具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌CCFM0528

摘要

本发明涉及一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）Lactobacillus rhamnosus CCFM0528，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.7317。CCFM0528的发酵上清和细胞质对α-葡萄糖苷酶活的抑制率分别为29.2%和14.1%，研究发现CCFM0528不仅对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，还对葡萄糖的转运有抑制作用。实验结果表明CCFM0528能够预防2型糖尿病的发生，有效降低小鼠空腹血糖和餐后血糖，提高其对葡萄糖的耐受性，其原理可能是CCFM0528对肠道的α-葡萄糖苷酶活性及酶的表达量有抑制作用，并对与葡萄糖转运有关的蛋白SGLT-1和GLUT-2的基因表达水平有影响。

权利要求

1.一种具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528，该菌株已于2013年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所，保藏编号为CGMCC No.7317。

2.包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528的药物组合物，其特征在于其中所包含的菌株是活菌株或干菌株。

3.包含培养发酵权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528后获得的发酵上清液的药物组合物。

4.根据权利要求2或3所述的包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，其剂型为口服制剂。

5.根据权利要求4所述的包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528的药物组合物，其特征在于所述口服制剂是片剂，胶囊剂，口服液或冻干粉剂。

6.包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528或其发酵液的食品。

7.根据权利要求6所述的食品，其特征在于所述食品是发酵食品。

8.根据权利要求7所述的食品，其特征在于所述发酵食品是酸豆奶、乳制品、发酵果冻或发酵茶饮料。

9.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM0528或权利要求2-4任一项所述的药物组合物在制备用于预防糖尿病的药物中的用途。

10.权利要求9所述的用途，其特征在于所述糖尿病是2型糖尿病。

说明书

具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌CCFM0528

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域的微生物领域，特别是具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌CCFM0528。技术背景

[0002] 根据1999年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)公布的定义，其主要分为胰岛素依赖型糖尿病(1型即DIDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型即NIDDM)，其它类型和妊娠糖尿病四种类型，其中2型糖尿病患者约占90%以上。近年来,糖尿病在全世界广泛流行,已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三位严重危害人类健康的慢性疾病。我国糖尿病患病率在过去20年中上升了4倍，2007年全国糖尿病患病人数为3980万，仅次于印度成为全球糖尿病患者人数第二大国。因此，急需通过有效措施来预防和治疗糖尿病。而控制餐后高血糖对于治疗早期糖尿病具有极其重要的意义,其中控制餐后碳水化合物的吸收是一种降低餐后高血糖的有效治疗方法。由于小肠只能够吸收和运输单糖到血液循环中，而由肠上皮细胞分泌的α-葡萄糖苷酶，能够将多糖水解为单糖，所以被认为是肠内葡萄糖吸收的重要因素。因此对于2型糖尿病患者而言，服用一些含有α-葡萄糖苷酶抑制剂的降血糖口服药能够有效地降低高血糖。这些药物能够竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶，抑制双糖水解成单糖，妨碍葡萄糖的消化与吸收，从而降低餐后血液中的血糖含量。目前所发现的α-葡萄糖苷酶抑制剂种类较少，因此人们仍不断致力于开发新型α-葡萄糖苷酶抑制剂。

[0003] 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称,是一种存在于人类体内的益生菌。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之中。据最近几年研究资料表明，乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种保健作用：1.能维持微生态平衡和肠管机能；2.有抗菌作用，能抑制腐败菌，如可杀灭李斯特菌，葡萄球菌和明串珠菌，以抑制和消灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性菌，大肠杆菌和沙门氏菌等；3.能改善肝功能；4.乳酸菌能使肠道减少对胆固醇的吸收，并能将一部分胆固醇转变成胆酸盐排出体外；5.能增强免疫功能和抗肿瘤病。近年来，有研究报道乳酸菌对糖尿病治疗有积极地影响。乳酸菌可以预防和延迟不同类型糖尿病的发生。2004年日本河合乳酸菌研究所负责人河合康雄发现了能降低血糖的乳酸菌，其可用来开发预防和治疗糖尿病的药物。目前大量研究表明，乳酸菌具有减少糖尿病发病率的潜力，但是人们对于乳酸菌作为糖尿病治疗剂的研究还是很少。

发明内容

[0004] 本发明涉及一种具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CCFM0528，其特征在于该菌株具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，在中国微生物菌种保藏中心保藏编号为CGMCC No.7317。

