一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法

摘要

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。该菌株为一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3，保藏编号CCTCC NO.M2013072。该菌株是从石油和油污样品中经富集培养、平板筛选和划线纯化筛选而得，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。采用该菌株摇瓶液体发酵48小时后，发酵液酶活达195.69U/mL。

权利要求

1.一种脂肪酶高产菌株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2013072。

2.一种脂肪酶的发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：获得保藏编号为CCTCC NO：M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物；

取所述保藏编号为CCTCC NO：M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物接种于发酵培养基，培养、纯化即得。

3.根据权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，所述培养的条件为在转速为180转/分钟的条件下、30℃培养48h。

4.根据权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，以体积百分数计，所述接种的接种量为6％。

5.根据权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，所述保藏编号为CCTCC NO：M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物的制备方法包括如下步骤：步骤1：取保藏编号为CCTCC NO：M2013072的脂肪酶高产菌株，接种于斜面培养基，于

30℃培养18～24h，获得斜面菌种；

步骤2：取所述斜面菌种接入种子培养基中，在转速为180转/分钟的条件下于30℃培养14～18h，即得。

6.根据权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，1L所述发酵培养基中包括：橄榄油10mL、蔗糖15g、蛋白胨10g、NaCl 10g。

说明书

一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂

肪酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。

背景技术

[0002] 脂肪酶(Lipase)是催化酰基甘油酯水解为脂肪酸和甘油的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。脂肪酶催化反应具很广的底物范围，在催化底物合成和水解时不需要辅助因子，在有机溶剂中有很高的稳定性，在催化反应过程中具有立体特异性和区域专一性等特点。由于脂肪酶具有以上优点，近年来脂肪酶的应用范围不断拓宽，不仅能用于人们的日常生活中，如作为洗衣粉添加剂和污水处理等，还能广泛的应用于精细化工、生物柴油、医药工业、食品工业等行业中。脂肪酶作为一种重要的工业用酶在全球酶制剂市场位列第三。

[0003] 高性能工业用酶的开发和利用是目前生物技术领域研究的热点之一。微生物酶与动植物酶相比性质更稳定，更易获得和更加安全，因此微生物来源的酶比动植物来源的酶具有更广泛的用途。但目前全球仅有2%的微生物作为酶源并被鉴定。从环境中筛选出有价值的产酶微生物变得尤为重要。我国产脂肪酶微生物品种少，活力较差，急待加强微生物育种的研究。

[0004] 筛选脂肪酶产生菌常用的方法主要有透明圈平板筛选法和生色圈平板筛选法。由于透明圈(或变色圈)有效直径的大小与酶活对数呈线性关系，可根据透明圈(或变色圈)直径对酶活进行定性和定量分析，以粗略筛选出高产脂肪酶菌株。传统细菌鉴定的主要依据是形态结构、行为习性、生理生化及培养特征等表型。随着分子生物学的发展，分子分类正成为分类学的主要方法，越来越受到重视，如16S rDNA相似性。目前，研究菌株分类地位最有效的方法就是把特征序列放到系统发育树中，考察与其它菌株之间的关系，再结合其它分类信息来最终确证其分类地位。随着核酸测序技术的发展，16S rDNA序列越来越多地被用于细菌的系统进化研究并已成为确立细菌新分类单位的必要数据；随着互联网的迅速发展，我们可以很快捷、容易地从一些大型数据库如核糖体数据库计划(Ribosomal Database Project,RDP)或EMBL/GenBank获得相关菌株的16S rDNA序列用于构建系统发育树。

[0005] 微生物脂肪酶生产主要有固、液两种发酵方法。霉菌是固态发酵脂肪酶主要菌种，而细菌和酵母则主要采用液态深层发酵。发酵条件的优化对于微生物产脂肪酶十分重要。微生物产脂肪酶发酵除受温度、pH、溶氧影响外，其产量深受培养基组分影响。

[0006] 因此，提供一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法具有现实意义。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明提供一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。该菌株为一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3，保藏编号CCTCC NO.M2013072。该菌株是从石油和油污样品中经富集培养、平板筛选和划线纯化筛选而得，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。采用该菌株摇瓶液体发酵48小时后，发酵液酶活达195.69U/mL。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0009] 本发明提供了一种脂肪酶高产菌株，其保藏编号为CCTCC NO.M2013072。

