一种牡丹组织培养生根新方法

摘要

本发明以豆绿、岛锦和海黄牡丹的鳞芽作为外植体，在无菌条件下采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理，经过“无菌株系的建立”、“继代增殖培养”和“诱导生根培养”三个环节获得组培生根苗，生根率分别为豆绿50.0%～66.7%、岛锦33.3%～86.7%、海黄31.4%～73.5%。

权利要求

1.一种牡丹组织培养生根方法，其特征在于由“无菌株系的建立”、“继代增殖培养”和“诱导生根培养”三个环节组成，在诱导生根培养基中加入三十烷醇（TA），配以生长素促进生根，无菌株系的建立：以牡丹鳞芽作为外植体，在无菌条件下采用三步消毒法进行消毒处理，鳞芽接种于诱导培养基诱导鳞芽萌发，诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入

6-BA0.1～1.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，不定芽形成，无菌株系建成；继代增殖培养：把不定芽切割，接种于增殖培养基诱导形成丛生芽，再将丛生芽分割成带1～2个芽的小芽丛，接种于相同的培养基上继续进行继代增殖培养，增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA0.5～3.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、AC0～2g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L；诱导生根培养：选取增殖培养中的健壮丛生芽接种到生根培养基进行生根诱导培养，形成生根苗，生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，再加入IBA1.0～5.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA0.1～2g/L、蔗糖30～50g/L、琼脂6g/L；鳞芽消毒处理所采用的三步消毒法为：第一步用75%的乙醇消毒30～60s，第二步用1%的次氯酸钠消毒8～15 min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒10～20min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触；无菌株系的建立、继代增殖培养和诱导生根培养三个环节的条件相同，均为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d；选用的牡丹品种为海黄、岛锦和豆绿。

说明书

一种牡丹组织培养生根新方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，特别涉及一种牡丹组织培养生根新方法。

背景技术

[0002] 牡丹（Paeonia suffruticosa Andr）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属(Paeonia)多年生深根性落叶灌木，叶互生，具长柄。花单性或两性,顶生，花期4～5月。蓇葖果，成熟时开裂，内藏5～15枚种子,呈不规则圆形,褐色或黑色。牡丹原产于我国西部秦岭和大巴山一带,栽培史已有1600多年，世界各国种植的牡丹均引种于中国。牡丹性喜阳光，耐寒，爱凉爽环境，不耐高温，对土壤条件要求高，适宜于半干半湿的疏松、肥沃、排水良好的砂质土壤中生长，牡丹根须较长，植株较大，适于地栽。牡丹花朵着生于花枝顶端，多单生，直径可达20cm左右，花型有单瓣型、荷花型、菊花型、蔷薇型、托桂型、绣球型、皇冠型、金环型、千层台阁型、楼子台阁型等十多种，花色有红、白、粉、黄、紫、蓝、绿、黑及复色等9大色系，已达上千个品种。牡丹属珍贵花卉，是我国特产的传统名花，用途十分广泛，作为观赏花卉可用于年宵花、鲜切花、园林、院落、花坛、花带和盆栽种植等等，极具观赏性。牡丹的花瓣可食用和酿酒，是很有特色的美味佳肴。在药用上，牡丹的根皮入药称为丹皮，用作通经药和强健剂，有镇痉、镇痛、活血、散瘀等作用。其观赏价值和经济价值相当可观。牡丹传统的繁殖方式有播种法、分株法和嫁接法等，播种法的繁殖系数大，但所需时间长，从播种到开花一般需要3-4年时间，另外，牡丹种子具有休眠特性，而且单瓣花品种结实多，半重瓣品种次之，重瓣品种雌蕊或雄蕊易瓣化不结实，实生苗变异大，不易保持母株优良性状，因此，播种法不适用于具有高观赏价值的重瓣品种快速繁殖的要求；分株法或嫁接法繁殖的苗当年可开花，但繁殖系数低，生产成本高，单位面积投资大，苗木原株病虫害易传染给子株，并且受时间和季节限制。这些问题制约了牡丹名贵品种的繁育、推广及苗木的大规模生产，无法满足近年来日益增长的牡丹商品化、产业化和规模化生产的市场需求。

