与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的蛋白ZmSkp1及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的蛋白ZmSkp1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为ZmSkp1蛋白，来自玉米，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将序列3或序列1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的由序列3或序列1衍生的蛋白质。本发明为防控玉米矮花叶病打下了理论基础。

权利要求

1.一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制的方法，包括如下步骤：在出发玉米中导入携带序列表的序列4自5’末端第341至554位核苷酸所示的DNA分子转录得到的RNA的重组雀麦花叶病毒。

2.一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制的产品，其活性成分为携带序列表的序列4自

5’末端第341至554位核苷酸所示的DNA分子转录得到的RNA的重组雀麦花叶病毒。

3.一种制备对甘蔗花叶病毒的抗性增加的玉米的方法，是将携带序列表的序列4自5’末端第341至554位核苷酸所示的DNA分子转录得到的RNA的重组雀麦花叶病毒导入出发玉米，得到对甘蔗花叶病毒的抗性增加的玉米。

说明书

与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的蛋白ZmSkp1及其编码基

因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的蛋白ZmSkp1及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 玉米矮花叶病（maize dwarf mosaic disease,MDMD）可由一至多种病毒系统性侵染引起，在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病毒有6种，它们均属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），分别是甘蔗花叶病毒（Sugar cane mosaic virus，SCMV）、玉米矮花叶病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）、约翰逊草花叶病毒（Johnsongrass mosaic virus，JGMV）、玉米属花叶病毒（Zea mosaic virus，ZeMV）和白草花叶病毒（Pennisetum mosaic virus，PenMV）。SCMV是造成我国北方玉米产区玉米矮花叶病的主要病原。

[0003] 植物病毒作为一种细胞内专性寄生物，在侵染过程中必须依赖寄主因子参与病毒脱壳、基因组复制、病毒颗粒组装和病毒运动过程。因此，鉴定参与植物病毒侵染过程的寄主因子能够帮助我们深入了解病毒的侵染和致病机制，从而为病毒病的防控提供理论基础。近年来，病毒与寄主之间的分子互做研究逐渐成为热点，并已成为探寻病毒致病机制及寻找抗病基因的主要手段之一。

[0004] SCMV与玉米因子之间的互做研究还较为匮乏，SCMV与玉米因子之间的互做机理也还不清楚。因此，鉴定与SCMV的VPg蛋白互做的蛋白可以帮助我们解决以上的问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的蛋白ZmSkp1及其编码基因和应用。

[0006] 本发明提供的蛋白质，命名为ZmSkp1蛋白，来自玉米，是如下（a）或（b）或（c）：

[0007] （a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0008] （b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] （c）将序列3或序列1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关的由序列3或序列1衍生的蛋白质。

[0010] 编码所述蛋白质的基因（ZmSkp1基因）也属于本发明的保护范围。

[0011] 所述ZmSkp1基因具体可为如下1）至8）中任一所述的DNA分子：

[0012] 1）编码区如序列表中序列4自5’末端第1-342位核苷酸所示的DNA分子；

[0013] 2）编码区如序列表中序列4自5’末端第1-345位核苷酸所示的DNA分子；

[0014] 3）序列表中序列4所示的DNA分子；

[0015] 4）编码区如序列表中序列2自5’末端第1-342位核苷酸所示的DNA分子；

[0016] 5）编码区如序列表中序列2自5’末端第1-345位核苷酸所示的DNA分子；

[0017] 6）序列表中序列2所示的DNA分子；

[0018] 7）在严格条件下与1）至6）中任一限定的DNA序列杂交且编码与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关蛋白的DNA分子；

[0019] 8）与1）至6）中任一限定的DNA序列具有至少90%同源性且编码与甘蔗花叶病毒侵染玉米相关蛋白的DNA分子。

[0020] 所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0021] 含有所述ZmSkp1基因的重组质粒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组质粒具体可为：在载体pGDR的多克隆位点（如Hind III和Bam HⅠ酶切位点之间）插入所述ZmSkp1基因得到的重组质粒。

[0022] 本发明还保护一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制的方法，包括如下步骤：在出发玉米中导入（接种）用于抑制所述ZmSkp1基因表达的物质。

[0023] 本发明还保护一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制的产品，其活性成分为抑制所述ZmSkp1基因表达的物质。

