一种制备高腺苷含量的虫草制剂的方法

摘要

本发明涉及一种制备高腺苷含量的虫草制剂的方法，包括以下步骤：1）将分离自虫草子实体的真菌类菌株经固体培养和摇床培养后，得到菌丝体；2）将步骤1）得到的菌丝体接种到含有木薯蚕蛹水提液的培养液中进行深层发酵，得到深层发酵菌丝体；3）超高压处理步骤2）得到的深层发酵菌丝体，使菌丝体和微生物瞬间破壁；然后离心发酵液，分离得到菌丝体和菌液；4）步骤3）得到的菌液精滤后经低温浓缩制成高腺苷含量的虫草口服液，菌丝体经低温干燥后，超微粉碎成高腺苷含量的纳米级虫草微粉。本发明方法制备得到的虫草液体制剂和固体制剂的腺苷含量比现有技术均有显著提高。

权利要求

1.一种制备高腺苷含量的虫草制剂的方法，包括以下步骤：

1)将分离自虫草子实体的真菌类菌株经固体培养和摇床培养后，得到菌丝体；所述的分离自虫草子实体的真菌类菌株为中华被毛孢菌株；

2)将步骤1)得到的菌丝体接种到含有木薯蚕蛹水提液的培养液中进行深层发酵，得到深层发酵菌丝体；所述的培养液每1000毫升中含有葡萄糖60-100g，酵母粉20-80g、蛋白胨水解液30-100毫升，由1-12g木薯蚕蛹干粉制得的水提液，0.1-1g的MgSO4·7H2O，

0.1-1g的KH2PO4，pH值为5-6；所述的深层发酵，接种量为5-15％v/v，温度18-25℃，压力2

0.6-0.8Kg/cm，搅拌速率为100-260rpm，通气量为1:0.5～1:12，发酵时间为3-6天；

3)超高压处理步骤2)得到的深层发酵菌丝体，使菌丝体和微生物瞬间破壁；然后离心发酵液，分离得到菌丝体和菌液；

4)步骤3)得到的菌液精滤后经低温浓缩制成高腺苷含量的虫草口服液，菌丝体经低温干燥后，超微粉碎成高腺苷含量的纳米级虫草微粉。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的固体培养是在PDA斜面培养基中培养，按重量份计，所述的PDA斜面培养基中含有10-20％的马铃薯、2-3％的葡萄糖、

1-3％的琼脂；所述的固体培养条件为18-25℃，pH值为5-6，培养时间为8-10天；步骤1)所述的摇床培养条件是温度为18-25℃，转速为180-210rpm，时间为2-5天。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的超高压处理是将步骤2)得到的发酵液在低于60℃的温度下，用100-400MPa的压力处理5-10分钟。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的离心是采用高速离心机在

3000-3500rpm下离心10-15分钟。

5.权利要求1所述的制备高腺苷含量的虫草制剂的方法，包括以下步骤：

1)将中华被毛孢菌株转接于PDA斜面培养基上，进行培养，活化，所用培养基中，按重量百分比计，含有10-20％马铃薯，2-3％葡萄糖，1-3％琼脂；培养条件为18-25℃、pH值

5-6，培养8-10天；挑取菌丝体接种于装有液体培养基的摇床中培养，所述的液体培养基每1000毫升中含有葡萄糖60-100g，酵母粉20-80g、蛋白胨水解液30-100毫升，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g的KH2PO4，pH值为5-6；摇床培养温度为18-25℃，转速为180-210rpm，培养2-5天；

2)将步骤1)摇床培养得到的菌丝体，接种至装有培养液的发酵罐中，接种量为5-15％v/v，所述的培养液每1000毫升中含有葡萄糖60-100g，酵母粉20-80g、蛋白胨水解液

