隆子测序。测序获得的序列经过生物软件ORF、SignalP4.0和NCBI(美国国立生物技术信息中心)网页进行序列比对判断其基因结构和同源性。结果表明为新抗菌肽基因，命名为Peptocin。抗菌肽Peptocin的氨基酸序列见图1所示，从图1中可以看出它由以下三部分组成：信号肽（22个残基），成熟肽（43个残基），以及前肽（18个残基）。其成熟肽序列为GVWDWLKKTAKNVWNSDIVKQLKGKAINAAKNYVAEKIGATPS。

[0039] 化学合成蝎毒抗菌肽Peptocin

[0040] Peptocin抗菌肽的前体组织形式编码83个氨基酸残基，该抗菌肽由三部分组成：22个氨基酸残基长的信号肽，43个氨基酸残基长的成熟肽，以及18个氨基酸残基长的前肽，其氨基酸序列见SEQ ID NO 1。通过化学合成的方法，得到纯度为90.91%，且与天然抗菌肽Peptocin氨基酸序列一致的合成多肽。

[0041] 抗菌肽Peptocin药物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑制试验[0042] 实验 对象 包 括以 下细 菌：革 兰氏 阳性 细菌 Staphylococcus aureus（CCTCC:AB 94004），Bacillus magaterium （CCTCC:AB 90008），Micrococcus luteus （CCTCC:AB2010179）；革 兰 氏 阴 性 细 菌 E.coli DH5α，Pseudomonas fluorences （CCTCC:PF），Pseudomonas putida （CCTCC:PP），Enterobacter cloacae （CCTCC:AB2010162），Salmonella enterica (CCTCC:AB 2010185) ，以及耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）菌株（17488、17498、17191和17286）。以上革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均购于中国典型培养物保藏中心，实验使用的耐药鲍曼不动杆菌所有菌株均是从北京朝阳医院分离的。

[0043] 对以上细菌采用96孔板培养法试验：1、分别将革兰氏阳性细菌Staphylococcus aureus（CCTCC:AB 94004），Bacillus magaterium （CCTCC:AB 90008），Micrococcus luteus （CCTCC:AB2010179），革兰氏阴性细菌 E.coli DH5α，Pseudomonas fluorences （CCTCC:PF），Pseudomonas putida （CCTCC:PP），Enterobacter cloacae （CCTCC:AB2010162），Salmonella enterica (CCTCC:AB 2010185) 和耐药病原菌耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）菌株（17488、17498、17191和17286）培养到OD600=0.8时，稀释
400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20 μl经等比稀释Peptocin，负对照只加菌，空白对照只有培养基。 2、37℃培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在
600nm波长处的吸光值；3、确定Peptocin 的10倍稀释的最低抑制浓度之后。将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复本实验实例实验的前两个步骤。最终确定蝎毒抗菌肽Peptocin对细菌的最低抑制浓度。

[0044] 经试验，抗菌肽Peptocin对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，其中对革兰氏阴性细菌：E.coli DH5α，Pseudomonas fluorence，Pseudomonas putida，Salmonella enterica 和Enterobacter cloacae的最小抑制菌生长浓度分别为25 μM、26 μM、27 μM 、15 μM 和40 μM ，革兰氏阳性细菌Bacillus magaterium 和Micrococcus luteus 的最小抑制菌生长浓度均为4 μM，Staphylococcus aureus的最小抑制菌生长浓度为42 μM，见表1。抗菌肽Peptocin对藤黄微球菌Micrococcus luteus和沙门氏菌Salmonella enterica的抗菌效果显著，能够运用于治疗或预防因藤黄微球菌和沙门氏菌而引起的疾病的药物中。尤其是治疗因藤黄微球菌而引起的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎和脑脓肿等疾病的药物中；和治疗因沙门氏菌而引起的鸡白痢、仔猪副伤寒、流产疾病以及人的食物中毒、急性肠胃炎、伤寒、副伤寒和败血症等疾病的药物中。

[0045] 表1:抗菌肽Peptocin对革兰氏细菌的抑制效果

[0046]

[0047] 抗菌肽Peptocin对从北京朝阳医院分离的耐药鲍曼不动杆菌的菌株（17488、17498、17191和17286）的MIC为4μM，在低浓度的条件下就能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长，见表2。因此本发明提供的抗菌肽Peptocin能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。

[0048] 表2:蝎毒抗菌肽Peptocin的抑制耐药鲍曼不动杆菌效果

[0049]

[0050] 抗菌肽Peptocin药物的毒性试验

[0051] 1、用无菌的0.9%NaCl溶液重悬人的红细胞，3,000×g离心5 min，重复以上操作直到红细胞悬浮液的OD值等于0.9%NaCl溶液的OD值；2、用0.9%浓度的NaCl溶液稀7 8
释红细胞悬浮液直到浓度为1×10~10cells/ml;3、实验组Atreatment是含有各个Peptocin抗菌肽浓度的红细胞悬浮液，空白组Ablank只有红细胞悬浮液，100%裂解组Atrtion是加入
10% Triton X-100的红细胞悬浮液，全部样品放在37℃条件下温育30min；4、所有样品
10,000×g 离心5 min，取上清，并测上清的OD570nm值；5、测试Peptocin对红细胞的裂解率，实验结果见图2，其中裂解率按以下公式计算：

[0052] % hemolysis= ( Atreatment-Ablank)/(ATriton -Ablank )×100%