[0024] 本发明还保护一种制备对甘蔗花叶病毒的抗性增加的玉米的方法，是将抑制所述ZmSkp1基因表达的物质导入出发玉米，得到对甘蔗花叶病毒的抗性增加的玉米。

[0025] 以上任一所述“抑制所述ZmSkp1基因表达的物质”具体可为携带序列表的序列4自5’末端第341至554位核苷酸所示的DNA分子编码的RNA的重组雀麦花叶病毒。

[0026] 所述重组雀麦花叶病毒的制备方法具体如下：将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共转染本生烟叶片，培养后得到含有重组雀麦花叶病毒的病毒粒子的叶片。

[0027] 本发明发现：（1）在玉米原生质体中共转化能瞬时表达ZmSkp1基因的质粒与SCMV-RNA，与共转化瞬时表达载体与SCMV-RNA的对照相比，瞬时过量表达ZmSkp1基因后，SCMV-RNA的积累量增加了50%，也就是说过量表达ZmSkp1基因能够促进SCMV的复制；（2）在玉米植株中瞬时沉默ZmSkp1基因再接种SCMV，ZmSkp1基因的表达水平下调40-50%后，SCMV的积累也相应减少40-50%，即下调表达ZmSkp1基因能够抑制SCMV的积累。本发明为防控玉米矮花叶病打下了理论基础。

附图说明

[0028] 图1为实施例3中光共聚集显微镜下的照片。

[0029] 图2为实施例3中ZmSKP1基因的相对表达水平和SCMV-RNA的相对表达水平。

具体实施方式

[0030] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0031] 玉 米 自 交 系 郑 58(Zheng58)：参 考 文 献：Mu G,,Liang Y.,Zhang Z.,W Y.,LiuS.,Peng H.,Zhang S.,Pan G.(2009)Mapping quantitative trait loci associated with photoperiod sensitivity in maize(Zea mays L.).Agricultural Sciences in China.8(1):24-30.。

[0032] 玉米自交系Va35：参考文献：Ding,X.S.,Schneider,W.L.,Chaluvadi,S.R.,Rouf Mian,M.A.and Nelson,R.S.(2006)Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Mol Plant Microbe Interact.19,1229-1239.。

[0033] 载体pGDR（该载体中具有DsRed基因）：参考文献：Goodin M.M.,Dietzgen R.G.,Schichnes D.,Ruzin S.,Jackson A.(2002)pGD vecyors:versatile tools for the expression of gene and red fluorescent protein fusion in agroinfiltrated plant leaves.The Plant Journal.31(3):375-383.。

[0034] 载 体 pC13/F3-13m：参 考 文 献：Sun,L.,Zhang,H.,Li,D.,Huang,L.,Hong,Y.,Ding,X.S.,Nelson,R.S.,Zhou,X.and Song,F.(2012)Functions of rice NAC transcriptional factors,ONAC122and ONAC131,in defense responses against Magnaporthe grisea.Plant Mol Biol.DOI10.1007/s11103-012-9981-3.。

[0035] 载体pC13/F1+2：参考文献：Sun,L.,Zhang,H.,Li,D.,Huang,L.,Hong,Y.,Ding,X.S.,Nelson,R.S.,Zhou,X.and Song,F.(2012)Functions of rice NAC transcriptional factors,ONAC122and ONAC131,in defense responses against Magnaporthe grisea.Plant Mol Biol.DOI10.1007/s11103-012-9981-3.。

[0036] 载体pC13/F3-13m和载体pC13/F1+2共浸润烟草后，表达雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus,BMV）的病毒粒子。

[0037] 农 杆 菌 菌 株 C58C1：参 考 文 献：Sun,L.,Zhang,H.,Li,D.,Huang,L.,Hong,Y.,Ding,X.S.,Nelson,R.S.,Zhou,X.and Song,F.(2012)Functions of rice NAC transcriptional factors,ONAC122and ONAC131,in defense responses against Magnaporthe grisea.Plant Mol Biol.DOI10.1007/s11103-012-9981-3.。

[0038] 本生烟：参考文献：Ding,X.S.,Schneider,W.L.,Chaluvadi,S.R.,Rouf Mian,M.A.and Nelson,R.S.(2006)Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Mol Plant Microbe Interact.19,1229-1239.。

