银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株

摘要

本发明涉及银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株。本发明的选育方法包括如下步骤：1）洗下银耳出发菌株新鲜耳片上的担孢子，涂布到金属培养皿上，无菌风吹干；2）真空条件下，对金属培养皿上的银耳担孢子进行低能N+离子束注入诱变，辐射诱变剂量为5×1014-5×1015ions/cm2；3）培养诱变后的银耳担孢子，筛选菌体干重高的银耳菌株；4）将筛选到的菌株和香灰菌菌株配对后栽培，筛选产量高的银耳菌株。本发明还提供以所述方法选育的一个银耳菌株（Tremella fuciformis），其保藏号为CGMCC No.7458，该菌株产量比原菌株提高13.5%，银耳多糖含量提高5.41%。

权利要求

1.一个银耳菌株(Tremella fuciformis)，其保藏号为CGMCC No.7458。

2.权利要求1所述银耳菌株作为栽培菌株的应用。

说明书

银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株

技术领域

[0001] 本发明属于食用菌培育领域，特别涉及银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株。

背景技术

[0002] 银耳又称白木耳，属于菌物界，担子菌门，银耳纲，银耳目，银耳科，银耳属，是一种珍贵的药食兼用的胶质菌，营养价值十分丰富。我国是银耳的主要生产国，出口量约占世界银耳贸易量的90％以上。目前银耳现有栽培品种主要有黄色银耳和白色银耳两种，主要来自于野生银耳菌种的长期驯化及人工选择，这种传统的银耳菌种选育方法培育出的银耳菌种产量不高，且容易退化，不稳定。目前迫切需要发掘高产、稳定、品质优良的银耳菌种资源，提高银耳产量的同时提升银耳品质。

[0003] 离子束注入诱变技术是20世纪80年代由中国科学院余增亮等人首先应用于农作物育种中，用于选育水稻、小麦、玉米等农作物，随着技术的发展，逐渐应用于微生物诱变育种研究，并且成功选育花生四烯酸生产菌株等，是一种有效的育种手段。离子束注入诱变技术与传统的紫外线、X射线、γ射线等相比，除了具有能量沉积外，还有动量传递，质量沉积及电荷交换等效应。加之可根据不同的诱变育种需要，选用不同种类的离子、能量、剂量进行组合，因而具有突变谱广、突变率高、突变体遗传稳定性高、回复突变率低等优点。现有文+献报道，全卫丰等人发明的专利CN102067788B公开了一种低能N 离子束注入诱变选育灵芝菌株的方法，并成功的选育出了一株高产的灵芝菌株。

[0004] 尚未见到有关采用离子束注入技术诱变选育银耳的任何报道。一般来说不同种类的微生物，细菌类菌体细胞的大小和细胞壁的薄厚不同、真菌类孢子大小和孢子壁薄厚不同，因此对离子束注入能量、剂量的耐受程度不同，存活率和突变率也不一致，会使得不同种类的微生物具有不同的最佳诱变条件，在此条件下能够得到较高的突变率，能够筛选得到较多的突变菌株，尤其是我们想要得到的正突变菌株，这种方法是不能从一种微生物照搬到另外一种微生物的。

[0005] 因此本发明针对银耳菌株进行离子束注入技术诱变是一项创造性工作，选育得到的菌株为目前市场上不能获得的菌株。

发明内容

[0006] 为开拓银耳菌种选育的新途径，发掘高产、稳定、品质优良的银耳菌种，本发明的目的在于提供银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株。

[0007] 本发明提供一种银耳菌株离子束注入诱变选育方法，包括如下步骤：

[0008] 1）用无菌水洗下银耳出发菌株新鲜耳片上的担孢子，涂布到金属培养皿上，无菌风吹干；

[0009] 2）真空条件下，对金属培养皿上的银耳担孢子进行低能N+离子束注入诱变，能-3 15 15量为30kev，真空度为10 Pa，采用连续注入方式，辐射诱变剂量为1×10 -2.5×10 ions/
2
cm ；

[0010] 3）培养诱变后的银耳担孢子，筛选菌体干重比银耳出发菌株高的银耳菌株；

[0011] 4）将步骤3）筛选到的银耳菌株和香灰菌菌株配对后栽培，测定栽培后的产量，筛选产量提高的菌株，并分离保存菌株。

[0012] 步骤1）所述出发菌株为产量高、品质好的现有银耳菌株。

[0013] 步骤1）所述银耳出发菌株新鲜耳片，为出发菌株瓶栽获得的新鲜干净的银耳耳片。

[0014] 步骤1）所述涂布，用玻璃棒或金属棒涂布。

[0015] 本发明还提供所述银耳菌株离子束注入诱变选育方法在银耳菌株选育中的应用。

[0016] 以本发明银耳菌株离子束注入诱变选育方法选育的一个银耳菌株（Tremella fuciformis），其保藏号为CGMCC No.7458，于2013年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

