一种富集分离幽门螺杆菌的方法转让专利
申请号 : CN201310219396.4
文献号 : CN103275902B
文献日 : 2015-03-11
发明人 : 魏华
申请人 : 南昌大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种富集分离幽门螺杆菌HP的方法,其特征在于包括以下步骤:(1) 每称取4.5 mg树状超支聚合物,溶解于4 mL 0.01 mol/L,pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中,搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL,使戊二醛的终浓度为3%;在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h;
滴加12 mg幽门螺杆菌HP 特异性抗体,使其终浓度达到3 mg/mL左右,摇床150 r/min 的转速下室温反应24 h;减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状超支聚合物-抗体复合物;(2)取15 mg 长链生物素,溶解于4 mL 0.01 mol/L pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中,搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL,使戊二醛的终浓度为3%;在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h;加入0.55 mg树状超支聚合物-抗体复合物,在摇床150 r/min的转速下室温反应24 h;减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物;(3)取1 mL待测样品溶液,加入0.1 mg HP抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物即步骤(2)长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min,插入常规磁力架分离3 min;所述纳米磁珠粒径为20-50nm;(4)磁力分离后,用0.1% PBST洗涤后,用PBS缓冲液重悬即得捕获有幽门螺杆菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状超支聚合物-抗体-HP 抗原复合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述树状超支聚合物为氨基化的树枝状化聚酰胺-胺,其分子量为56000 Da。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述纳米磁珠粒径为30 nm。
说明书 :
一种富集分离幽门螺杆菌的方法
技术领域
背景技术
国,每年食物中毒例数在20~40万人,除意外事故外,大部分均由食源性致病菌引起。幽
门螺杆菌(Helicobacter Pylor, HP) 是微需氧菌,环境氧要求5~8%,在大气或绝对厌氧
环境下不能生存,但可通过手、不洁食物、不洁餐具、粪便等途径传染,是慢性活动性胃炎、
消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病菌。1994年世界卫生组织/国
际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。因此,在食源性致病菌检测方
面,发展快速、高效富集分离样品中幽门螺杆菌的技术都是极有必要。
离法(IMS)将目标菌抗体连接到磁珠上,然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进
行捕获、富集,磁分离(具体原理见图2A)。然而,目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存
在诸多局限性:1)微米磁珠的比表面积相对较小,降低了磁珠捕获效率;2)由于微米磁珠
自身的颗粒性质,其与细菌细胞之间通过多相反应(multiphase reaction)结合,通常需要
更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞;3)微米磁珠单分散性较差,在食品基质
液中容易发生自身聚集或形成沉淀;4)传统的免疫磁分离技术,往往是将抗体分子直接偶
联于免疫磁珠上,此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生
改变增大了抗体间的空间位阻效应,从而降低了抗体的捕获效率5)食品基质性质复杂并且
其中非目的致病菌的杂菌浓度大,微米磁珠容易产生非特异性吸附,难以实现对食品样液
中目的菌的特异性分离;6)微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损(磁场导致细胞表
面磁珠互相吸引,使细胞受到挤压甚至破裂,导致分离的失败。
发明内容
方法。
液545 μL,使戊二醛的终浓度为3%。在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h;滴加12
mg幽门螺杆菌HP 特异性抗体,使其终浓度达到 3 mg/mL左右,摇床150 r/min 的转速下
室温反应24 h;减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将
得到的溶液冷冻干燥得树状超支聚合物-抗体复合物;(2)取15 mg 长链生物素,溶解于
4 mL 0.01 mol/L pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中,搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL,使戊
二醛的终浓度为3%。在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h;加入0.55 mg树状超支
聚合物-抗体复合物,在摇床150 r/min的转速下室温反应24 h;减压旋干溶剂,去离子水
溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树状
超支聚合物-抗体复合物;(3)取1 mL待测样品溶液,加入0.1 mg HP抗体和长链生物素
共修饰的树状超支聚合物即步骤(2)长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物,置于混
匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置
于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min,插入常规磁力架分离3 min;(4)磁力分离
后,用0.1% PBST洗涤后,用PBS缓冲液重悬即得捕获有幽门螺杆菌的纳米磁珠-链霉亲和
素-长链生物素-树状超支聚合物-抗体-HP 抗原复合物。
具体原理见图2B。
规处理方法即可长链生物素。
法相比,分离到目的菌能力更强,特别适用于复杂样品的分离,如食品样品、全血样品等。针
对单纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的菌速度慢、磁场要
求高的缺陷,采用树状大分子实现纳米磁珠磁信号的放大,从而提高了复杂基质样品中目
的菌分离效率,实现了在低梯度磁场下(小于30 T/m)复杂的食品基质中目的菌特异性快速
分离。
长链生物素分子,可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠,从而使树状超支聚合物上结合大
量的纳米磁珠,实现了磁细菌信号的级联放大,有利于缩短磁细菌的分离时间。
覆盖的细菌可以保持正常的形状,纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性,因
此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。
识别,从而使树状超支聚合物上结合大量的纳米磁珠,大大增加了靶细菌表面结合的磁珠
数量,实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细菌。与传统的细菌磁分离方法相比,因加入的
是在基质中更为稳定的纳米磁珠,该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离,提高
了复杂基质样品中目的菌分离效率。
易引起抗体空间构象发生改变,导致抗体生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引
入树状超支聚合物,其具有一定的空间大小,从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面,避免了
磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时,引入的树状超支聚合物却不会影响抗
体空间构象,从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。
附图说明
具体实施方式
以1/1000(V/V)的体积比加入Tween 20,即获得0.1%PBST。
终浓度为3%。在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h;
速下室温反应3.5 h;
超支聚合物-抗体-幽门螺杆菌抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,
置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,将离心管插入常规磁力架分离3 min;
修饰的微米磁珠组富集目的菌。
公式如下:(被富集吸附的菌落总数/所有的细菌总数)×100%。
育15 min。然后加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转
速再室温孵育15 min。最后,将离心管插入常规磁力架分离3 min。
离3 min。
4.0)洗三次,无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg,EDC 0.35 mg,置于混匀仪上保持磁珠悬
浮,37℃活化2 h。(2)磁力架回收磁珠,PBS(0.02 M,pH 4.0)洗涤三次后,磁珠重悬于无
菌PBS中,按每mg磁珠加入80 μg 幽门螺杆菌特异性抗体,置于混匀仪上37℃偶联2 h。
(3)加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠,PBS 洗涤三次,10 ml PBS(含0.05% NaN3,
0.5% BSA,pH 7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
离3 min。
pH 4.0)洗三次,无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg,EDC 0.35 mg,置于混匀仪上保持磁珠悬
浮,37℃活化2 h。(2)磁力架回收磁珠,PBS(0.02 M,pH 4.0)洗涤三次后,磁珠重悬于无
菌PBS中,按每mg磁珠加入80 μg 幽门螺杆菌特异性抗体,置于混匀仪上37℃偶联2 h。
(3)加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠,PBS 洗涤三次,10 ml PBS(含0.05% NaN3,
0.5% BSA,pH 7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
52.7% 22.1% 90.4%
就能分离富集较多的目标菌。但是,本发明技术方案组的捕获效率又远远大于幽门螺杆菌
特异性抗体修饰的微米磁珠组,这表明本发明技术方案借助树状超支聚合物可以增加目标
菌表面纳米磁珠覆盖率,从而使磁性大大提高,进而实现了在短时间内(3min)高效分离富
集幽门螺杆菌。
53.1% 34.8% 91.0%
明显,这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率,但是其还是低于短时
间分离(3min)时幽门螺杆菌抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物组的捕获效率。这
表明本发明技术方案可以在短时间内(3min)高效分离富集幽门螺杆菌。
链霉亲和素的纳米磁珠(0.1 mg),置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最
后,常规磁力架分离3 min。磁分离后,将上清液倒入无菌离心管中,而分离出来捕获有幽门
螺杆菌的免疫磁珠则用PBST清洗两次,混合均匀,并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。
捕获率如实施例2方法获得,其余同实施例2。结果见表1,表明本方案能高效富集分离样
品中的幽门螺杆菌。
实施例4胃液83.5%
实施例5粪便84.3%
实施例6全血81.1%