[0005] 另一方面，本发明还涉及鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CCFM0528在制备用于预防糖尿病的药物中的用途，所述糖尿病是1型或2型糖尿病。

[0006] 本发明还涉及包含鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CCFM0528的药物组合物，所述药物组合物中所包含的菌株可以是活菌株或干菌株或菌株的代谢物，此外药物组合物还包含药学上可接受的载体，其剂型可以是口服制剂，例如片剂，胶囊剂，口服液，冻干粉剂等常见的口服剂型。药学上常见的可接受载体有赋形剂，保护剂，溶解剂等。

[0007] 本发明还涉及包含鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CCFM0528的食物，所述食物是发酵食品，例如酸豆奶，发酵果冻，发酵茶饮料或奶制品，如酸奶，酸酸乳，奶酪制品，乳酸菌奶粉，酸蛋奶冰淇淋等。

[0008] 1、根据基本的益生特性及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，建立一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性作用的益生菌的初筛方法。CCFM0528的发酵上清和细胞质对α-葡萄糖苷酶活的抑制率分别为29.2%和14.1%。

[0009] 2、在Caco-2细胞模型中评价CCFM0528对α-葡萄糖苷酶活性及表达量的影响作用。CCFM0528的发酵上清和细胞质对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分别为15.7%和20.0%，对葡萄糖的转运抑制率分别为7.0%和19.3%；CCFM0528的上清和细胞质对α-葡萄糖苷酶（S-I）基因表达水平分别下调7.29倍和上调1.04倍，对钠-葡萄糖共转运体-1（SGLT-1）基因表达水平分别下调2.5倍和上调2.2倍，对葡萄糖转运蛋白-2（GLUT-2）的基因表达水平分别下调1.1倍和1.2倍。

[0010] 3、利用高脂饲料喂养及STZ注射的动物模型评价CCFM0528对2型糖尿病的预防作用。造模成功后模型组空腹血糖水平为12.9mmol/L，CCFM0528能够显著降低预防组的空腹血糖水平至8.13mmol/L（P﹤0.01）；模型组餐后2h血糖水平为23.0mmol/L,CCFM0528能够显著降低预防组的餐后2h血糖水平至14.3mmol/L（P﹤0.01）；与模型组相比CCFM0528显著改善预防组的口服葡萄糖耐受（OGTT）（P﹤0.01）。

附图说明

[0011] 图1CCFM0528在pH3.0模拟胃液中的存活率；

[0012] 图2CCFM0528在pH8.0模拟肠液中的存活率；

[0013] 图3CCFM0528上清及无细胞提取物对大鼠α-葡萄糖苷酶活性的抑制率；

[0014] 图4生长在微孔滤膜上21天时的细胞单层扫描电镜图，A×1000；B×10000；

[0015] 图5CCFM0528对Caco-2细胞中α-葡萄糖苷酶活性的抑制率；

[0016] 图6CCFM0528对Caco-2细胞中葡萄糖转运的抑制作用；

[0017] 图7S-I，SGLT-1和GLUT-2三种基因的相对表达量，注：**表示与对照组相比差异极显著，P＜0.01；

[0018] 图8各组小鼠试验期间体重变化；

[0019] 图9造模成功后各组小鼠空腹血糖水平，注：**表示与正常组相比差异极显著，P＜0.01；

[0020] 图10造模成功后各组小鼠餐后血糖水平，注：**表示与正常组相比差异极显著，P＜0.01；

[0021] 图11造模成功后各组小鼠的糖耐受性；

[0022] 图12造模一周后各组小鼠AUC比较，注：**表示与正常组相比差异极显著，P＜0.01。

具体实施方式

[0023] 1、乳酸菌样品来源

[0024] CCFM0528由本实验室菌种保藏库提供，通过16S鉴定为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus CCFM0528，该菌株已于2013年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所），保藏编号为CGMCC No.7317。

[0025] 将CCFM0528菌体在固体MRS中划线，挑单菌落于液体培养基中培养18h，传代2次后用于后续试验。

[0026] 2、CCFM0528对模拟胃液的耐受能力分析

[0027] 将CCFM0528重悬于生理盐水中，按菌液密度109CFU/mL接入到pH3.0的模拟胃[0028] 液中，37℃培养3h，分别在1h,2h,3h计算乳酸菌的存活率，其存活率如图1所示。CCFM0528在模拟胃液中生长3h后，其存活率可达84.2%。