[0039] 甘蔗花叶病毒：Fan,Z.F.,Chen,H.Y.,Liang,X.M.and Li,H.F.(2003)Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China.Arch Virol.148,773–782.。

[0040] 实施例1、ZmSkp1蛋白及其编码基因的发现

[0041] 利用酵母双杂交技术，以SCMV的VPg蛋白为诱饵进行筛选，得到一个与VPg蛋白互做的蛋白，将其命名为ZmSkp1蛋白。将编码ZmSkp1蛋白的基因命名为ZmSkp1基因。玉米自交系郑58来源的ZmSkp1蛋白如序列表的序列1所示，ZmSkp1基因如序列表的序列2所示。玉米自交系Va35来源的ZmSkp1蛋白如序列表的序列3所示，ZmSkp1基因如序列表的序列4所示。

[0042] 实施例2、构建重组质粒

[0043] 一、构建ZmSkp1基因的瞬时表达载体

[0044] 1、提取玉米自交系郑58的总RNA并反转录为cDNA。

[0045] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用ELC-1F和ELC-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0046] ELC-1F：5'-ATAAAGCTTCG ATGCCGCCGCCGCGTG-3'；

[0047] ELC-1R：5'-GGGGGATCC TCAAGTGTCCAGATAGTTTGCG-3'。

[0048] 3、用限制性内切酶Hind III和Bam HⅠ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

[0049] 4、用限制性内切酶Hind III和Bam HⅠ双酶切载体pGDR，回收约6000bp的载体骨架。

[0050] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pGDR-ZmSKP1（ZmSkp1基因的瞬时表达载体）。根据测序结果，对重组质粒pGDR-ZmSKP1进行结构描述如下：在载体pGDR的Hind III和Bam HⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至345位核苷酸所示的DNA分子。

[0051] 二、构建重组质粒pC13/F3-13m-SKP1

[0052] 1、提取玉米自交系Va35的总RNA并反转录为cDNA。

[0053] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，用ELC-5F和ELC-5R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0054] ELC-5F：5'-AGGCTTCCTAGG CTTGATGAGGAGCCTGAG-3'；

[0055] ELC-5R：5'-AGGCTTCCATGG CCTTTACATTACATTGTGCC-3'。

[0056] 3、用限制性内切酶Avr II和Nco I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

[0057] 4、用限制性内切酶Avr II和Nco I双酶切载体pC13/F3-13m，回收约13000bp的载体骨架。

[0058] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pC13/F3-13m-SKP1。根据测序结果，对重组质粒pC13/F3-13m-SKP1进行结构描述如下：在载体pC13/F3-13m的Avr II和Nco I酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第341至554位核苷酸所示的双链DNA分子。

[0059] 重组质粒pC13/F3-13m-SKP1和载体pC13/F1+2组成ZmSkp1基因的瞬时沉默载体。

[0060] 三、构建重组质粒pC13/F3-13m-GFP

[0061] 将序列表的序列5所示的GFP基因片段插入载体pC13/F3-13m的Avr II和Nco I酶切位点之间，得到重组质粒pC13/F3-13m-GFP。

[0062] 实施例3、瞬时表达实验

[0063] 一、玉米原生质体的制备

[0064] 1、选取籽粒饱满、大小均一的玉米自交系郑58的种子，置于25℃的培养箱暗培养。

[0065] 2、当玉米黄化苗长到第2片叶高于第一片10-15cm时，剪下第2片叶子中间的6-8cm的部分。

[0066] 3、轻轻将20片剪下的叶片叠在一起，剪成约0.5mm的细丝，每1g叶片加入5ml酶溶液（溶剂为水，含1-1.5g/100ml的纤维素酶R10、0.2-0.4g/100ml的离析酶R10、0.6M甘露醇、20mM KCl和20mM MES，pH5.7；纤维素酶R10和离析酶R10均购自Yakult Honsha，日本），避光抽真空30min（真空度0.05MPa），使酶溶液充分渗透到叶片中，然后40rpm避光消化3-4h，然后用孔径38μm的尼龙网过滤，收集滤液，即为玉米原生质体溶液（用血球计数计数玉米原生质体），置于冰上保存。

[0067] 二、SCMV-RNA的制备

[0068] 提取甘蔗花叶病毒的总RNA，又称SCMV-RNA。

[0069] 三、瞬时表达实验

[0070] 1、取玉米原生质体溶液（含约2×105个原生质体），加入10μg重组质粒pGDR-ZmSKP1和8μg SCMV-RNA，得到110μl的实验组反应体系。