30-100毫升，由1-12g木薯蚕蛹干粉制得的水提液，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g的KH2PO4，2

pH值为5-6；发酵罐保温18-25℃，罐压0.6-0.8Kg/cm，搅拌速率为100-260rpm，通气量为

1:0.5～1:12，发酵3-6天，得到深层发酵的菌丝体；

3)在低于60℃的温度下，用100-400MPa的超高压方法处理步骤2)得到的深层发酵菌丝体5-10分钟；然后在3000-3500rpm下离心10-15分钟，分离得到菌丝体和菌液；

4)将步骤3)得到的菌液经微滤、超滤和浓缩制成高腺苷含量的虫草口服液；将步骤3)得到的菌丝体50℃干燥后，超微粉碎制成高腺苷含量的纳米级虫草粉。

说明书

一种制备高腺苷含量的虫草制剂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种虫草制剂的制备方法。

背景技术

[0002] 迄今为止，人们已从冬虫夏草（Cordyceps Sinensis(Berk.)Sacc.)及其无性型中检测或分离到多种生物活性物质，如真菌多糖、甾醇、生物碱、有机酸、维生素、氨基酸、甘露醇等。这些有效成分均与冬虫夏草的药理功能有密切关系。

[0003] 腺苷即3’-脱氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，又称虫草素或蛹虫草素，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。其分子式为C10H13N5O3，分子量为251Da，熔点230-231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚、氯仿，蒽酮反应为阳性，紫外线的最大吸收波长为259nm，其结构式如下：

[0004]

[0005] 腺苷含量是冬虫夏草发挥药理功效的主要活性成分，是检测冬虫夏草内在质量的主要指标，也是国家检测这类产品内在质量的标准。

[0006] 目前，市场上销售的冬虫夏草制剂中，其腺苷含量都比较低，如当前正在中央电视台和北京晚报上宣传的一个虫草胶囊产品，其100g中仅含有腺苷4.4mg，实际上如此低的腺苷含量的虫草制剂根本不具备宣传中所说的生理活性和药理功能。因此，如何在技术路线及加工工艺中改进现有加工方法，提高虫草制剂的腺苷含量已是亟待解决，而又具有重要意义的课题。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于：将冬虫夏草制剂中的腺苷含量显著提高。

[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

[0009] 提供一种制备高腺苷含量的虫草制剂的方法，包括以下步骤：

[0010] 1）将分离自虫草子实体的真菌类菌株经固体培养和摇床培养后，得到菌丝体；

[0011] 2）将步骤1）得到的菌丝体接种到含有木薯蚕蛹水提液的培养液中进行深层发酵，得到深层发酵菌丝体；

[0012] 3）超高压处理步骤2）得到的深层发酵菌丝体，使菌丝体和微生物瞬间破壁；然后离心发酵液，分离得到菌丝体和菌液；

[0013] 4）步骤3）得到的菌液精滤后经低温浓缩制成高腺苷含量的虫草口服液，菌丝体经低温干燥后，超微粉碎成高腺苷含量的纳米级虫草微粉。

[0014] 步骤1）所述的分离自虫草子实体的真菌类菌株可以是现有技术中公众可不受约束地购买到的多种虫草菌株，例如中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、被包霉属、北虫草菌r3、头孢菌改良菌株A10等菌株。本发明方法中优选被包霉属、蝙蝠蛾拟青霉或中华被毛孢；最优选中华被毛孢（Hirsutella Sinensis）菌株，该菌株是一种现有的优良菌株，可无限制地购自中国科学院微生物研究所。

[0015] 步骤1）所述的固体培养可以是使用现有技术中的多种固体培养基进行的固体培养，本发明优选的培养基是PDA斜面培养基。

[0016] 所述的PDA斜面培养基中，按重量百分比计，优选含有10-20%的马铃薯、2-3%的葡萄糖、1-3%的琼脂。

[0017] 所述的固体培养条件优选18-25℃，pH值为5-6，培养时间为8-10天。

[0018] 步骤1）所述的摇床培养的液体培养基优选每1000毫升中含有葡萄糖60-100克，酵母粉20-80克、蛋白胨水解液3-10毫升，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g的KH2PO4，pH值为5-6。