[0029] 3、CCFM0528对模拟肠液耐受能力分析

[0030] 将在模拟胃液中培养3h后的菌液，取1mL加入到9mL pH8.0模拟肠液中，37℃培养8h，分别在2h,4h,8h计算CCFM0528的存活率，其存活率如图2所示。CCFM0528在模拟肠液中生长8h后，其存活率可达85.4%。

[0031] 4、CCFM0528的耐胆盐能力分析

[0032] 将CCFM0528按照2%的接种量分别加入到加和不加0.3%胆盐的MRS-THIO（MRS[0033] 培养基中添加0.2%巯基乙酸钠）培养基中。菌液在37℃中培养，CCFM0528在未加和加有胆盐培养基中生长，OD值达到0.3时所需的时间分别为3.7±0.1h和5.2±0.1h，所以CCFM0528的胆盐延迟时间为1.5h，反应了此乳酸菌对胆盐有很强的耐受性。

[0034] 5、CCFM0528的粘附能力分析

[0035] CCFM0528离心后用PBS洗涤3次，再用DMEM调菌液浓度至109CFU/mL，将菌悬液加入到已培养好的Caco-2单层细胞中，37℃共培养2h，用甲醇固定30min后革兰氏染色。在电镜下观察20个视野100个细胞，计算该乳酸菌的粘附力为12.0±0.2每个细胞。

[0036] 6、CCFM0528发酵上清和无细胞提取物的制备

[0037] 将CCFM0528活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h，培养物经6000r/min，4℃离心l0min，得到培养上清液和菌体沉淀，菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将
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菌体用PBS重新悬浮,调整细胞浓度为10CFU/mL，上清液经0.22μm滤膜过滤后得无细胞上清液（CFS），另一组用于无细胞提取物（CFE）的制备，将细胞悬浮液用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作3s、间隔8s，超声破碎10min，显微镜下检查没有完整菌体，然后以4℃，
12000×g离心20min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤即为无细胞提取物。上清及无细胞提取物经100℃加热20min后，制成热灭活的上清和无细胞提取物。

[0038] 7、CCFM0528对大鼠肠道提取的α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力分析[0039] CCFM0528对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：在150μL PBS（0.1M pH6.8）中加入75μL20mM的4-硝基酚-α-D-吡喃葡葡糖苷（PNPG）溶液及25μL待测样品，将混合物于
37℃水浴10min。加入50μL大鼠肠道提取的α-葡萄糖苷酶溶液(0.17U/mL)继续反应
10min。加入1mL0.1M Na2CO3作为反应终止液。并将反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与4-硝基酚（PNP）的游离量成正比。反应体系中采用pH6.8的0.1M PBS作为α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，采用以下公式计算样品的抑制活性：

[0040] 酶抑制率（%）=[1-(C-D)/(A-B)]×100%

[0041] 其中A为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值

[0042] B为不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值

[0043] C为含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值

[0044] D为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值

[0045] 由图3可知，CCFM0528的上清和无细胞提取液均对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，上清的抑制率（29.2%）大于无细胞提取物的抑制率（14.2%），并且经过灭活后的上清和无细胞提取物对酶的抑制率均大大降低（﹤8.5%），因此可推测是CCFM0528中的某些活性物质对酶活性有抑制作用。

[0046] 8、Transwell细胞模型的建立及评估

[0047] 用于构建Transwell细胞模型的Caco-2细胞为22～40代之间。将细胞按照密5 2
度2×10 个/ml接种于12孔Transwell小室上（膜孔径0.4μm生长面积1.12cm），转运槽肠腔侧（上室，AP侧）加入调好密度的细胞悬液500ul，基地侧（下室，BL侧）加入1.5ml细胞培养液，每天换液，待细胞长至21d时备用。

[0048] 模型的评估：

[0049] （1）扫描电镜验证细胞是否形成致密的单层，结果如图4所示。

[0050] 从图4A中可看出细胞在聚碳酸酯膜上形成了致密的单层，图4B中可看出细胞表面形成良好的刷装缘以及细胞间形成紧密连接，从而形成紧密的细胞单层。

[0051] （2）荧光素钠通透性检测：第21天时，12孔Transwell板中各孔的表观渗透系数-6 2均远远小于0.5x10 cm/s。进一步证明了细胞已形成良好的紧密连接单层。

[0052] （3）碱性磷酸酶AKP极性检测：上层小室的酶活均是底层酶活的4倍以上。培养[0053] 到21天的细胞单层其肠腔侧的碱性磷酸酶活性显著高于基底侧酶活性，约高出4倍之多，说明该标志酶已经大部分集中在刷装缘一侧，细胞单层已经形成了极性。