[0071] 2、取玉米原生质体溶液（含约2×105个原生质体），加入10μg载体pGDR和8μgSCMV-RNA，得到110μl的对照组反应体系。

[0072] 3、将110μl的实验组反应体系（或110μl的对照组反应体系）与110μl PEG/Ca溶液(溶剂为水，含40g/100ml的PEG、0.2M甘露醇和0.1M CaCl2)混匀，室温孵育15min，然后加入440μl W5溶液(溶剂为水，含154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES,pH5.7)，混匀后150g离心1min，收集沉淀。

[0073] 4、将步骤3得到的沉淀重悬于1ml W5溶液，置于25℃的培养箱暗培养18h，通过激光共聚集显微镜观察DsRed红色荧光（激光扫描共聚焦显微镜激发光波长543nm），实验组和对照组均可以观察到红色荧光均分布于整个原生质体细胞。见图1。

[0074] 5、取完成步骤4的原生质体，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板，采用Tm TMTakaka SYBR premix Ex Taq 试剂盒，采用DNA Engine Opticon 2system（Bio-Rad），采用玉米泛素基因作为内参基因，PCR鉴定ZmSkp1基因的相对表达量和SCMV-RNA的含量。

[0075] 用于鉴定ZmSkp1基因的引物对如下：

[0076] ZmSKP1qF：5'-AATTCGTTGTTGACAGGAAG-3'；

[0077] ZmSKP1qR：5'-GTTATCTCCGGTTCGATTGG-3'。

[0078] 用于鉴定和SCMV-RNA的引物对如下：

[0079] SCMVqF：5'-TTTATGCGTGGCTTCTCG-3'；

[0080] SCMVqR：5'-TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3'。

[0081] 用于鉴定玉米泛素基因的引物对如下：

[0082] UbiF：5'-GGAAAAACCATAACCCTGGA-3'；

[0083] UbiR：5'-ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3'。

[0084] 得到的数据用2-△△CT法进行分析，步骤如下：

[0085] 首先，对实验组样本（test）和对照组样本（calibrator），用参照基因（ref）的CT值归一目标基因（target）的CT值：

[0086] △CT(test)=CT(target,test)-CT(ref,test)；

[0087] △CT(calibrator)=CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator)；

[0088] 其次，用对照组样本的△CT值归一实验组样本的△CT值：

[0089] △△CT=△CT(test)－△CT(calibrator)；

[0090] 最后，计算表达水平比率：

[0091] 2-△△CT=表达量的比值。

[0092] 结果见图2。实验组样本的ZmSKP1基因的相对表达水平为对照组样本的3.5倍，实验组样本SCMV-RNA的相对表达量为对照组样本的1.5倍。

[0093] 实施例4、瞬时沉默实验

[0094] 一、重组农杆菌的制备

[0095] 1、将载体pC13/F1+2导入农杆菌菌株C58C1，得到重组农杆菌甲，用浸润缓冲液（溶剂为水，含10mM MES、10mM MgCl2、200μM乙酰丁香酮，pH5.7）重悬重组农杆菌甲，得到OD600nm=2.0的菌悬液甲。

[0096] 2、将重组质粒pC13/F3-13m-SKP1导入农杆菌菌株C58C1，得到重组农杆菌乙，用浸润缓冲液重悬重组农杆菌乙，得到OD600nm=2.0的菌悬液乙。

[0097] 3、将载体pC13/F3-13m-GFP导入农杆菌菌株C58C1，得到重组农杆菌丙，用浸润缓冲液重悬重组农杆菌丙，得到OD600nm=2.0的菌悬液丙。

[0098] 二、在本生烟中扩繁BMV的病毒粒子

[0099] 1、病毒粒子BMV-SKP1的制备

[0100] （1）将菌悬液甲和菌悬液乙等体积混合，在移栽25-30天的本生烟的每片叶片上均注射所述混合液，然后22-24℃培养3天。

[0101] （2）完成步骤（1）后取本生烟叶片，用液氮研磨成粉末；取0.4g叶片粉末，加入800μl BMV提取缓冲液(溶剂为水，含0.5M NaAc和0.8M HAc)，振荡混匀后置于冰上孵育
30min，然后4℃、8000g离心10min，取上清；按照每100μl上清液加入230μl40%PEG/NaCl溶液(溶剂为水，含40%PEG8000和0.8M NaCl)的比例加入相应体积的40%PEG/NaCl溶液，混匀后置于冰上孵育1h，然后于4℃、15000g离心15min，取沉淀，即为病毒粒子BMV-SKP1。