[0010] 本发明还提供了一种保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株的筛选方法，取石油或油污在橄榄油液体富集培养液中富集，稀释后涂布于丁酸筛选培养基培养后，挑取透明圈直径最大的菌落，经纯化即得。

[0011] 作为优选，1L橄榄油液体富集培养液中包括：(NH4)2SO41.0g、NaCl0.5g、MgSO40.1g、K2HPO41g、橄榄油0.01L。

[0012] 在本发明的一些实施例中，富集的次数为至少3次。

[0013] 作为优选，稀释倍数为10-7-10-11倍。

[0014] 作为优选，1L丁酸筛选培养基中包括：酵母提取物1.0g、(NH4)2SO41.0g、NaCl0.5g、MgSO4 0.1g、K2HPO4 1g、琼脂15g、三丁酸甘油酯0.01L。

[0015] 本发明还提供了一种脂肪酶的发酵生产方法，包括如下步骤：

[0016] 获得保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物；

[0017] 取保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物接种于发酵培养基，培养、纯化即得。

[0018] 在本发明的一些实施例中，培养的条件为在转速为180转/分钟的条件下、30℃培养48h。

[0019] 作为优选，以体积百分数计，接种的接种量为6%。

[0020] 在本发明的一些实施例中，保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株的种瓶培养物的制备方法包括如下步骤：

[0021] 步骤1：取保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株，接种于斜面培养基，于30℃培养18～24h，获得斜面菌种；

[0022] 步骤2：取斜面菌种接入种子培养基中，在转速为180转/分钟的条件下于30℃培养14～18h，即得。

[0023] 作为优选，斜面培养基中包括：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

[0024] 作为优选，种子培养基包括：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。

[0025] 作为优选，1L发酵培养基中包括：橄榄油10mL、蔗糖15g、蛋白胨10g、NaCl 10g。

[0026] 本发明提供一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。该菌株为一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3，保藏编号CCTCC NO.M2013072。该菌株是从石油和油污样品中经富集培养、平板筛选和划线纯化筛选而得，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。采用该菌株摇瓶液体发酵48小时后，发酵液酶活达195.69U/mL。

[0027] 生物保藏说明

[0028] 菌株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3于2013年3月8日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏中心地址为湖北省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M2013072。

附图说明

[0029] 图1示菌株的菌落透明圈图；

[0030] 图2示菌株的菌落形态图；

[0031] 图3示扫描电镜下的菌株形态图；

[0032] 图4示菌株的系统发育分析树。

具体实施方式

[0033] 本发明公开了一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0034] 本发明提供的一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法中所用试剂均可由市场购得。

[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0036] 实施例1 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3菌种筛选

[0037] 称取石油和油污1g样品，悬浮于盛有50mL橄榄油液体富集培养液((NH4)2SO41.0g/L；NaCl 0.5g/L；MgSO40.1g/L；K2HPO41g/L；橄榄油1%；pH自然)的锥形瓶中，30℃，180r/min震荡培养，富集48h后，移取1mL培养液至另一盛有新鲜富集培养液的三角瓶中继续培养，同样条件下重复富集培养三次。

[0038] 将富集培养的菌液用无菌水采用稀释法分别稀释到原来浓度的10-7-10-11倍，取200μL涂布于丁酸筛选培养基(酵母提取物1.0g/L；(NH4)2SO4 1.0g/L；NaCl 0.5g/L；
MgSO4 0.1g/L；K2HPO41g/L；琼脂1.5%；三丁酸甘油酯1%，超声波破碎仪乳化；pH自然)中。
30℃培养箱倒置培养24-48h。观察菌落周围是否有透明圈，透明圈直径越大，则表明该菌株产脂肪酶能力越强。筛选菌种的菌落透明圈见图1。

[0039] 用无菌接种针将透明圈直径较大的菌落接种在LB液体培养基上(蛋白胨10.0g/L；酵母提取物5.0g/L；NaCl 10.0g/L)继续培养，随后在丁酸筛选平板上划线纯化，挑取单克隆在LB液体培养基上继续摇菌培养。取培养菌液850mL，加80%的甘油150mL，-70℃保存。

[0040] 实施例2 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3形态学鉴定

[0041] 取实施例1获得的保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3在LB固体培养基平板上30℃恒温培养箱倒置培养2天。观察菌落形态特征。