[0019] 所述的摇床培养可以按照现有技术的常规条件进行，本发明优选的摇床培养条件是温度为18-25℃，转速为180-210rpm，时间为2-5天。

[0020] 步骤2）所述的木薯蚕蛹水提液是木薯蚕蛹经常规水提方法得到的水提液，例如，将木薯蚕蛹粉碎后加水煎煮1-3次，每次加2-4倍体积的水，每次煎煮0.5-1小时，合并煎液后过滤，得到的滤液即可作为本发明所采用的木薯蚕蛹水提液。

[0021] 步骤2）所述的深层发酵培养液中，每1000毫升中优选含有1-12克干重的木薯蚕蛹粉制得的水提液。

[0022] 步骤2）所述的深层发酵培养液进一步优选每1000毫升中含有葡萄糖60-100克，酵母粉20-80克、蛋白胨水解液30-100毫升，由1-12克木薯蚕蛹粉制得的水提液，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g的KH2PO4，pH值为5-6。

[0023] 步骤2）所述的深层发酵过程，优选接种量为5-15%（v/v），保温18-25℃，压力2
0.6-0.8Kg/cm，搅拌速率为100-260rpm，通气量为1:0.5～1:12，发酵时间为3-6天。

[0024] 步骤3）所述的超高压（Uitra high-pressure）处理，也称高压加工技术（high pressure processing），或高静水加工技术（high hydrostatic pressure processing），它是一种新兴的加工技术，国际上称为Hpp，已广泛用于食品、医药、纺织及国防等工业，在美国已获FDA认证。但现有技术中的超高压处理通常用于食品、药品的冷杀菌工艺中，而尚未有人将其应用于中药活性成分的提取工艺。本发明人通过试验研究发现，经超高压处理方法处理后，虫草和微生物的细菌壁均被压缩而破裂，失活，菌丝体细胞内活性成分——腺苷、多糖、虫草酸、甘露醇等均可被充分释放出来。本发明中优选的超高压处理是将步骤2）得到的发酵液在低于60℃的常温或较低温度下，用100-400MPa的压力处理5-10分钟。

[0025] 步骤3）所述的离心，可以按照现有技术中能够实现菌丝体和菌液分离目的的多种离心方法进行，本发明优选的离心方法是采用高速离心机在3000-3500rpm下离心10-15分钟，即可将虫草菌丝体和菌液分离。

[0026] 步骤4）所述的精滤可以是现有技术中的微滤和超滤中的一种和两种的组合。步骤3）得到的菌液经离心分离后，仍含有小颗粒、蛋白质和果胶，易发生沉淀，用微滤和超滤即可除去。

[0027] 本发明所述的高腺苷含量的虫草制剂的制备方法，优选的方案包括以下步骤：

[0028] 1）将中华被毛孢菌株转接于PDA斜面培养基上，进行培养，活化，所用培养基中，按重量百分比计，含有10-20%马铃薯，2-3%葡萄糖，1-3%琼脂；培养条件为18-25℃、pH值5-6，培养8-10天；挑取菌丝体接种于装有液体培养基的摇床中培养，所述的液体培养基每
1000毫升中含有葡萄糖60-100克，酵母粉20-80克、蛋白胨水解液30-100毫升，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g的KH2PO4，pH值为5-6；摇床培养温度为18-25℃，转速为180-210rpm，培养2-5天；

[0029] 2）将步骤1）摇床培养得到的菌丝体，接种至装有培养液的发酵罐中，接种量为5-15%（v/v），所述的培养液每1000毫升中含有葡萄糖60-100克，酵母粉20-80克、蛋白胨水解液30-100毫升，由1-12克木薯蚕蛹干粉制得的水提液，0.1-1g的MgSO4·7H2O，0.1-1g
2
的KH2PO4，pH值为5-6；发酵罐保温18-25℃，罐压0.6-0.8Kg/cm，搅拌速率为100-260rpm，通气量为1:0.5～1:12，发酵3-6天，得到深层发酵的菌丝体；