[0054] 9、CCFM0528对Transwell细胞模型中α-葡萄糖苷酶的抑制作用

[0055] 用PBS冲洗已培养21天的Transwell小室上下面3次（上加0.25ml，下加0.6ml），去除葡萄糖。加入475ul含20mM的麦芽糖（过滤除菌）作为底物，并加入CCFM0528的上清或无细胞提取物25ul（共0.5ml）一起到粘膜层，1.5mlPBS加入到下层，板子在37℃培养2h，上下层各取100μl溶液到微孔板中检测葡萄糖含量，以此分别计算对酶活性的抑制率和葡萄糖转运率的抑制作用。结果分别见图5和图6。

[0056] 由图5可知，CCFM0528细胞提取物对酶的抑制率大于上清的抑制率，而其细胞提取物对大鼠肠道酶活性的抑制率高于上清的抑制率，其大小与此结果不一致，说明在细胞环境和体外的环境还是存在很大的差异，所以结果也并不完全一致，但都表现出对酶活性有一定的抑制作用。

[0057] 如图6所示，CCFM0528的上清和细胞提取物都对Caco-2细胞中的葡萄糖转运有一定的抑制作用，且细胞提取物的抑制率高于上清的抑制率，这与上述CCFM0528对酶活性的抑制率相一致。

[0058] 10、CCFM0528对Caco-2细胞中的S-I，SGLT-1，GLUT-2基因表达量的影响[0059] 碳水化合物的消化与吸收过程中与此相关酶及转运载体主要有α-葡萄糖苷酶（S sucrase-isomaltase，S-I），钠葡萄糖共转运载体1（sodium glucose cotransponers l，SGLT-l）和葡萄糖协助扩散转运载体2（facilitative glucose transporte2，GLUT-2）。将CCFM0528上清及细胞提取物按5%加入到已培养21天的Caco-2单层细胞中与其共培养2h后，用试剂盒提取Caco-2的总RNA并反转录合成cDNA，后进行荧光定量PCR，并选用β-actin作为内参基因。进行荧光定量PCR所用引物序列如表1所示。

[0060] PCR反应条件为：（1）95℃for15min；（2）95℃，10s,64℃，20s，72℃，30s，40个-△△CT循环；（3）72℃，5min；（4）95℃，15s,60℃，15s,95℃，15s。以2 法计算CCFM0528对Caco-2细胞中的S-I，SGLT-1，GLUT-2基因表达量的影响。结果如图7所示。

[0061] 表1荧光定量PCR的寡核苷酸序列

[0062]

[0063] 由图7A可知，CCFM0528上清可显著下调Caco-2细胞中S-I基因的表达量，细胞提取物对S-I基因的表达量无显著性影响。该乳酸菌的上清中含有大量的有机酸，如乳酸，乙酸等。有研究报道乙酸对Caco-2细胞的酶活性有抑制作用，我们研究发现CCFM0528上清中的某些活性物质对大鼠肠道提取的α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，因此可推测CCFM0528的发酵产物中的某些活性物质和有机酸对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，并且可以抑制酶的表达量，从而有效缓解碳水化合物的分解吸收，从源头减少单糖的生成量。

[0064] 由图7B可知，CCFM0528的上清可显著下调Caco-2细胞中SGLT-1的表达量，而细胞提取物可显著上调Caco-2细胞中SGLT-1的表达量。结果与CCFM0528对葡萄糖的转运率抑制相一致。

