基于弓形虫缓殖子抗原的CD8+T细胞优势表位转让专利
申请号 : CN201310204200.4
文献号 : CN103275182B
文献日 : 2014-12-17
发明人 : 丛华 , 袁泉 , 张敏 , 丛海滋 , 赵玲潇
申请人 : 山东大学
摘要 :
本发明公开了两个弓形虫缓殖子特异性表面抗原的CD8+T细胞优势抗原表位：VPNSSLVEN和SQFLSLSLL，其是依据以缓殖子特异性表面抗原SAG2C,-2D,-2X的蛋白序列，筛选出6个具有H-2限制性，高亲和性的CD8+T细胞表位。用筛选出的表位多肽主动免疫BALB/c小鼠。免疫后进行淋巴细胞增殖水平和细胞因子含量测定以及表位疫苗的免疫保护性评估。结果表明，由该表位疫苗诱导小鼠可产生强有力的细胞免疫，其中两个抗原肽：VPNSSLVEN和SQFLSLSLL，经证明具有很强的刺激T细胞增殖的能力，诱导小鼠分泌保护性细胞因子和免疫保护性，可作为有效抗弓形虫感染的表位疫苗，降低宿主脑组织中包囊形成率。
权利要求 :
+
1.基于弓形虫缓殖子抗原的CD8T细胞抗原的优势表位，其特征在于：是氨基酸序列为SQFLSLSLL的抗原肽。
+
2.权利要求1所述的基于弓形虫缓殖子抗原的CD8T细胞抗原的优势表位在制备抗弓形虫感染的表位疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：应用时，添加医学上的疫苗佐剂。
说明书 :
+
基于弓形虫缓殖子抗原的CD8T细胞优势表位
技术领域
[0001] 本发明涉及基于弓形虫缓殖子抗原的CD8+T细胞优势表位。
背景技术
[0002] 弓形虫(Toxoplasmagondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，可对人类健康造成很大临床损害并可造成畜牧业上巨大的经济损失。对弓形虫病的治疗，迄今为止尚未发现理想的防治药物。而表位疫苗因其易合成，研制简单、安全，近年来成为弓形虫疫苗的研究热点。抗原表位是蛋白质抗原表面的抗原决定簇，是决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。弓形虫作为专性细胞内寄生虫，其表面抗原被降解成（8-12aa）长+度的氨基酸片段，被呈现给MHC-I类分子的细胞，CD8T细胞识别的MHC-I类分子和肽的复+
合体，通过刺激CD8T细胞分泌IFN-γ来杀死感染弓形虫的细胞。在这项研究中，我们在+
SAG2C，-2D，和SAG2X蛋白质中筛选出6个具有高亲和性的CD8T细胞表位，其中，两个抗原表位肽显示有很好的免疫原性，能够刺激脾细胞增殖，诱导小鼠分泌保护性细胞因子，产生有效免疫保护性。
合体，通过刺激CD8T细胞分泌IFN-γ来杀死感染弓形虫的细胞。在这项研究中，我们在+
SAG2C，-2D，和SAG2X蛋白质中筛选出6个具有高亲和性的CD8T细胞表位，其中，两个抗原表位肽显示有很好的免疫原性，能够刺激脾细胞增殖，诱导小鼠分泌保护性细胞因子，产生有效免疫保护性。
发明内容
[0003] 针对上述现有技术，本发明筛选出了两个基于弓形虫缓殖子SAG2C，SAG2D和+SAG2X抗原的CD8T细胞抗原的优势表位：经证明具有很强的刺激T细胞增殖的能力和免疫保护性，可作为有效抗弓形虫感染的表位疫苗。
[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 一个基于弓形虫缓殖子抗原的CD8+T细胞抗原的优势表位：是氨基酸序列为VPNSSLVEN的抗原肽，如SEQIDNO.1所示。
[0006] 另一个基于弓形虫缓殖子抗原的CD8+T细胞抗原的优势表位：是氨基酸序列为SQFLSLSLL的抗原肽，如SEQIDNO.4所示。
[0007] 本申请的发明人分析弓形虫缓殖子SAG2CDX蛋白质氨基酸的序列，筛选出6个具+有H-2限制性，高亲和性的CD8T细胞表位（表1）；人工合成多肽，将多肽在PBS中溶解后混合免疫BALB/c小鼠，在小鼠尾巴根部，注射100ul多肽混合液，其中每种肽含量为100ug。
免疫2次，间隔3周。于免疫后4周，无菌条件下取脾，进行脾细胞增殖水平和细胞因子含 量测定以及表位疫苗的免疫保护性评估。结果表明，由表位疫苗诱导小鼠可产生强有力的细胞免疫。其中两个抗原肽：VPNSSLVEN和SQFLSLSLL，显示具有良好的刺激T细胞增殖的能力。这些筛选出的表位可以作为表位疫苗设计中很好的候选表位，降低宿主脑组织中包囊形成率。
