一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、纺织工业中应用新的高温耐碱甘露聚糖酶。本发明的甘露聚糖酶最适pH为5.0，在pH8.0～9.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗胰蛋白酶的能力。

权利要求

1.一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7，其特征在于，编码权利要求1所述的高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7。

3.如权利要求2所述的高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组载体。

5.包含权利要求2所述高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组载体pPIC-Man5XZ7,其特征在于，将碱基序列如SEQ ID NO.5所示的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达载体pPIC-Man5XZ7。

6.包含权利要求2所述高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组菌株。

7.一种制备高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5XZ7。

8.权利要求1所述高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7用于水解甘露聚糖的应用。

9.太瑞斯梭孢壳霉XZ7(Thielavia terrestris)，其特征在于，保藏编号为CGMCC6544。

说明书

一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用。

背景技术

[0002] 植物细胞壁多糖主要由纤维素，半纤维素以及木质素这三大类多糖组成。其中，半纤维素的含量仅次于纤维素，约占植物干重的35%，是自然界中最丰富的可再生的生物质资源。半纤维素主要包括木聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡聚糖等多种多糖组成。甘露聚糖以1,4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。甘露聚糖的结构分析发现，其主链上残基能被葡萄糖取代或半乳糖通过α-1,6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝则称为异甘露聚糖。主要有半乳甘露聚糖（galactomannan），葡萄甘露聚糖（glucomannan），半乳葡萄甘露聚糖（galactoglucomannan）。因此消化甘露聚糖主要是依靠β-甘露聚糖外切酶和甘露糖苷内切酶的协同作用分解为甘露糖。其中包括：β-D-甘露聚糖酶(β-mannanase)，β-甘露糖苷酶(β-mannosidase)，β-葡萄糖苷酶(glucosidase)，α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)和脱乙酰酯化酶(deacytle esterase)等支链酶。

[0003] β-甘露聚糖酶（β-mannanase,EC3.2.1.78）是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，广泛存在于微生物、动物和植物中。蛋白结构分析表明，β-甘露聚糖酶主要属于糖基水解酶家族5和26。糖基水解家族5中包含多种不同来源的糖基水解酶。主要来源于微生物，包括真菌、细菌和放线菌，如已报道真菌中的木霉、青霉、曲霉、酵母和梭孢菌，细菌中的假单胞菌、芽抱杆菌、弧菌，和放线菌中的链霉菌等都是β-甘露聚糖酶的主要类群。由于微生物来源的β-甘露聚糖酶具有很多优点，如酶活性高，热稳定性好以及提取方便，成本低，与动植物来源的β-甘露聚糖酶相比，具有更宽广的温度作用范围、作用pH，底物专一性等显著的特点，因此，微生物来源的β-甘露聚糖酶已在实际生产与基础研究中得到广泛的应用，

[0004] 随着对β-甘露聚糖酶的深入研究，该酶在饲料、造纸、保健食品及生物技术研究等方面均得到了广泛的应用。其中真菌来源的甘露聚糖酶利于下游毕赤酵母外源高效表达，更适用于工业生产。目前，大多数真菌来源的甘露聚糖酶多为中温酸性酶，利于在饲料行业应用。但食品，纺织工业需要高温碱性酶适合其工艺条件。本发明中，来源于太瑞斯梭孢壳霉Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544的甘露聚糖酶Man5XZ7最适pH5.0,在pH9.0下仍具有25.6%的活性，并且在pH3-10具有良好的稳定性；最适温度75℃；并在毕赤酵母表达系统高效分泌表达。由于以上优良性质，Man5XZ7可在需要碱性工艺条件下被使用，具有广阔的应用前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种能高效应用的高温耐碱甘露聚糖酶。

[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述高温耐碱甘露聚糖酶的基因。

[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述高温耐碱甘露聚糖酶的基因工程方法。

[0010] 本发明的另一目的是提供上述高温耐碱甘露聚糖酶的应用。

[0011] 本发明的另一目的是提供太瑞斯梭孢壳霉XZ7。

[0012] 本发明从太瑞斯梭孢壳霉XZ7(Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544)(2012年9月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC6544)中分离得到一种新的高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7。

[0013] 本发明提供了一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0014] SEQ ID NO.1：