[0003] 植物组培快繁技术是加快和促进牡丹育种和繁殖的主要技术和有效手段，自1984年李玉龙等人首次报道牡丹试管苗繁殖技术的研究以来，相关研究日益增多，现有报道中国内外研究者针对牡丹组培快繁技术的研究主要集中在外植体的选择与处理、褐化与玻璃化的防治、培养基组成成分及环境因素调控等方面，以往的研究结果表明，牡丹的不同品种之间差异显著，在自然条件下增殖倍数低的品种，在组织培养条件下繁殖系数也很小，组织培养条件下的繁殖难易程度和常规条件下繁殖的难易程度一致。要获得牡丹组培植株的关键是生根和炼苗移栽，尤其是生根技术，目前牡丹的组培生根技术表现出生根率低，生根质量差，很难获得再生植株等问题，成为制约牡丹组培技术进展的最大瓶颈，生根培养的关键是培养基，常用的基本培养基有MS、LP、改良MS、1/2MS和改良WPM等，IBA对某些牡丹品种生根有效，也有使用NAA或IAA诱导生根的报道，生根效果也不是很理想，在已经检索到的文献中，“魏紫”的生根率为20%左右，“洛阳红”为38.6%，“乌龙捧盛”为33.3%，“菱花湛露”为47.9%，“豆绿”未获得生根苗，海黄和岛锦等名贵品种未见有组培生根苗研究的报道。现有研究均表明，同一种培养方法和培养基用于不同牡丹品系或品种其生根效果差异相当大，想由此同时获得多个牡丹品系或品种理想的组培生根苗基本是不可能的，因此，不同牡丹品系或品种要获得组培生根苗只能分别遴选不同的方法和培养基。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供利用组织培养技术进行的一种牡丹组织培养生根新方法。

[0005] 本发明的一种牡丹组织培养生根新方法主要包括“无菌株系的建立”、“继代增殖培养”和“诱导生根培养”三个环节，在诱导生根培养基中加入三十烷醇（TA），配以生长素促进生根，生根苗形成后进行炼苗移栽。无菌株系的建立：以牡丹鳞芽作为外植体，在无菌条件下采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理，然后剥掉剩余鳞片，将鳞芽接种于诱导培养基诱导鳞芽萌发，诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入6-BA0.1～1.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，经过12～15d 鳞芽萌发，30d左右不定芽形成，无菌株系建成；继代增殖培养：把不定芽切割，接种于继代增殖培养基进行继代增殖培养诱导形成丛生芽，再将丛生芽分割成带1-2个芽的小芽丛，接种于相同的培养基上继续进行继代增殖培养，继代增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA0.5～3.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、AC0～2g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，继代周期30～45d；诱导生根培养：选取增殖培养中的健壮丛生芽接种到生根培养基进行生根诱导培养，生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，再加入IBA1.0～5.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA0.1～2g/L、蔗糖30～50g/L、琼脂6g/L，接种10～18d可见根尖，继续培养20d形成生根苗；生根苗炼苗移栽所用栽培基质选择珍珠岩和草炭混合基质，移栽初期扣小拱棚保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风，栽后半个月组培苗叶片明显生长。

[0006] 鳞芽消毒处理所采用的三步消毒法为：第一步用75%的乙醇消毒30～60s，第二步用1%的次氯酸钠消毒8～15 min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒10～20min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触。无菌株系的建立、继代增殖培养和诱导生根培养三个环节的条件相同，均为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。本发明选用的牡丹品种为海黄、岛锦和豆绿。

[0007] 本发明方法通过以下步骤实现：

[0008] 1.无菌株系的建立

[0009] 分别取生长健壮的豆绿、岛锦、海黄牡丹母株上的饱满鳞芽，去除最外边的1-2层鳞片，用肥皂水刷洗，然后自来水冲洗干净，在无菌条件下将鳞芽放入无菌的三角瓶中，采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理：第一步用75%的乙醇消毒30～60s，第二步用1%的次氯酸钠消毒8～15 min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒10～20min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触，消毒后取出置于无菌滤纸上，用无菌镊子剥除剩余鳞片，将3个品种的鳞芽分别接种于诱导培养基上诱导鳞芽萌发，所用诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入6-BA0.1～1.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，经过12～15d鳞芽萌发，30d左右形成不定芽（基部有少量愈伤），无菌株系建立，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0010] 2.继代增殖培养

[0011] 分别取出豆绿、岛锦、海黄形成的不定芽，切去基部愈伤，然后分别接入继代增殖培养基上培养30～45d，诱导形成丛生芽，将丛生芽再分割成带1-2个芽的小芽丛，分别接种于相同的继代增殖培养基上进行继代增殖培养，时间30～45d，小芽长大，基部有新芽萌发形成新的丛生芽，继代增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA0.5～3.0mg/L、NAA0.01～0.1mg/L、AC0～2g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0012] 3.诱导生根培养

[0013] 选取豆绿、岛锦、海黄生长健壮的丛生芽，切割成单芽，分别接种到生根培养基上进行诱导生根培养，诱导生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，加入IBA1.0～5.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA0.1～2g/L、蔗糖30～50g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度
25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d，培养10～18d，芽基部膨大，根尖突破表皮，继续培养20d，生根苗形成。