[0102] （3）提取病毒粒子BMV-SKP1的RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板用XSD198和XSD199组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果PCR扩增产物约为614bp，说明得到了表达序列表的序列3自5’末端第341至554位核苷酸所示的DNA分子的BMV病毒粒子。

[0103] XSD198：5'-CTTGTGTTGCTGAGAAAC-3'；

[0104] XSD199：5'-TCTTGTAAGAGGTCTGC-3'。

[0105] 2、病毒粒子BMV-GFP的制备

[0106] （1）将菌悬液甲和菌悬液丙等体积混合，在移栽25-30天的本生烟的每片叶片上均注射所述混合液，然后22-24℃培养3天。

[0107] （2）方法同步骤1的（2），得到病毒粒子BMV-GFP。

[0108] （3）提取病毒粒子BMV-GFP的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板用XSD198和XSD199组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果PCR扩增产物约为625bp，说明得到了表达序列4所示DNA分子的BMV病毒粒子。

[0109] 三、瞬时沉默ZmSKP1基因对SCMV积累的影响

[0110] 1、分别将病毒粒子BMV-SKP1和病毒粒子BMV-GFP进行如下操作：

[0111] （1）实验第1天，取处于二叶期长势良好的玉米自交系Va35，将20μg病毒粒子摩擦接种于自下向上的第2个叶片（将其命名为接种叶），然后将植株用透明罩盖起来，18-20℃培养。

[0112] （2）实验第7天，移去透明罩，22-24℃培养。

[0113] （3）实验第8天，将甘蔗花叶病毒的病毒摩擦接种于植株的所述接种叶，然后将植株用透明罩盖起来，24℃培养，实验第11天移去透明罩。

[0114] 接种病毒粒子BMV-SKP1的植株为12株。

[0115] 接种病毒粒子BMV-GFP的植株为8株。

[0116] 2、ZmSKP1基因的沉默效率和SCMV-RNA的积累情况

[0117] 实验第13天，取第二片系统叶（接种叶上方与接种叶间隔一片叶子的叶片），提取Tm总RNA并反转录为cDNA，以cDNA作为模板，采用Takaka SYBR premix Ex Taq 试剂盒，TM
采用DNA Engine Opticon 2system（Bio-Rad），采用玉米泛素基因作为内参基因，PCR鉴定ZmSkp1基因的相对表达量和SCMV-RNA的含量。方法见实施例3。

[0118] 将接种病毒粒子BMV-GFP的植株中ZmSKP1基因的相对表达量（8株的平均值）作为1，计算接种病毒粒子BMV-SKP1的植株中ZmSKP1基因的相对表达量。根据ZmSKP1基因的相对表达量的不同，将接种病毒粒子BMV-SKP1的植株分为3组：第一组4株，ZmSKP1基因的相对表达量为52%至58%；第二组5株，ZmSKP1基因的相对表达量为69%至76%；第三组3株，ZmSKP1基因的相对表达量为80%至82%。

[0119] 将接种病毒粒子BMV-GFP的植株中SCMV-RNA的含量（8株的平均值）作为1，计算接种病毒粒子BMV-SKP1的植株中SCMV-RNA的相对含量。第一组的4株中SCMV-RNA的相对含量为59%（4株的平均值），第二组的5株中SCMV-RNA的相对含量为73%（5株的平均值），第三组的3株中SCMV-RNA的相对含量为95%（3株的平均值）。

[0120] 结果表明，当ZmSKP1基因的表达量下调时，SCMV-RNA的积累也相应显著减少。

[0121] 3、表型观察

[0122] 实验第20天，观察植株表型。接种病毒粒子BMV-SKP1的植株的表型为：第二和第三片系统叶出现比较轻微的花叶和褪绿症状，第一组植株的发病表征最轻微，其次是第二组植株，再次是第三组植株。接种病毒粒子BMV-GFP的植株的表型为：第二片和第三片系统叶出现严重的花叶和褪绿症状。