富集干细胞的三步分离法

摘要

本发明公开了富集干细胞的三步分离法，解决现有技术分选的精确性不高，分选的成本较高的问题。本发明包括以下步骤：（1）细胞的纯化：通过差时贴壁和差时硝化的方法对原始细胞群进行纯化处理；（2）细胞的分群：通过Percoll连续密度梯度离心的方法对纯化后的细胞进行分群处理；（3）细胞的富集：通过培养液对细分群后的细胞进行培养，从中挑选出形成最大克隆球的细胞，即为干细胞。本发明将干细胞的贴壁强度特征、密度大小特征、克隆形成特征联合起来进行分选，更加精确地富集了干细胞。

权利要求

1.肝癌干细胞的三步分离法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）肝癌细胞的纯化：通过差时贴壁和差时消化的方法对原始细胞群进行纯化处理；

（2）肝癌细胞的分群：通过Percoll连续密度梯度离心的方法对纯化后的细胞进行分群处理；

（3）肝癌干细胞的富集：通过培养液对分群后的细胞在悬浮培养条件下进行培养，从中挑选出形成最大克隆球的细胞，即为肝癌干细胞；

其中， 所述步骤（1）具体方法为：将原始细胞群进行贴壁处理，弃去在120min之内未贴壁的细胞，将成功贴壁的细胞再进行胰酶消化，时间为3～5min，弃去被消化下来的细胞，重复对成功贴壁的细胞进行胰酶消化2～4次，即得纯化后的细胞群；

所述步骤（2）具体的方法为：取Percoll和9%NaCl溶液以体积比为9：1的比例配成等渗液，再用培养液将等渗液配成Percoll梯度离心液，接着低温超速离心形成连续密度梯度，然后将纯化后的细胞群悬液置于Percoll梯度离心液上层，在500×g条件下离心

15min，静置15min，细胞在离心管内分层；

所述步骤（3）具体的方法为：将分层后的细胞依次从离心管顶部移出，通过含0.1%青链霉素的Hanks液清洗细胞2次，离心10min，通过流式细胞仪或细胞计数板计算各层细胞占分层之前细胞的比例，选取细胞比例最小的细胞群，加培养液种植于悬浮培养条件下，培养20天后将形成最大克隆球的细胞挑选出来，即为干细胞；

所述培养液由15%胎牛血清、10μg/ml表皮生长因子和10μg/ml白血病分化抑制因子组成；

所述步骤（2）中Percoll梯度离心液的浓度为40%；所述低温超速离心的具体参数为

4℃，20000×g，离心时间为90min，静置时间为30min。

说明书

富集干细胞的三步分离法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种富集干细胞的三步分离法。

背景技术

[0002] 目前利用表面标志进行干细胞分选是经典的方法，通常是通过流式细胞仪进行阳性或者阴性分选。利用此项技术进行分选，先决条件是该类干细胞必须有确定的表面标志。然而对于部分类型的干细胞（如肝干细胞和肝癌干细胞）缺乏相对确定和公认的标志。同时该类分离技术本身存在着其他不足：（1）标志分选的假阳性难以避免；（2）为了保证分选的精确性，常需要多个标志的联合分选，因此价格相对昂贵。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种富集干细胞的三步分离法，解决现有技术分选的精确性不高，分选的成本较高的问题。

[0004] 本发明通过下述技术方案实现：

[0005] 富集干细胞的三步分离法，包括以下步骤：

[0006] （1）细胞的纯化：通过差时贴壁和差时硝化的方法对原始细胞群进行纯化处理；

[0007] （2）细胞的分群：通过Percoll连续密度梯度离心的方法对纯化后的细胞进行分群处理；

[0008] （3）细胞的富集：通过培养液对分群后的细胞进行培养，从中挑选出形成最大克隆球的细胞，即为干细胞。

[0009] 进一步地，所述步骤（1）具体方法为：将原始细胞群进行贴壁处理，弃去在120min之内未贴壁的细胞，将成功贴壁的细胞再进行胰酶消化，时间为3～5min，弃去被消化下来的细胞，重复对成功贴壁的细胞进行胰酶消化2～4次，即得纯化后的细胞群。