[0030] 3）在低于60℃的温度下，用100-400MPa的超高压方法处理步骤2）得到的深层发酵菌丝体5-10分钟；然后在3000-3500rpm下离心10-15分钟，分离得到菌丝体和菌液；

[0031] 4）将步骤3）得到的菌液经微滤、超滤和浓缩制成高腺苷含量的虫草口服液；将步骤3）得到的菌丝体50℃干燥后，超微粉碎制成高腺苷含量的纳米级虫草粉。

[0032] 与现有技术相比，本发明的制备方法具有以下几方面的有益效果：

[0033] 1.通过在发酵液中加入了木薯蚕蛹水提液，改进了冬虫夏草液体深层发酵的营养条件，促使虫草菌丝体生长繁殖旺盛，提高了菌丝体内的腺苷含量。

[0034] 在常规的培养液中加入含有优质蛋白和腺苷的木薯蚕蛹。木薯蚕蛹具有高蛋白、全氨基酸和低脂肪，是其它几种蚕蛹所不及的（如表1），同时，它还含有具有多种生理活性的黄酮0.37%，

[0035] 表1四种蚕蛹三大营养含量比较（%）

[0036]

[0037] 从表1可见，木薯蚕蛹比其它三种蚕蛹蛋白质高8.97-22.7%，脂肪低6.62-15.09%。此外，木薯蚕蛹所含氨基酸齐全，必须氨基酸含量较高，并含有Ca、Zn、Fe、K、P等矿物质及具生理活性的黄酮0.37%，更适合虫草生长与繁殖条件。

[0038] 2.应用超高压处理技术，使虫草菌丝体破壁和杀菌在常温迅速完成，同时不会改变产品物理性质。

[0039] 应用超高压技术，虫草在深层发酵后，在100-400Mpa压力下，常温，5-10分钟内即完成破壁和杀菌，细胞内活性物质如腺苷、多糖、虫草酸、甘露醇等即可从细胞中释放出来，更有利于人体消化吸收。超高压处理过程中，虫草菌液温度并不升高，因为压力只作用于非共价键，共价键基本不破坏，不会使产品原有的色、香、味等物理特性发生变化，不会产生异味，仍保留食品原有风味，色泽和养分。超高压处理是液体介质短时间内压缩过程，压力处理食品从表面到心部瞬间达到均匀，虫草菌丝体的破壁也是均匀、瞬间和高放的。超高压处理食品技术也称冷杀菌技术，因为在400Mpa压力下，绝大多数微生物的细胞壁被压破而失活，故不需要向食品中添加化学物质，如防腐剂等，从而保持了产品品质和天然风味，延长了保质期保证了食品安全。总之，本发明方法中，将超高压处理技术用于虫草的破壁和杀菌，克服了现有破壁和杀菌中使用化学、物理、生化等方法存在的时间长、温度高、耗能多、易污染和养分流失等缺陷。

[0040] 3.本发明通过在深层发酵液中添加木薯蚕蛹成分和应用超高压进行虫草破壁处理，显著提高了制得的虫草液体和固体制剂中的腺苷含量。经检测，本发明制备方法得到的虫草制剂的腺苷含量是未采用本发明上述技术特征的常规工艺所得制剂的3.5倍以上（详见实施例和比较例），均达到了国家药典规定的标准（8-11mg%）。

[0041] 另外，本发明方法得到的产品急性经口毒性试验（最大耐受剂量法）：雌性、雄性小鼠经口MTD均大于20g/kgbw，属无毒级。

具体实施方式

[0042] 实施例1

[0043] （1）冬虫夏草斜面固体菌种的培养

[0044] 将中华被毛孢菌株转接于PDA斜面培养基上，进行培养、活化，得斜面母种，按重量百分比计，培养基中含有18%马铃薯，2.5%葡萄糖，2.8%琼脂，培养条件：20℃、pH5.5，培养时间9天。