免疫2次，间隔3周。于免疫后4周，无菌条件下取脾，进行脾细胞增殖水平和细胞因子含 量测定以及表位疫苗的免疫保护性评估。结果表明，由表位疫苗诱导小鼠可产生强有力的细胞免疫。其中两个抗原肽：VPNSSLVEN和SQFLSLSLL，显示具有良好的刺激T细胞增殖的能力。这些筛选出的表位可以作为表位疫苗设计中很好的候选表位，降低宿主脑组织中包囊形成率。
[0008] 本发明的基于弓形虫缓殖子抗原的CD8+T细胞抗原优势表位疫苗，具体应用时，可以添加医学上常规的疫苗佐剂进行表位疫苗的设计。
附图说明
[0009] 图1：表位肽疫苗诱导的细胞增殖试验。在免疫后4周，收集小鼠的脾细胞，来评估脾细胞对表位疫苗的增殖免疫应答。结果显示，淋巴细胞增殖反应在用PBS处理的小鼠中无明显差异。在这六个表位肽中，VPNSSLVEN和SQFLSLSLL显示高的OD吸光度值，证明有较好的能力来刺激脾细胞产生强烈的淋巴细胞反应。
[0010] 图2：免疫鼠CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平，其中，A：PBS对照组；B：表位混合免疫组。免疫鼠脾细胞细胞表面分子CD8及胞内细胞因子IFN-γ染色。B1，B2为IFN-γ染+ +色阳性的细胞比例。B2，B4为CD8 染色阳性的细胞比例。B2为IFN-γ和CD8 双染阳性细胞的比例。
具体实施方式
[0011] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0012] 实施例1筛选优势表位，免疫BALB/c小鼠
[0013] 从弓形虫的数据库（ToxoDB：http://toxodb.org/）中调取SAG2C，SAG2D和SAG2X蛋白序列。用免疫抗原决定簇数据库（IEDB）（http://www.iedb.org/）中的（ANN，SMM）算+法来筛选抗原表位。筛选出6个H-2（Ld，Kd，Dd）高亲和力CD8T细胞表位肽（表1）具体序列如序列表中1-6所示，人工合成得到。将多肽在PBS中溶解后混合免疫BALB/c小鼠，在小鼠尾巴根部，注射100ul多肽混合液，其中每种肽含量为100ug。免疫2次，间隔3周。
[0014] 实施例2免疫鼠的细胞增殖实验
[0015] 免疫鼠在免疫后4周，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，加入表位肽刺激，在37℃，5％CO2条件下培养48小时后，每100μl细胞培养液加入10μl的WST-8染料，CCK-8方法进行淋巴细胞增殖实验，在450nm处测定各孔的吸光度值。（结果见图1）。
[0016] 结果表明，两个表位肽：VPNSSLVEN及SQFLSLSLL显示高的吸光度值，证明其具有较强刺激脾细胞增殖的能力，可作为表位疫苗设计的优势候选抗原表位。
[0017] 实施例3优势表位疫苗诱导小鼠产生细胞因子测定
[0018] 将多肽VPNSSLVEN及SQFLSLSLL在PBS中溶解为10ug/ul后,在小鼠尾部注射免疫BALB/c小鼠，分对照组，单肽免疫组和混合免疫组，其中单肽免疫组分别注射单肽VPNSSLVEN100ug或SQFLSLSLL100ug，混合免疫组同时注射两种单肽，其中每种肽含量为100ug。免疫2次，间隔3周。免疫鼠脾细胞悬液的制备如实例2描述。来自小鼠的脾细胞经刺激后，在不同的时间收集培养上清液用于测定细胞IL-2和IL-10含量。结果如表2所示，免疫表位疫苗的小鼠的脾细胞培养上清液中检测出大量的IL-2。VPNSSLVEN免疫组的小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量，141.2±10.2pg/ml；SQFLSLSLL免疫组的小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量，125.6±11.4pg/ml明显高于对照组（PBS：57.4±3.5pg/ml）（P<0.05）；