[0010] 再进一步地，所述步骤（2）具体的方法为：取Percoll和9%NaCl溶液以体积比为9：1的比例配成等渗液，再用培养液将等渗液配成Percoll梯度离心液，接着低温超速离心形成连续密度梯度，然后将纯化后的细胞群悬液置于Percoll梯度离心液上层，在500×g条件下离心15min，静置15min，细胞在离心管内分层。

[0011] 更近一步地，所述步骤（3）具体的方法为：将分层后的细胞依次从离心管顶部移出，通过含0.1%青链霉素的Hanks液清洗细胞2次，离心10min，通过流式细胞仪或细胞计数板计算各层细胞占分层之前细胞的比例，选取细胞比例最小的细胞群，加培养液种植于悬浮培养条件下，培养20天后将形成最大克隆球的细胞挑选出来，即为干细胞。

[0012] 作为一种优选，所述培养液由15%胎牛血清、10μg/ml表皮生长因子和10μg/ml白血病分化抑制因子组成。

[0013] 另外，所述步骤（2）中Percoll梯度离心液的浓度为40%；所述低温超速离心的具体参数为4℃，20000×g，离心时间为90min，静置时间为30min。

[0014] 本发明具有以下优点及有益效果：

[0015] 本发明将干细胞的贴壁强度特征、密度大小特征、克隆形成特征联合起来进行分选，更加精确地富集了干细胞，（1）避免了部分干细胞标志不明的限制性；（2）应用范围更为广泛，可以进行各种组织类型干细胞的富集；（3）分选精度高，去除了其他分选方法带来的假阳性混杂；（4）操作方法简便，不需要大型仪器设备如流式细胞分选仪；（5）价格低廉，分离花费较少；（6）本发明在细胞的分群步骤中所采用的离心条件为4℃，20000×g，离心时间90min，其目的在于能够将不同密度的细胞完全分层，不会出现密度的小的细胞与密度大的细胞未能分离，导致分层不精确。

附图说明

[0016] 图1为本发明-实施例中肝癌组织分离与肝癌细胞培养。

[0017] 图2为本发明-实施例中肝癌细胞的培养和纯化。

[0018] 图3为本发明-实施例中肝癌细胞的分层和各层细胞的比例。

[0019] 图4为本发明-实施例中各层肝癌细胞的形态特征。

[0020] 图5为本发明-实施例中各层肝癌细胞的标志表达。

[0021] 图6为本发明-实施例中各层肝癌细胞的侵袭迁移能力。

[0022] 图7为本发明-实施例中各层肝癌细胞的成瘤能力。

[0023] 图8为本发明-实施例中悬浮培养的细胞克隆形成实验。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。实施例

[0025] 本实施例是针对大鼠肝癌干细胞的分离，首先让大鼠饮用含有0.05%DEN水持续6周，然后改为正常饮水，造就大鼠肝癌模型。在18周时将大鼠麻醉，然后解剖大鼠腹腔，观察肝脏成瘤情况。将肝癌结节从大鼠体内移出，浸泡于含有0.1%IV型胶原酶和0.005%胰蛋白酶的无血清培养基中，在37℃条件下摇晃孵育20min，收集被消化的细胞团块，通过直径为100μm的尼龙筛网，制备成细胞悬液放入离心机1000×g离心8min。收集底层细胞团块，利用PBS重悬成为细胞悬液，贴壁培养后形成肝癌细胞群。具体的肝癌细胞分离和培养结果如图1所示。图1中Ⅰ为大鼠肝脏上的原发癌结节（箭头示），Ⅱ为肺中发生的多发转移性肝癌结节（箭头示），Ⅲ为肝癌的HE鉴定，肝癌细胞原代培养（Ⅳ）4天，（Ⅴ）15天，（Ⅵ）30天。原始放大倍数，100×Ⅲ-Ⅵ。

[0026] 肝癌细胞的纯化：将上述培养后形成的肝癌细胞群进行贴壁处理，弃去在120min之内未贴壁的细胞，留下剩余细胞继续培养；在细胞贴壁后扩增时，将贴壁的细胞进行胰酶消化，时间为3～5min，移除被消化下来的细胞，重复对成功贴壁的细胞进行胰酶消化3次，得到了纯化后的细胞，纯化前后的肝癌细胞形态对比结果如图2。图2中左侧图片便是纯化前的肝癌细胞，细胞大小不一形态各异；右侧图片表示纯化后的肝癌细胞，细胞形态相对均匀一致。

