小麦寡分蘖QTL、引物对、分子标记、分子标记方法及应用

摘要

本发明公开了小麦新寡分蘖QTL、引物对、分子标记、分子标记方法及应用。检测分析表明，分子标记gpw346能准确跟踪小麦品系H461寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对表型的影响。本发明的主效QTL QLtn.sicau-2D.1及其紧密连锁的分子标记gpw346，不仅提供小麦株型育种的候选基因，而且利用分子标记辅助选择，加强分蘖预测的准确性，提高株型育种的效率，加速实现增加小麦单产的目标。

权利要求

1.一种鉴定小麦寡分蘖主效QTL的分子标记方法，其特征在于,所述QTL位于小麦

2D染色体短臂，距离短臂端粒1.8cM的区段内，显著降低小麦分蘖，LOD值大于3.0，解释约

45％的表型变异；以待鉴定材料的DNA作为模板，用如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出与以小麦H461的基因组DNA为底物进行PCR扩增所得的扩增片段相同片段的植株为含有寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的植株。

2.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以待鉴定材料的DNA作为模板，用如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR扩增：a)PCR扩增反应体系：5μl 10xPCR buffer、1.5U Ex Taq TMDNA聚合酶、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b)PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；c)PCR产物检测：PCR产物用浓度为6％，Acr:Bis＝19:1的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电极缓冲液为1xTBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测；

2)标记引物鉴定QLtn.sicau-2D.1的结果为：能扩增出与以小麦H461的基因组DNA为底物进行PCR所得的扩增片段相同片段的植株为有寡分蘖主效QTLQLtn.sicau-2D.1的植株。

3.分子标记引物对在制备小麦特异分蘖材料中的应用，所述分子标记的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

4.分子标记引物对在分子标记辅助小麦株型育种中的应用，所述分子标记的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

说明书

小麦寡分蘖QTL、引物对、分子标记、分子标记方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于小麦分子育种领域，具体涉及一种小麦新寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1、引物对、分子标记、分子标记方法及应用。

背景技术

[0002] 小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，常年种植面积在2666.67万公顷以上，约占粮食作物面积的27%；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22%。

[0003] 小麦产量由三要素构成，即产量=穗数*穗粒数*粒重。分蘖是影响小麦穗数多少并进而影响单产的重要农艺性状之一，又是单子叶植物一种特殊的分枝现象，具有重要的研究价值。分蘖亦是与小麦对种植环境适应性相关的重要农艺性状。Donald(1968)曾提出，生产潜力最大的理想小麦基因型应当具有叶片直立，大穗，秆矮或独秆，分蘖是多年生草本所遗留的特性，独秆表型对穗子籽粒形成起间接的推动作用。Dofing(1993)等发现独杆品种提供了变更物候发育的几个性状，包括更快的显叶速率、早熟性及更多的同步抽穗特性，这些特性在许多环境下都是促进生产力的重要组成部分。

[0004] 高肥力条件的地域，适于种植高分蘖数的品种，提高单位面积有效穗数，以期达到最大生产潜力。但在地力条件较差的地区、气候湿润的直播麦区（为增强小麦长势，削弱杂草的竞争力，通常会加大播种量，直接导致群体密度过大，无法实现高产）以及干旱地区（品种应满足耗水量低，有机物同化效率高，植株健壮，以及对其他不良环境有较高的耐受性）等这些非理想环境种植，低分蘖品种的茎秆粗壮，抗倒伏能力强，大穗，多小穗数等优势会得以突现，并最终保障作物产量。

[0005] 分蘖的形成过程可分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和伸长。通常在每片叶的叶腋里都能形成一个腋芽，即分蘖芽，但只有位于茎秆基部不伸长节间上的分蘖芽才能够 伸长生长为分蘖；而茎杆上部伸长节间上的腋芽一般不伸长而处于休眠状态（靳文奎，廖平安.小麦分蘖盛期生育指标的研究.小麦研究.2004,25:21-23）。