[0045] （2）摇床种子培养

[0046] 摇床种子培养条件为菌种固体斜面培养9天后，挑取菌丝体接种于装有液体培养基的摇瓶中培养，液体培养基的主要成分为每1000毫升中含有葡萄糖100克，酵母粉60克，蛋白胨水解液80毫升（v/v），0.5g的MgSO4·7H2O，0.5g的KH2PO4，pH值为5.5；温度为21℃，转速为200rpm，时间为3天。

[0047] （3）液体深层发酵培养

[0048] 液体摇床种子培养3天后，接种至装有培养液的发酵罐中，接种量13%（v/v），保温2
21℃，罐压0.8Kg/cm，搅拌速率200rpm，通气量1:0.6，发酵时间5天。

[0049] 液体培养基的主要成分为每1000毫升中含有葡萄糖100克，酵母粉60克，蛋白胨水解液80毫升（v/v），10克木薯蚕蛹干粉制得的水提液，0.5g的MgSO4·7H2O，0.5g的KH2PO4，pH值为5.5。

[0050] 所述的木薯蚕蛹水提液是按以下方法制得的：将10g木薯蚕蛹粉碎后加水煎煮2次，第一次加3倍体积的水，煎煮1小时，第二次加2倍体积的水，煎煮0.5小时，合并煎液后过滤，得到的滤液即为本实施例所用的木薯蚕蛹水提液。

[0051] （4）超高压破壁、灭菌

[0052] 在30℃下，用300MPa的压力，处理约8分钟，虫草和微生物细胞均被压缩而破壁、失活，菌丝体细胞内活性成分——腺苷、多糖、虫草酸、甘露醇等均被释放出来。

[0053] （5）高速离心分离菌丝体和菌液

[0054] 采用高速离心机分离液渣3300rpm，14分钟，即可将虫草菌丝体和菌液分离。

[0055] （6）菌液经微滤、超滤和浓缩后，制成虫草口服液

[0056] 步骤（5）分离得到的菌液经高速离心机离心后，仍含有小颗粒、蛋白质、果胶等物质，易发生沉淀，用微滤和超滤后可去掉，再通过双效低温浓缩至原体积的15%即可获得腺苷含量较高的虫草口服液。

[0057] （7）虫草菌丝体低温干燥，超微粉碎后，制成纳米级的片剂或硬胶囊。

[0058] 步骤（5）分离得到的虫草菌丝体低温（50℃）干燥，然后通过超微粉碎制成-9（10 m×100）纳米级粉末后，压片或装硬胶囊，易于人体消化吸收。

[0059] 经检测，本实施例制备得到的虫草口服液中腺苷含量为148.8μg/g，虫草纳米粉中腺苷含量为25.9mg/100g。

[0060] 实施例2

[0061] （1）冬虫夏草斜面固体菌种的培养

[0062] 将蝙蝠蛾拟青霉菌株转接于PDA斜面培养基上，进行培养、活化、得斜面母种，培养基中，按重量百分比计，含有20%马铃薯，2.8%的葡萄糖，2.9%琼脂。培养条件：温度为22℃、pH为5.6、培养时间10天。

[0063] （2）摇床种子培养

[0064] 菌种固体斜面培养10天后，挑取菌丝体接种于装有液体培养基的摇瓶中培养，液体培养基的主要成分为每1000毫升中有葡萄糖90克，酵母粉70克，蛋白胨水解液90ml（v/v），0.5g的MgSO4·7H2O，0.5g的KH2PO4，pH值为5.6；温度为22℃，转速为210rpm，时间为4天。

[0065] （3）液体深层发酵培养

[0066] 液体摇床种子培养4天后，接种至装有培养液的发酵罐中，接种量14%（v/v），保温2
22℃，罐压0.7Kg/cm，搅拌速率210rpm，通气量1:0.7，发酵时间6天。

[0067] 液体培养基的主要成分为每1000毫升中有葡萄糖90克，酵母粉70克，蛋白胨水解液90毫升（v/v），5克木薯蚕蛹干粉制得的水提液，0.5g的MgSO4·7H2O，0.5g的KH2PO4，pH值为5.6。