[0017] 所述保藏号为CGMCC No.7458的银耳菌株遗传性状稳定，产量比原菌株提高13.5%，银耳多糖含量提高5.41%。

[0018] 本发明还提供所述银耳菌株作为栽培菌株的应用。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 本发明的银耳菌株离子束注入诱变选育方法，摸索到了针对银耳菌株的离子束注入诱变的最佳剂量，以本发明的方法诱变银耳菌株，能筛选到更多高产的银耳突变菌株，大大拓宽了银耳菌株选育的范围。

[0021] 本发明所述的保藏号为CGMCC No.7458的银耳菌株遗传性状稳定，产量比原菌株提高13.5%，银耳多糖含量提高5.41%，是优良的银耳菌株。

附图说明

[0022] 图1为本发明实施例1离子束注入剂量对银耳孢子存活率的影响曲线图。

[0023] 图2为本发明实施例2离子束注入剂量对银耳菌株正突变率的影响曲线图。

具体实施方式

[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

[0025] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0026] 本发明实施例所用培养基配方如下：

[0027] 土豆汁：200g土豆煮汁1000ml。

[0028] PDA培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂粉15g，土豆汁定容至1000ml，pH值自然，121℃，30min灭菌。

[0029] PDB培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，土豆汁定容至1000ml，pH值自然，121℃，30min灭菌。

[0030] 木屑瓶栽培养基：木屑67%，麸皮32%，石膏粉1%，水与料比为1.2-1.5：1。

[0031] 袋料栽培培养基：棉籽壳83%，麸皮15%，石膏粉2%，水与料比为1.0-1.2：1。

[0032] 无菌水：超纯水（由密理博纯水机MiliQ A10制出的超纯水）121℃灭菌30min。

[0033] 本发明实施例所用化学试剂除琼脂为生物级外，其它均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。土豆、木屑、麸皮、石膏粉、棉籽壳等均可市购。

[0034] 实施例1离子注入剂量的确定

[0035] 出发菌株：北京市辐射中心微生物育种实验室保存的银耳菌株（Tremella fuciformis BRC010），该银耳菌株由福建采集的野生银耳分离得到，经过实验室驯化，性能优良，由福建省古田县州洋农业科技有限公司进行栽培实验验证，并已保存菌种。

[0036] 银耳担孢子的获得

[0037] 在实验室中将银耳出发菌株采用木屑培养基进行瓶栽，20-22℃培养出耳，获得新鲜的银耳子实体。

[0038] 将20-30g新鲜干净的银耳耳片（子实体），用镊子和解剖刀取下，放入装有35ml无菌水的50ml无菌离心管中，盖好盖子，放在漩涡振荡器上剧烈震荡多次，也可以用手拿住离心管两端，上下剧烈震荡数分钟，将银耳耳片上担孢子充分洗脱到无菌水中，得到银耳担孢子悬液。

[0039] 在无菌条件下，将银耳担孢子悬液采用无菌移液管或移液枪吸取0.1-0.5ml，采用玻璃或金属涂布棒均匀涂布到金属培养皿表面，在超净台中用无菌风吹干。所述金属培养皿为本单位为进行离子束注入诱变实验专门设计的专用设备，离子束注入诱变是在真空状态下进行的，因此我们设计了双层金属培养皿，下层为边缘带有透气孔的金属层，上层为边缘密封的金属层，需要将银耳担孢子分别涂布到两层上，其中上层用来做离子束注入实验，下层带有透气孔的作为真空对照，保证真空对照和离子束注入样品在真空靶室内停留的时间和条件完全一致，排除真空度对担孢子存活率的影响，同时，金属培养皿具有一定的导电性，同时也可以防止因带电离子电荷的累积而导致的放电。

[0040] 银耳菌株的低能N+离子束诱变

[0041] 实验使用仪器设备为北京市辐射中心（北京师范大学核科学与技术学院）低能离+ -3子注入机BNU-400，银耳担孢子离子束注入诱变采用N 离子，真空度为10 Pa，采用连续注入方式，并且针对不同能量和不同注入剂量的条件进行优选，能量范围为30-100kev，
12 16 2 12 12 13
注入剂量范围为1×10 -1×10 ions/cm，具体的注入剂量设为1×10 、5×10 、1×10 、
13 14 14 15 15 16 2
5×10 、1×10 、5×10 、1×10 、5×10 、1×10 ions/cm。