[0014] 4.生根苗移栽

[0015] 将豆绿、岛锦、海黄牡丹的生根苗移出培养间，在温室炼苗，先闭口炼苗，于移栽前一天拧松瓶盖，第二天移栽时，洗去苗基部的培养基，分别栽入营养钵中，栽培基质选择珍珠岩和草炭混合基质，移栽初期扣小拱棚保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风，栽后半个月组培苗叶片明显生长。

[0016] 三种牡丹组培苗的生根率分别为豆绿30.0%～66.7%，岛锦33.3%～86.7%，海黄31.4%～73.5%。

[0017] 本发明选用的豆绿、岛锦和海黄是牡丹中的上好品种，“豆绿” 是牡丹四大名品之一，初开青绿色，盛开黄绿色，成花率高，花期晚，持续时间长，极具观赏性，属于稀有名贵品种；岛锦是一种难得的天然“什样锦”牡丹，属于复色类牡丹品种,花瓣大,有纯红、半红半粉、红条粉条相间等色；海黄被称作金牡丹，颜色为纯正的金黄色，其黄色之纯实属罕见，极其珍贵，三者均是牡丹中的“极品”，在本发明中，三种牡丹均获得了理想的生根效果，海黄最高的生根率达到73.5%、岛锦最高的生根率达到86.7%、豆绿牡丹不仅结束了没有组培生根苗的记载，其生根率最高达到了66.7%。

[0018] 三十烷醇（TA）是从蜜蜂中提取、纯化得到的一种具有三十个碳原子的长链饱和脂肪醇，具有增强植株光合作用和干物质的运输积累、促进植物生根和茎叶生长等功能，在本发明之前，三十烷醇在牡丹组培生根上的应用未见有报道，本发明首次将三十烷醇应用于豆绿、岛锦和海黄牡丹的组培生根苗培养技术中，配以生长素促进生根，获得了很好的生根效果，为牡丹的组培生根苗研究提供了技术基础和技术保证，本发明方法不受时间和环境的限制，简便易行，应试牡丹组培苗的生根效果明显，本方法对牡丹其它品种的组培快繁也具有借鉴意义，具有很好的应用价值。

附图说明

[0019] 附图1.豆绿牡丹丛生芽

[0020] 附图2.豆绿牡丹生根苗

[0021] 附图3.岛锦牡丹丛生芽

[0022] 附图4.岛锦牡丹生根苗

[0023] 附图5.海黄牡丹丛生芽

[0024] 附图6.海黄牡丹生根苗。

具体实施方式

[0025] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。

[0026] 实施例1

[0027] 1.无菌株系的建立

[0028] 分别取生长健壮的豆绿、岛锦、海黄牡丹母株上的饱满鳞芽，去除最外边的1-2层鳞片，用肥皂水刷洗，然后自来水冲洗干净，在无菌条件下将鳞芽放入无菌的三角瓶中，采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理：第一步用75%的乙醇消毒45s，第二步用1%的次氯酸钠消毒10min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒15min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触，消毒后取出置于无菌滤纸上，用无菌镊子剥除剩余鳞片，将3个品种的鳞芽分别接种于诱导培养基上诱导鳞芽萌发，所用诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入6-BA0.8mg/L、NAA0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，经过12d鳞芽萌发，30d形成不定芽（基部有少量愈伤），无菌株系建立，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0029] 2.继代增殖培养

[0030] 分别取出豆绿、岛锦、海黄形成的不定芽，切去基部愈伤，然后分别接入继代增殖培养基上培养35d，诱导形成丛生芽，将丛生芽再分割成带1-2个芽的小芽丛，分别接种于相同的继代增殖培养基上进行继代增殖培养，时间35d，小芽长大，基部有新芽萌发形成新的丛生芽，豆绿、岛锦、海黄的丛生芽分别见附图1、附图3和附图5，继代增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA2.0mg/L、NAA0.05mg/L、AC1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0031] 3.诱导生根培养

[0032] 选取豆绿、岛锦、海黄生长健壮的丛生芽，切割成单芽，分别接种到生根培养基上进行诱导生根培养，诱导生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，加入IBA3.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA1.0g/L、蔗糖50g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d，培养12d，芽基部膨大，根尖突破表皮，继续培养20d，生根苗形成，豆绿、岛锦、海黄的生根苗分别见附图2、附图4和附图6，豆绿的生根率为66.7%，岛锦的生根率为86.7%，海黄的生根率为73.5%。

[0033] 4.生根苗移栽

[0034] 将豆绿、岛锦、海黄牡丹的生根苗移出培养间，在温室炼苗，先闭口炼苗，于移栽前一天拧松瓶盖，第二天移栽时，洗去苗基部的培养基，分别栽入营养钵中，栽培基质选择珍珠岩和草炭混合基质，移栽初期扣小拱棚保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风，栽后半个月组培苗叶片明显生长。