[0042] 菌落形态特征：菌落呈圆形，直径约2-3mm，边缘整齐，表面光滑，中部凸起，不透明，乳黄色；3天后部分菌体有色素分泌，菌落出现红褐色。参见附图2。

[0043] 菌株形态特征：取菌液少许滴在盖玻片上，自然干燥，2.5%的戊二醛溶液固定(4℃、过夜)，梯度酒精(30%→50%→70%→80%→95%)逐级脱水，每次15min，100%乙醇脱水3次，每次30min，叔丁醇置换乙醇3次，每次30min；冷冻干燥仪干燥，离子溅射，扫描电子显微镜观察并拍照。该菌株为杆状，菌体长约2μm，宽约0.4μm。参见图3。

[0044] 实施例3 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3生理生化鉴定

[0045] 生理生化特征根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠、蔡妙英编，科学出版社，2001，169,171)对实施例1获得的保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3进行生理生化鉴定(见表1)，其生理生化特征与洋葱伯克霍尔德氏菌基本吻合。

[0046] 表1 生理生化特征

[0047]

[0048] 注：以“+”表示阳性；以“－”表示阴性；以“⊕”表示既产酸又产气。

[0049] 实施例4 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3的16S rDNA分子生物学鉴定

[0050] 以p1和p2为正向和反向引物，p1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(上游引物)，如SEQ ID NO：2所示；p2：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(下游引物)，如SEQ ID NO：3所示。以实施例1获得的菌株基因组为模板，进行PCR扩增。扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒SV Gel and PCR Clean-Up System)纯化，并经T-A克隆，连接入T-vector后，送南京金斯特生物技术有限公司进行序列测定，其序列如SEQ ID NO：1。将测序所得序列在NCBI网站上用BLAST检索Genbank中相关菌株的16S rDNA序列，并进行核苷酸同源性比对。与Genbank中相关菌株的16S rDNA有99%的相似性，将该菌株命名为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3，保藏编号为CCTCC NO.M2013072。该菌株的系统发育树见图4。

[0051] 实施例5 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3液体发酵生产脂肪酶

[0052] 斜面培养：将实施例1获得的保藏编号为：CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3接种于斜面培养基上，在30℃下培养18-24小时。所用斜面培养基(单位克/升)为：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂15，pH自然，121℃灭菌20分钟；

[0053] 种子培养：将斜面长好的菌种用灭菌移液枪头挑取单克隆接入种子培养基中，在30℃培养14-18小时，摇床转速180转/分钟。所用种子培养基(单位克/升)为：酵母膏
5，蛋白胨10，NaCl 10，pH自然，每250mL锥形瓶装50mL液体，121℃灭菌20分钟；

[0054] 液体发酵培养：将培养好的种子接入250毫升锥形瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为3毫升，温度30℃、摇床转速180转/分钟条件下，发酵时间48小时。所用发酵培养基为：橄榄油10mL/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，每250mL锥形瓶装50mL液体，121℃灭菌20分钟。

[0055] 培养结束，发酵液的脂肪酶活为107.12U/mL。

[0056] 实施例6 保藏编号为CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3液体发酵生产脂肪酶

[0057] 斜面培养：将实施例1获得的保藏编号为：CCTCC NO.M2013072的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3接种于斜面培养基上，在30℃下培养18-24小时。所用斜面培养基(单位克/升)为：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂15，pH自然，121℃灭菌20分钟；

[0058] 种子培养：将斜面长好的菌种用灭菌移液枪头挑取单克隆接入种子培养基中，在30℃培养14-18小时，摇床转速180转/分钟。所用种子培养基(单位克/升)为：酵母膏
5，蛋白胨10，NaCl 10，pH自然，每250mL锥形瓶装50mL液体，121℃灭菌20分钟；

[0059] 液体发酵培养：将培养好的种子接入250毫升锥形瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为3毫升，温度30℃、摇床转速180转/分钟条件下，发酵时间48小时。所用发酵培养基为：橄榄油10mL/L，蔗糖5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，每250mL锥形瓶装50mL液体，121℃灭菌20分钟。

[0060] 培养结束，发酵液的脂肪酶活为130.77U/mL。将液体发酵培养基中的蔗糖5g/L提升至蔗糖15g/L，其余同实施例5。培养结束，发酵液的脂肪酶活为195.69U/mL。

[0061] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。