[0042] 低能N+离子束诱变对菌株存活率的影响

[0043] 将诱变后的金属培养皿加入1ml无菌水，用无菌玻璃或金属涂布棒刮取涂布的担孢子，将担孢子充分洗脱，用无菌移液管或移液枪将洗脱液吸取转移到无菌EP管中，再进行梯度稀释，分别吸取0.1ml涂布PDA固体平板，每个样品3个平行实验，20-25℃恒温培养5d，统计每个稀释度担孢子存活数量，以真空对照样品洗脱后涂布平板得到的担孢子数为对照，计算存活率，计算公示如下：

[0044] 存活率（%）=离子注入样品担孢子数/真空对照样品担孢子数×100%[0045] 统 计 1×1012、5×1012、1×1013、5×1013、1×1014、5×1014、1×1015、5×1015、16 2 14 15
1×10 ions/cm 这9个剂量下的存活率，得到诱变较佳的剂量范围为5×10 -5×10 ions/
2 14 14 14 14 14 14
cm。在较佳的剂量范围内，分别在5×10 、10×10 、15×10 、20×10 、25×10 、30×10 、
14 14 14 14 2
35×10 、40×10 、45×10 、50×10 ions/cm 这10个剂量重复进行诱变实验，并统计不同剂量下存活率，得到存活率曲线如图1所示。

[0046] 如图1所示的存活率曲线反应的是银耳担孢子存活率与离子束注入剂量之间的变化关系，呈现出“马鞍形曲线”，随着注入剂量的增加，银耳担孢子存活率先迅速下降，然后有一个上升之后继续下降，一般认为在马鞍型曲线的拐点处及其附近区域的离子注入剂15 2
量较佳（图1中拐点位置为1.5×10 ions/cm，在这个位置及其附近区域），可以获得较多的正突变菌株。

[0047] 实施例2银耳菌株的筛选

[0048] 银耳菌株的培养

[0049] 将实施例1中统计存活数量的银耳PDA平板上已经萌发的担孢子分别挑取到新的PDA平板上，每个平板接种1个萌发的担孢子，萌发后的银耳担孢子就是银耳菌，将银耳菌放入20-25℃恒温培养箱中培养，会在银耳菌周围形成白色的菌丝，有些还会形成酵母样芽孢。

[0050] 银耳菌株的挑选

[0051] 银耳菌萌发菌丝后形成圆形或近圆形菌落，测定菌落直径大小可以初步判断银耳菌生长的快慢，挑选出生长速度较快的银耳菌。

[0052] 银耳菌株的液体培养

[0053] 将挑选出的银耳菌落，转接进行液体培养，采用PDB培养基，三角瓶摇床培养，摇床转速为180-220转/min，20-25℃恒温培养10-15d。将液体培养物8000rpm，离心5min，倒掉上清液，沉淀物转移至培养皿中冷冻干燥，称量干重。与出发菌株相比，诱变后银耳菌株菌体干重增加5%及以上的菌株为正突变菌株，按照本方法统计不同注入剂量下银耳菌株的正突变率，找到正突变率较高的离子束注入剂量，银耳菌株正突变率与离子束注入剂15 15 2
量的关系如图2所示，在1×10 -2.5×10 ions/cm 范围内时正突变率较高，为离子束注入诱变的最佳条件。

[0054] 由此得到银耳离子束注入诱变最佳条件为能量30kev，注入剂量为15 15 2
1×10 -2.5×10 ions/cm，在此条件下多次重复进行离子束注入诱变实验，并筛选高产银耳菌株。

[0055] 银耳菌和香灰菌的配对

[0056] 银耳子实体的形成比较特殊，必须要银耳菌和香灰菌（来源为福建省古田县州洋农业科技有限公司）同时存在，才能够形成原基并长出银耳子实体，因此将初筛得到的产量提高的银耳菌和栽培通用的香灰菌进行配对，制作栽培母种及栽培种。配对方式为常规方法。

[0057] 银耳栽培实验

[0058] 将配对后的银耳栽培种进行袋料栽培实验，对筛选得到的银耳菌株全部采用相同的培养袋料、培养温度、湿度、通风等条件，统计银耳产量，并测定银耳子实体多糖含量。

[0059] 实施例3以本发明的方法筛选出的一个银耳菌株

[0060] 以本发明方法筛选出的一个银耳菌株（具体方法见实施例1、2），对其进行传代稳定性实验，传代15次，每次分别与香灰菌配对后进行栽培实验，与第一代相比，子实体产量稳定，各代之间的产量无显著性差异（P>0.05），且银耳在朵型大小和光泽度等方面均稳定无变化，该银耳菌株为通过离子束注入诱变筛选得到的高产菌株，产量比原菌株提高13.5%，银耳多糖含量提高5.41%，且遗传性状稳定，该银耳菌株保存于2013年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

[0061] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。