[0015] MVRNIVATGLSLLSTAGVFLGGAAAQMPTANGTRFTIDGKTGYFAGTNSYWISFLTNNRDVDLVLDHISSSGLRILRVWGFNDVNRRPSSGTVWFQLLSSSGSQINTGADGLQRLDYVVQSAEKRGVKLIINFVNNWNDYGGMQAYVSAFGGSKESWYTNTRAQDQYKKYIAAVVSRYVNLPAVFAWELANEPRCKGCNTDVIFKWATDISAYIRSLDPKHMITLGDEGFGLPGQTTYPYQYGEGTDFVKNLRIKNLDFGTFHMYPSSWGVPNSFGPGWIRDHAAACKAAGKPCLLEEYGVTSDQCNVERTWQAASREQAANGMAGDLFWQWGDQLSTGQTHNDGHTIYYGSSTATCLVTDHVRAINAM*[0016] 其中，该酶基因编码369个氨基酸，N端25个氨基酸为信号肽序列“MVRNIVATGLSLLSTAGVFLGGAAA”(SEQ ID NO.3)。

[0017] 因此，成熟的高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7的理论分子量为38.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

[0018] QMPTANGTRFTIDGKTGYFAGTNSYWISFLTNNRDVDLVLDHISSSGLRILRVWGFNDVNRRPSSGTVWFQLLSSSGSQINTGADGLQRLDYVVQSAEKRGVKLIINFVNNWNDYGGMQAYVSAFGGSKESWYTNTRAQDQYKKYIAAVVSRYVNLPAVFAWELANEPRCKGCNTDVIFKWATDISAYIRSLDPKHMITLGDEGFGLPGQTTYPYQYGEGTDFVKNLRIKNLDFGTFHMYPSSWGVPNSFGPGWIRDHAAACKAAGKPCLLEEYGVTSDQCNVERTWQAASREQAANGMAGDLFWQWGDQLSTGQTHNDGHTIYYGSSTATCLVTDHVRAINAM*

[0019] 本发明的甘露聚糖酶Man5XZ7同时具有好的热稳定性并在高温下中性和碱性范围内均具有高活性。本发明筛选到Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544所产生的甘露聚糖酶，其最适pH值为5.0，在pH9.0的还维持25%以上的酶活性；最适温度为75℃，在85℃仍具有50％左右的酶活力。

[0020] 本发明提供了编码上述高温耐碱甘露聚糖酶man5XZ7。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

[0021] Atggtcagaaacatcgtggccactgggctcagcctgctctcgacggctggagtttttcttggaggagcagcagcacaaatgcccactgccaacgggacacgcttcaccattgacggcaagacgggctactttgcgggcacaaactcgtactggatcagcttcctcaccaacaacagggacgttgatctcgtcttggaccacatctcgtcctccggcctcaggatcctccgagtgtggggattcaacgacgtcaaccgccgcccctcttcgggcaccgtgtggtttcaactgctctcgtcgtccggttcgcagatcaacaccggcgctgacggtctgcagagactcgactatgtcgtccagtcggccgagaagcgcggggtcaagctgattatcaactttgtcaacaactggaacgactacggcggcatgcaagcctacgtttcggcgtttggcggctccaaggaaagctggtacaccaacacgcgggcccaggaccaatacaagaagtacattgcagccgttgtcagccgctatgtcaacttgcccgccgtctttgcctgggaactggccaacgagccccgctgcaaagggtgcaataccgatgtcattttcaagtgggcaaccgatatctcggcttacatccgcagtctggatcccaaacatatgatcacgctgggtgacgagggattcggcctgccaggacaaaccacttacccttaccaatacggcgagggtaccgacttcgtcaagaacctgcgtatcaaaaatctggatttcggcactttccacatgtatcctagtagctggggcgtgccgaacagctttggtcctggttggatccgcgatcacgccgcagcctgcaaagccgctggcaagccttgtcttctggaggagtatggcgtcacatcggaccagtgcaatgtggagcggacgtggcaggcggcttcacgagagcaagctgccaacgggatggcaggcgacctcttctggcagtggggagaccagctgagcaccgggcagacacacaacgacggccacaccatctactatggatctagcaccgccacgtgtttggtgactgatcacgtcagggctattaacgccatgtaa

[0022] 本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶基因man5XZ7，cDNA全序列分析结果表明，甘露聚糖酶Man5XZ7基因man5XZ7全长1110bp。其中，信号肽的碱基序列为：