[0068] 木薯蚕蛹水提液制备方法同实施例1。

[0069] （4）超高压破壁、灭菌

[0070] 在50℃下，用350Mpa的压力，处理约7分钟，虫草和微生物均被压缩而破壁、失活，菌丝体细胞内活性物质——腺苷，多糖、虫草酸、甘露醇等均释放出来。

[0071] （5）高速离心分离菌丝体和菌液

[0072] 采用高速液渣分离离心机3500rpm离心12分钟，即可将虫草菌丝体和菌液分离。

[0073] （6）菌液经微滤、超滤和浓缩后，制成虫草口服液

[0074] 步骤（5）分离得到的菌液经高速离心机分离后，仍含有小颗粒、蛋白质和果胶等，易发生沉淀，用微滤和超滤即可去掉、再通过双效低温浓缩至原体积的10%即可获得腺苷含量较高的虫草口服液。

[0075] （7）虫草菌丝体低温干燥，超微粉碎后，制成片剂或硬胶囊。

[0076] 步骤（5）分离得到的虫草菌丝体低温52℃干燥，然后通过超微粉碎，制成-9（10 m×100）纳米级粉末后，压片或装硬胶囊，易于人体消化吸收。

[0077] 实施例3

[0078] （1）冬虫夏草斜面固体菌种的培养

[0079] 将被包霉属菌株接于PDA斜面培养基上，进行培养、活化，得斜面母钟，培养基中含有19%马铃薯，3%的葡萄糖，3%琼脂。培养条件：温度为23℃，pH值为5.8，培养时间为9天。

[0080] （2）摇床种子培养

[0081] 菌种固体斜面培养8天后，挑取菌丝体接种于装有液体培养基的摇瓶中培养，液体培养基的主要成分为每1000毫升中含有葡萄糖60克，酵母粉80克蛋白胨水解液30毫升，1.0g的MgSO4·7H2O，0.2g的KH2PO4，pH值为5.7；温度为23℃，转速为220rpm，时间为5天。

[0082] （3）液体深层发酵培养

[0083] 液体摇床种子培养5天后，接种至装有培养液的发酵罐中，接种量为15%（v/v），温2
度为23℃，罐压为0.6Kg/cm，搅拌速率为180rpm，通气量1:06发酵时间为6天。

[0084] 液体培养基的主要成分为每1000毫升中含有葡萄糖60克，酵母粉80克蛋白胨水解液30毫升，12克木薯蚕蛹干粉制得的水提液，1.0g的MgSO4·7H2O，0.2g的KH2PO4，pH值为5.7。

[0085] 木薯蚕蛹水提液制备方法同实施例1。

[0086] （4）超高压破壁、灭菌

[0087] 在常温下，用400Mpa的压力下，约处理6分钟，虫草和微生物均被压缩而破壁、失活，菌丝体内活性物质——腺苷、多糖、虫草酸及甘露醇等均被释放出来。

[0088] （5）高速离心分离菌丝体和菌液

[0089] 采用高速离心机分离液渣，3200rpm离心15分钟，即将虫草菌丝体和菌液分离。

[0090] （6）菌液经微滤、超滤和浓缩制成口服液

[0091] 步骤（5）分离得到的菌液经高速离心后，仍含有小颗粒、蛋白质和果胶等物质，易发生沉淀，用微滤和超滤可去掉，并通过双效低温浓缩至原体积的20%即可获得腺苷含量较高的口服液。

[0092] （7）步骤（5）分离得到的虫草菌丝体55℃干燥，然后通过超微粉碎，制成-9（10 m×100）纳米级的微粉后，压片或装硬胶囊。

[0093] 比较例

[0094] （1）冬虫夏草斜面固体菌种的培养

[0095] 将中华被毛孢菌株转接于PDA斜面培养基上，进行培养、活化，得斜面母种，培养基中含有18%马铃薯，2.5%葡萄糖，2.8%琼脂，培养条件：20℃、pH5.5，培养时间9天。

[0096] （2）摇床种子培养

[0097] 摇床种子培养条件为菌种固体斜面培养9天后，挑取菌丝体接种于装有液体培养