[0006] 小麦分蘖突变体较少，遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖QTL（quantitative trait locus）的分子标记定位及其遗传效应开展。迄今为止，已报道的分蘖相关主效QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。

[0007] 小麦品系H461（来源于杂交组合SW94-30921×异源2号）相对于品种川农16（国审品种）具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性。进一步研究小麦H461的寡分蘖特性，定位控制分蘖的QTL，寻找紧密连锁的分子标记，将为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，同时利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。

[0008] 分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列（simple sequence repeats，简称SSR）是一类广泛存在于基因组上的由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于其在基因组上大量的分布，多态性高，且操作技术简单、费用低廉，在分子标记辅助育种中已被广泛应用。因此，筛选出与分蘖主效基因/QTL紧密连锁的分子标记，利用分子标记对小麦分蘖主效基因/QTL进行选择，有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，对提高小麦群体质量和产量具有重要意义。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供普通小麦品系H461的寡分蘖QTL QLtn.sicau-2D.1。

[0010] 本发明的另一目的是提供该QTL的紧密连锁分子标记。

[0011] 本发明的第三目的是提供上述分子标记的引物对。

[0012] 本发明的第四目的是提供上述寡分蘖QTL QLtn.sicau-2D.1紧密连锁的分子标记的应用。

[0013] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0014] 本发明的新寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1来自小麦H461，该QTL位于小麦2D染色体短臂，距离短臂端粒1.8cM的区段内（如图1所示），显著降低小麦分蘖，LOD值大于3.0，解释约45%的表型变异。

[0015] 本发明用于鉴定小麦H461新寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的分子标记的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

[0016] 所述分子标记，是以小麦H461的基因组DNA为底物进行的PCR扩增所得的扩增片段，且与QLtn.sicau-2D.1之间的遗传距离为0.8cM。

[0017] 申请人提供一种鉴定寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的分子标记方法，包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用上述的分子标记的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的植株。

[0018] 申请人提供一种鉴定寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的分子标记方法，优选包括如下步骤：

[0019] 1）以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求2所述的分子标记的引物对进行PCR扩增：a）PCR扩增反应体系：5μl10xPCR buffer、1.5U Ex Taq TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；
72℃延伸5min；c）PCR产物检测：PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=19:1）电泳分离，电极缓冲液为1xTBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。

[0020] 2）标记引物鉴定QLtn.sicau-2D.1的结果为：能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的植株。

[0021] 所述的QTL在小麦特异分蘖材料创制中的应用。

[0022] 所述的分子标记引物对在小麦特异分蘖材料创制中的应用。

[0023] 所述的QTL在小麦株型育种中的应用。

[0024] 所述的分子标记引物对在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。

[0025] 本发明小麦H461寡分蘖QTL及其分子标记是通过以下方法获得的：

[0026] 1）利用小麦寡分蘖品系H461为母本，以穗数型小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取180个单株构成F2遗传作图群体。

[0027] 2）F2群体分蘖表型鉴定

[0028] 小麦成熟期田间鉴定F2群体植株的分蘖数。

[0029] 3）SSR分析

[0030] a）DNA提取：用CTAB法提取亲本H461、川农16和F2群体植株DNA。

[0031] b）亲本之间多态性分子标记的筛选：选取GrainGenes（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的615对SSR引物，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得168对多态性SSR分子标记；

[0032] c）F2群体的SSR分析：以上述步骤获得的168对多态性标记为引物，利用每对引物同时扩增亲本H461、川农16和F2群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F2群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。

[0033] d）连锁图谱的构建：根据168对引物的分子标记数据，利用作图软件JoinMap4.0构建遗传图谱。以LOD值3到10依次构建连锁群，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL6.0的区间作图模型（Interval Mapping）和多QTL作图模型（Multiple QTL Model），并结合F2群体分蘖表型数据定位寡分蘖QTL，计算寡分蘖QTL的位置和分子标记之间的遗传距离，发现小麦H461染色体2DS上显著存在一个主效寡分蘖QTL QLtn.sicau-2D.1，解释表型变异约45%，其紧密连锁的分子标记为gpw346，遗传距离为0.8cM。