[0023] ATGGTCAGAAACATCGTGGCCACTGGGCTCAGCCTGCTCTCGACGGCTGGAGTTTTTCTTGGAGGAGCAGCAGCA(SEQ ID NO.6)。

[0024] 成熟的甘露聚糖酶Man5XZ7的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

[0025] SEQ ID NO.5

[0026] caaatgcccactgccaacgggacacgcttcaccattgacggcaagacgggctactttgcgggcacaaactcgtactggatcagcttcctcaccaacaacagggacgttgatctcgtcttggaccacatctcgtcctccggcctcaggatcctccgagtgtggggattcaacgacgtcaaccgccgcccctcttcgggcaccgtgtggtttcaactgctctcgtcgtccggttcgcagatcaacaccggcgctgacggtctgcagagactcgactatgtcgtccagtcggccgagaagcgcggggtcaagctgattatcaactttgtcaacaactggaacgactacggcggcatgcaagcctacgtttcggcgtttggcggctccaaggaaagctggtacaccaacacgcgggcccaggaccaatacaagaagtacattgcagccgttgtcagccgctatgtcaacttgcccgccgtctttgcctgggaactggccaacgagccccgctgcaaagggtgcaataccgatgtcattttcaagtgggcaaccgatatctcggcttacatccgcagtctggatcccaaacatatgatcacgctgggtgacgagggattcggcctgccaggacaaaccacttacccttaccaatacggcgagggtaccgacttcgtcaagaacctgcgtatcaaaaatctggatttcggcactttccacatgtatcctagtagctggggcgtgccgaacagctttggtcctggttggatccgcgatcacgccgcagcctgcaaagccgctggcaagccttgtcttctggaggagtatggcgtcacatcggaccagtgcaatgtggagcggacgtggcaggcggcttcacgagagcaagctgccaacgggatggcaggcgacctcttctggcagtggggagaccagctgagcaccgggcagacacacaacgacggccacaccatctactatggatctagcaccgccacgtgtttggtgactgatcacgtcagggctattaacgccatgtaa

[0027] 成熟蛋白理论分子量为38.3kDa，将甘露聚糖酶基因man5XZ7序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因是一种新的甘露聚糖酶基因。

[0028] 本发明还提供了包含上述高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组载体，优选为pPIC-man5XZ7。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5XZ7。

[0029] 本发明还提供了包含上述高温耐碱甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/man5XZ7。

[0030] 本发明还提供了一种制备高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7的方法，包括以下步骤：

[0031] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

[0032] 2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；

[0033] 3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5XZ7。

[0034] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Man5XZ7。

[0035] 本发明还提供了上述高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7的应用，例如，碱甘露聚糖酶Man5XZ7用于降解半乳甘露聚糖与葡萄甘露聚糖的应用。

[0036] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、纺织工业中应用新的高温耐碱甘露聚糖酶。本发明的甘露聚糖酶最适pH为5.0，在pH8.0～9.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗胰蛋白酶的能力。此外，Man5XZ7可有效降解各种类型的半乳甘露聚糖与葡萄甘露聚糖等，而不降解木聚糖与微晶纤维素钠，可以有效降解漂白纸浆中的甘露聚糖部分而不影响纤维素。因此，本甘露聚糖酶在工业中的应用也显示出其巨大的潜力。

附图说明

[0037] 图1重组甘露聚糖酶的最适pH。

[0038] 图2重组甘露聚糖酶的pH稳定性。

[0039] 图3重组甘露聚糖酶的最适温度。

[0040] 图4重组甘露聚糖酶的热稳定性。

[0041] 太瑞斯梭孢壳霉XZ7(Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544)(2012年9月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC6544)。

具体实施方式

[0042] 试验材料和试剂

[0043] 1、菌株及载体：本发明分离了太瑞斯梭孢壳霉XZ7(Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544)。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

[0044] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。角豆胶购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

[0045] 3、培养基：

[0046] （1）Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH6.0。

[0047] （2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

[0048] （3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

[0049] （4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

[0050] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0051] 实施例1 Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544产酶特性

[0052] 将来源于广西沙子表层样品经富集培养后（富集培养基：（NH4）2SO45g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，CaCl20.2g/L，玉米芯粉0.5％，麸皮0.5%，pH2.5），按常规稀释后涂布于产酶培养基(（NH4）2SO45g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，CaCl20.2g/L，角豆胶0.5%，1.5%琼脂糖,pH6.0)平板上,45℃培养3～5d,挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌甘露聚糖酶的菌株。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为XZ7。

[0053] 菌体在不同温度的PDA培养基上分别培养5d后,45℃下生长迅速，30℃下生长缓慢,19℃下不生长。菌落圆形，白色，绒毛状,背面颜色奶黄色，后期出现大量小黑点，为子囊果。子囊果深褐色,球形无孔口，易碎，附属丝菌丝状。子囊孢子深褐色,光滑,单细胞,椭圆形,分生孢子梗近垂直,侧生于菌丝体上,有分隔,少见分枝,产孢细胞尖细。分生孢子光滑,无色透明，多倒棒状或瓜子形。经18S rDNA鉴定该菌株为太瑞斯梭孢壳霉，命名Thielavia terrestris XZ7。在以角豆胶为唯一碳源的液体培养基上45℃培养3d，甘露聚糖酶活为4.6U/mL。