[0065] 由图7C可知，CCFM0528的上清可显著下调Caco-2细胞中GLUT-2的表达量，细胞提取物对S-I基因的表达量无显著性影响。

[0066] 11、CCFM0528体内预防糖尿病作用的动物实验

[0067] 体内预防糖尿病试验采用高脂饲料喂养加注射链脲霉素（STZ）造成的2型糖尿病模型。实验动物采用SPF级雄性3周龄C57BL/6小鼠24只，由上海斯莱克实验动物有限公提供。小鼠在室温下饲养，自由饮水采食，经1周适应性饲养后，随即分为正常组、模型组和试验组，每组8只。正常组饲喂基础饲料（蛋白含量25.7%，脂肪含量13.8%，碳水化合物60.5%）；模型组和试验组以高脂饲料饲喂（蛋白含量20.0%，脂肪含量40.0%，碳水化合物9
40.0%）；试验组每天灌胃乳酸菌2×10CFU/mL。3周后禁食12h，加低剂量链脲佐菌素100mg/Kg(0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5，0.2μm滤膜过滤)腹腔注射，1周后观察：正常组组小鼠体态正常，行为活跃，毛色光亮，无脱毛，食量与饮水正常，大小便正常。注射STZ造模组小鼠逐渐出现毛色不洁，饮水增加，尿量增加，情绪暴躁，体重减轻等Ⅱ型糖尿病相关症状。
试验期间每周测量体重一次，如图8所示。在给STZ诱导造模后一周，各组小鼠禁食不禁水12h，以血糖仪测定尾静脉血糖值，为空腹血糖值，如图9所示；喂食2h后，再次以血糖仪测定尾静脉血糖值，为餐后2h血糖值，如图10所示。在造模后8天，各组小鼠禁食不禁水(12h)，灌胃2g/kg葡萄糖（50%），并分别测定0min、15min、30min、60min、90min、120min鼠尾静脉血糖值。根据血糖值使用orgin7.5绘制血糖变化曲线，并计算出糖耐量曲线下面积（Area Under Cerve,AUC）如图11和图12所示。

[0068] 如图8所示，在第4周注射STZ后，正常组老鼠体重正常增加，模型组小鼠体重增加不如正常组高，CCFM0528组小鼠体重也增加缓慢。

[0069] 由图9可知，注射STZ一周后检测各模型组和CCFM0528组小鼠的空腹血糖均高于糖尿病的临界值7.0mmol/L,表明糖尿病模型造模成功。模型组的血糖水平远远高于正常组，CCFM0528组的血糖水平虽然高于7.0mmol/L,但其与正常组血糖水平无显著性差异。表明CCFM0528可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平。

[0070] 由图10可知，注射STZ一周后检测各模型组和CCFM0528组小鼠的餐后2h血糖均高于糖尿病的临界值11.0mmol/L,表明糖尿病模型造模成功。从图中可以看出模型组的餐后血糖水平最高，且与正常组差异极显著。乳酸菌组的餐后血糖虽然与正常组差异极显著，但其血糖水平远远低于模型组，表明CCFM0528可以降低糖尿病小鼠的餐后血糖。

[0071] 由图11可知，在灌胃葡萄糖后15min至30min内，各组大鼠血糖均呈上升趋势，正常组变化非常平缓，在2h后基本保持正常水平；模型组和乳酸菌组在30min内显著上升（p<0.01），并达到最高血糖，模型组在2h后依然保持在较高水平，说明葡萄糖耐受能力显著降低（p<0.01），符合Ⅱ型糖尿病糖耐量降低的特征。其中，CCFM0528组小鼠在90min时其血糖水平趋于正常组小鼠血糖。

[0072] 由图12可知，造模一周后各组小鼠的AUC值差异显著，模型组的AUC面积显著大于正常组，乳酸菌组的AUC面积虽与正常组差异显著，但较模型组明显降低。说明CCFM0528对预防组小鼠的糖耐量具有显著改善作用。

[0073] 12、含有Lactobacillus rhamnosus CCFM0528的食物或药物组合物[0074] 应用实施例1：利用CCFM0528制造具有预防糖尿病功能的酸豆奶

[0075] 原料豆浆中加入6%蔗糖，于121℃，灭菌15min，以7%体积百分比的量加入本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM0528，在37℃发酵至滴定酸度为0.7％－0.8％（以乳酸计），[0076] 冷藏至4℃并冷藏保存即得到具有预防糖尿病功能的酸豆奶。

[0077] 应用实施例2：利用CCFM0528制造具有预防糖尿病功能的乳酸菌饮料[0078] 将原料乳（脱脂奶、鲜奶、复原奶等）经100℃，灭菌10min后冷却至4℃，加入本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM0528，使其浓度达到106cfu/ml以上,4℃冷藏保存即得到活菌乳饮料。

[0079] 应用实施例3：利用CCFM0528制造具有预防糖尿病功能的酸奶

[0080] 将原料乳（脱脂奶、鲜奶、复原奶等）经100℃，灭菌10min后冷却至4℃，以3％－5％体积百分比的量加入本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM0528，以及加入可共生的制备酸奶的商业发酵剂如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，37℃混菌发酵至滴定酸度为0.6％－0.7％（以乳酸计），冷藏至4℃并冷藏保存即得到具有预防糖尿病功能的酸奶。