而表位混合免疫组小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量更高为221.1±12.7pg/ml，与对照相比差异性显著。然而，IL-10的量在免疫组和对照组间没有显着差异（P>0.05）。揭示表位疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答。
而表位混合免疫组小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量更高为221.1±12.7pg/ml，与对照相比差异性显著。然而，IL-10的量在免疫组和对照组间没有显着差异（P>0.05）。揭示表位疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答。
[0019] 脾细胞悬液加入FITC标记的抗CD8a单克隆抗体，抗IFN-γ-PE抗体标记，用+BeckmanCoulter流式细胞仪和CXP分析软件分析脾细胞中CD8 及IFN-γ的表达。流式分析（图2）结果显示，表位免疫组小鼠的脾细胞，表达IFN-γ的细胞比例为28.2%，显著高于PBS对照组（17.4%），IFN-γ的表达明显增加。
[0020] 实例4.表位疫苗免疫保护性研究。末次免疫后4周，免疫小鼠进行攻击实验。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊30个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠脑组织进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混匀，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS组相比，表位疫苗免疫组的小鼠脑中检测到包囊数量显著减少。（结果见表3）。与PBS对照组（1156±205）相比，VPNSSLVEN免疫组和SQFLSLSLL免疫组小鼠脑组织中的包囊数分别降至492±45和510±29（P<0.05），两种表位混合免疫可使小鼠脑组织中的包囊形成数显著减少为380±34（P<0.01)。
[0021] 附表说明
[0022] 表1.生物信息学方法预测抗原表位。
[0023] 从弓形虫的数据库（ToxoDB：http://toxodb.org/）中调取SAG2C，SAG2D和SAG2X蛋白序列。用免疫抗原决定簇数据库（IEDB）（http://www.iedb.org/）中的（ANN，SMM）算+法来筛选抗原表位。筛选出6个H-2（Ld，Kd，Dd）高亲和力CD8T细胞表位肽。
[0024] 表1.生物信息学预测H-2限制性CD8+T细胞表位的结果
[0025]
[0026] 表2.表位疫苗诱导产生的细胞因子。脾细胞刺激24小时和72小时收集细胞上清液分别测定IL-2的浓度，IL-10浓度。IL-2，IL-10浓度的测定根据制造商的说明使用商业化的ELISA试剂盒。VPNSSLVEN免疫组的小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量，141.2±10.2pg/ml；SQFLSLSLL免疫组的小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量，125.6±11.4pg/ml明显高于对照组（PBS：57.4±3.5pg/ml）（P<0.05）；而表位混合免疫组小鼠脾细胞培养上清中的IL-2含量更高为221.1±12.7pg/ml，与对照相比差异性显著。然而，IL-10的量在免疫组和对照组间没有显着差异（P>0.05）。揭示表位疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答。
[0027] 表2.ELISA法测定表位疫苗诱导产生的细胞因子
[0028]
[0029] 表3.免疫小鼠的攻击实验。末次免疫后4周，免疫鼠经口感染PRU株弓形虫包囊30个/只。8周后取小鼠脑组织进行包囊计数。与PBS对照组（1156±205）相比，VPNSSLVEN免疫组和SQFLSLSLL免疫组小鼠脑组织中的包囊数分别降至492±45和510±29（P<0.05），两种表位混合免疫可使小鼠脑组织中的包囊形成数显著减少为380±34（P<0.01)。
[0030] 表3
[0031]
[0032] *P<0.05,**P<0.01,与对照组比较。