[0054] 实施例2 Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544甘露聚糖酶编码基因man5XZ7的克隆

[0055] 提取Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544基因组DNA：

[0056] 将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min，将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下
12000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

[0057] 根据第五家族甘露聚糖酶基因的保守(NNWSDYGG和AWELGNEP)序列设计合成了简并引物P1，P2

[0058] P1:5'-AAYAAYTGGGAYGAYTWYGGNGG-3'；

[0059] P2:5'-GGYTCRYYNSCNARYTCCCANGC-3'。

[0060] 以Thielavia terrestris XZ7CGMCC6544总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃降落45℃（每个循环降落0.5℃）退火30sec，72℃延伸30s，10个循环后接着94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，一共30个循环，72℃保温10min。得到一约176bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

[0061] 根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

[0062] 表1.甘露聚糖酶Man5XZ7TAIL-PCR特异性引物

[0063]

[0064] 通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后Man5XZ7甘露聚糖酶基因全长1247bp。利用RNA提取试剂盒（SV Total RNA Isolation System，Promega)提取液体诱导培养基的菌体的总RNA。通过RT-PCR方法扩增基因的cDNA，经三博生物技术有限公司测序获得其全长cDNA为1110bp,编码369个氨基酸。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端25个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为38.3kDa。

[0065] 实施例3重组木聚糖酶的制备

[0066] 将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码甘露聚糖酶的基因Man5XZ7双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟甘露聚糖酶的基因片（不含信号肽序列）段与表达载体pPIC9连接，获得含有甘露聚糖酶基因man5XZ7的重组质粒pPIC-man5XZ7经Bgl II酶线性后并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man5XZ7。

[0067] 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组甘露聚糖酶的表达量为15.8U/mL。
SDS-PAGE结果表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达，表观分子量为42.0kDa，经EndoH处理后分子量变为38.0左右。重组甘露聚糖的比活为705U/mg。

[0068] 将包含信号肽的甘露聚糖酶的基因Man5XZ7序列与表达载体pPIC9连接，其它试验步骤同上，SDS-PAGE结果表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

[0069] 实施例4 重组甘露聚糖酶的活性分析

[0070] DNS法：具体方法如下：在Ph5.0，50℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

[0071] 实施例5重组甘露聚糖酶Man5XZ7的性质测定

[0072] 将实施例3获得的重组甘露聚糖酶Man5XZ7进行以下性质测定

[0073] 1、重组甘露聚糖酶Man5XZ7的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

[0074] 将实施例3纯化的重组甘露聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物角豆胶用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶Man5XZ7的最适pH为5.0，在pH9.0有25%以上的相对酶活性。甘露聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.0缓冲液体系中75℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明甘露聚糖酶在pH3.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80%以上，这说明此酶在很宽泛pH范围内具有良好的稳定性。

[0075] 2、甘露聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

[0076] 甘露聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在75℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为75℃，并且在85℃仍具有60%左右的酶活。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Man5XZ7有良好的热稳定性，在50℃下温育1h，能保持原有的酶活性。

[0077] 3、甘露聚糖酶的Km值测定方法如下：

[0078] 分别以不同浓度的角豆胶为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其在75℃下的Km值。经测定，以角豆胶为底物时的Km值分别为6.6mg/mL，最大反应速度Vmax为886μmol/min·mg。

[0079] 4、不同金属离子化学试剂对Man5XZ7酶活的影响测定如下：

[0080] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在75℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果表明，多+数离子对酶活性没有影响，而β-巯基乙醇能够提高它1.35倍的酶活力。Ag，SDS(6.3%)
2+
强烈抑制其活性。当Cu 可以部分抑制Man5XZ7酶活力，而相反β-巯基乙醇能够提高它
1.4倍的酶活力。

[0081] 5、甘露聚糖酶抗胰蛋白酶能力测定如下：

[0082] 用pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/甘露聚糖酶（w/w）≈0.1，37℃保温60min取样，在pH5.0及75℃条件下测定酶活性。实验结果表明甘露聚糖酶Man5XZ7用胰蛋白酶处理60min后，胰蛋白酶处理后的Man5XZ7的酶活没有变化。

[0083] 6、重组甘露聚糖酶的底物特异性

[0084] 该酶除可作用于角豆胶外，对于瓜尔豆胶，魔芋粉也有一定的降解作用（表2）。

[0085] 表2.甘露聚糖酶Man5XZ7底物特异性分析

[0086]