[0027] 肝癌细胞的分群：首先，取Percoll和9%NaCl溶液以体积比为9：1的比例配成等渗液，再用培养液将等渗液配成40%的Percoll梯度离心液，然后分别加入到两个离心管内，并在4℃，20000×g条件下，离心90min，静置30min，形成连续密度梯度。上述参数的目的是为了让细胞分离的更加精确，不会出现小密度的细胞和大密度的细胞未分离开，从而导致分离不够精确。原因是速度较快小密度的细胞会与大密度的细胞一起离心到离心管底部；速度较慢，大密度的细胞则仍出现在离心管顶部，未离心到离心管底部。接着向其中一个离心管加入指示珠，在500×g条件下离心15min，静置10min，通过观察指示珠各颜色充分分散，以确认形成了连续密度梯度，然后向另外一个离心管内加入纯化后的细胞群悬液，在500×g条件下离心15min，静置10min。如图3所示，根据密度梯度指示珠的标识，将细胞分为四群。分别收集各群细胞，进行干细胞特性的对比鉴定。图3中第一层到第四层细胞的比例分别为：22.18±2.13%、11.62±1.06%、4.73±0.38%、61.47±6.24%，其中第三层（FIII）具有最少的细胞数，不到肝癌细胞群总数的5%。

[0028] 各群肝癌细胞的特征对比：通过肝癌细胞的分群处理，根据肝癌细胞中细胞的密度范围，我们将纯化的肝癌细胞分为四部分，并发现第三层的细胞最少，为潜在的肝癌干细胞所在层次，为了确认这个推测，我们进行了如下肝癌干细胞特征的检测。

[0029] 肿瘤干细胞形态学的检测：如图4所示，通过光镜和电镜观察，我们发现第三层的细胞形态较为不规则，同时该层细胞核浆比最大，细胞数最少，为潜在的肝癌干细胞形态特征。图4中上排为光镜下细胞形态，下排为透射电镜下的细胞形态。

[0030] 肿瘤干细胞标志物的检测：如图5所示，通过流式细胞术，检测了目前较为常用的肝癌干细胞潜在标志物（CD1233和EpCAM）。结果提示第三层的细胞最高表达上述两种干细胞标志。图5中上排代表CD133的表达情况，下排代表EpCAM的表达情况。

[0031] 肿瘤干细胞侵袭迁移能力的检测：如图6所示，肝癌干细胞较普通肝癌细胞应具有更强的侵袭迁移能力。通过Transwell实验和划痕实验，发现第三层的细胞能最大程度穿透小孔，并具有最强能力迁移进而修复划痕。图6中上排代表Transwell实验各层细胞的穿透小孔情况，下排代表划痕实验中48小时后划痕被迁移细胞闭合的情况。

[0032] 体内裸鼠成瘤的检测：裸鼠成瘤实验被认为是验证肿瘤干细胞的“金标准”，为了检测各层细胞体内增殖能力。将各层细胞按相同数量（1×105）移植入裸鼠体内，如图7所示，结果发现第三层的细胞最快在皮下形成肿瘤，并且需要细胞数量最少，此外第三层细胞还能迁移到肝脏形成肿瘤。图7中第一排代表皮下成瘤的大体情况，第二排代表肝脏成瘤的大体情况，第三排代表肿瘤组织的病理学检测。

[0033] 肝癌干细胞的富集：将上述第三层细胞培养于悬浮环境下，具体培养条件为含有15%肽牛血清、10μg/ml表面生长因子和10μg/ml白血病分化抑制因子的Willianms′E培养基。在培养过程中，发现细胞呈现不同的克隆形成能力，而这种能力被认为是干细胞的特征之一。随着时间的推移，细胞逐渐出现细胞克隆大小的差异，克隆能力较强的细胞不断扩增形成直径增长的球形细胞团，如图8-A所示。培养20天后，细胞呈现显著差异的细胞克隆团，如图8-B，这时挑出较大的细胞克隆团作为肝癌干细胞。图8中A为悬浮培养第1、
7、14、21、25天克隆能力强的细胞扩增过程；B为悬浮培养20天后细胞形成大小不同的克隆球。

[0034] 按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。