[0035] 实施例2

[0036] 1.无菌株系的建立

[0037] 分别取生长健壮的豆绿、岛锦、海黄牡丹母株上的饱满鳞芽，去除最外边的1-2层鳞片，用肥皂水刷洗，然后自来水冲洗干净，在无菌条件下将鳞芽放入无菌的三角瓶中，采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理：第一步用75%的乙醇消毒60s，第二步用1%的次氯酸钠消毒8min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒20min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触，消毒后取出置于无菌滤纸上，用无菌镊子剥除剩余鳞片，将3个品种的鳞芽分别接种于诱导培养基上诱导鳞芽萌发，所用诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入6-BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，经过12d鳞芽萌发，30d形成不定芽（基部有少量愈伤），无菌株系建立，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0038] 2.继代增殖培养

[0039] 分别取出豆绿、岛锦、海黄形成的不定芽，切去基部愈伤，然后分别接入继代增殖培养基上培养30d，诱导形成丛生芽，将丛生芽再分割成带1-2个芽的小芽丛，分别接种于相同的继代增殖培养基上进行继代增殖培养，时间30d，小芽长大，基部有新芽萌发形成新的丛生芽，继代增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA3.0mg/L、NAA0.1mg/L、AC2.0g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0040] 3.诱导生根培养

[0041] 选取豆绿、岛锦、海黄生长健壮的丛生芽，切割成单芽，分别接种到生根培养基上进行诱导生根培养，诱导生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，加入IBA1.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA2.0g/L、蔗糖40g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d，培养18d，芽基部膨大，根尖突破表皮，继续培养20d，生根苗形成，豆绿的生根率为30.0%，岛锦的生根率为33.3%，海黄的生根率为31.4%。

[0042] 4.生根苗移栽

[0043] 将豆绿、岛锦、海黄牡丹的生根苗移出培养间，在温室炼苗，先闭口炼苗，于移栽前一天拧松瓶盖，第二天移栽时，洗去苗基部的培养基，分别栽入营养钵中，栽培基质选择珍珠岩和草炭混合基质，移栽初期扣小拱棚保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风，栽后半个月组培苗叶片明显生长。

[0044] 实施例3

[0045] 1.无菌株系的建立

[0046] 分别取生长健壮的豆绿、岛锦、海黄牡丹母株上的饱满鳞芽，去除最外边的1-2层鳞片，用肥皂水刷洗，然后自来水冲洗干净，在无菌条件下将鳞芽放入无菌的三角瓶中，采用三步消毒法对鳞芽进行消毒处理：第一步用75%的乙醇消毒30s，第二步用1%的次氯酸钠消毒15 min，取出用无菌水冲洗，第三步用0.5%的次氯酸钠消毒10min，取出再用无菌水冲洗干净，整个消毒过程中不断地摇动三角瓶，使消毒剂与鳞芽充分接触，消毒后取出置于无菌滤纸上，用无菌镊子剥除剩余鳞片，将3个品种的鳞芽分别接种于诱导培养基上诱导鳞芽萌发，所用诱导培养基以WPM培养基为基本培养基，加入6-BA0.1mg/L、NAA0.01mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，经过15d鳞芽萌发，30d形成不定芽（基部有少量愈伤），无菌株系建立，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0047] 2.继代增殖培养

[0048] 分别取出豆绿、岛锦、海黄形成的不定芽，切去基部愈伤，然后分别接入继代增殖培养基上培养45d，诱导形成丛生芽，将丛生芽再分割成带1-2个芽的小芽丛，分别接种于相同的继代增殖培养基上进行继代增殖培养，时间45d，小芽长大，基部有新芽萌发形成新的丛生芽，继代增殖培养基以WPM为基本培养基，加入6-BA0.5mg/L、NAA0.01mg/L、AC0g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d。

[0049] 3.诱导生根培养

[0050] 选取豆绿、岛锦、海黄生长健壮的丛生芽，切割成单芽，分别接种到生根培养基上进行诱导生根培养，诱导生根培养基以MS为基本培养基，大量元素减半，加入IBA5.0mg/L、NAA0.1mg/L、TA0.1g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，培养条件为温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d，培养10d，芽基部膨大，根尖突破表皮，继续培养20d，生根苗形成，豆绿的生根率为35.7%，岛锦的生根率为42.0%，海黄的生根率为37.5%。

[0051] 4.生根苗移栽

[0052] 将豆绿、岛锦、海黄牡丹的生根苗移出培养间，在温室炼苗，先闭口炼苗，于移栽前一天拧松瓶盖，第二天移栽时，洗去苗基部的培养基，分别栽入营养钵中，栽培基质选择珍珠岩和草炭混合基质，移栽初期扣小拱棚保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风，栽后半个月组培苗叶片明显生长。