[0034] 有益效果：

[0035] 本发明首次公开了来自小麦H461的寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1，位于小麦2D染色体短臂，距离短臂端粒1.8cM的区段内（如图1所示），显著降低了小麦分蘖， LOD值大于3.0；贡献率大，可解释约45%的表型变异。该QTL QLtn.sicau-2D.1在小麦株型（调控分蘖）育种中具有较高利用价值。

[0036] 本发明首次公开的小麦H461新寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的分子标记gpw346为共显性标记，用于鉴定植株中是否含有QTL QLtn.sicau-2D.1，检测方便、扩增稳定、简便易行。

[0037] 本发明公开的分子标记gpw346的扩增产物与QLtn.sicau-2D.1之间的遗传距离仅为0.8cM，连锁很紧密，利用分子标记辅助选择QLtn.sicau-2D.1的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定分蘖品种的选择鉴定效率，节约成本。

附图说明

[0038] 图1.小麦H461寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1在2D染色体上的位置及与本发明分子标记之间的连锁遗传图谱。

[0039] 图2.H461*川麦107的F2植株分子标记gpw346检测的电泳图谱；其中1和2分别为H461和川农16，5、8、9、14、17为寡分蘖基因型植株，6、11、15、18、20、21、24为多分蘖基因型植株，3、4、7、10、12、13、16、19、22、23为杂合基因型植株。

具体实施方式

[0040] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0041] 实施例1：本发明小麦H461寡分蘖主效QTL的定位及分子标记的获得

[0042] 1）利用小麦寡分蘖品系H461为母本，以穗数型小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取180个单株构成F2遗传作图群体。

[0043] 2）F2群体分蘖表型鉴定

[0044] 小麦成熟期田间鉴定F2群体植株的分蘖数。

[0045] 3）SSR分析

[0046] a）DNA提取：用CTAB法提取亲本H461、川农16和F2群体植株DNA。

[0047] b）亲本之间多态性分子标记的筛选：选取GrainGenes（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基 因组的615对SSR引物，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得168对多态性SSR分子标记；

[0048] c）F2群体的SSR分析：以上述步骤获得的168对多态性标记为引物，利用每对引物同时扩增亲本H461、川农16和F2群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F2群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。

[0049] d）连锁图谱的构建：根据168对引物的分子标记数据，利用作图软件JoinMap4.0构建遗传图谱。以LOD值3到10依次构建连锁群，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL6.0的区间作图模型（Interval Mapping）和多QTL作图模型（Multiple QTL Model），并结合F2群体分蘖表型数据定位寡分蘖QTL，计算寡分蘖QTL的位置和分子标记之间的遗传距离，发现小麦H461染色体2DS上显著存在一个主效寡分蘖QTL QLtn.sicau-2D.1，解释表型变异约45%，其紧密连锁的分子标记为gpw346，遗传距离为0.8cM。

[0050] 实施例2：本发明分子标记在选择寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1上的应用试验

[0051] 1）利用小麦寡分蘖品系H461为母本，以多分蘖小麦品种川麦107为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取22个单株。

[0052] 2）对所获得的22个F2单株进行gpw346标记检测，具体方法为：在苗期提取22个F2单株的基因组DNA；以基因组DNA为底物，以分子标记gpw346的引物对为引物进行PCR扩增，所述引物为：

[0053] 上游引物：5'–CGACCTTTCCCAATTCACAC–3'，

[0054] 下游引物：5'–TGCTTTTATTCCATCGCACA–3'。

[0055] PCR扩增反应体系：5μl10xPCR buffer、1.5U Ex Taq TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；将所得到的PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=19:1）电泳分离，电极缓冲液为1xTBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。电泳结果（见图2）发现其中5个植株具有H461的gpw346等位位点，预测这5个植株在成熟后分蘖数较低；而7个植株具有川麦107 的gpw346等位位点，预测这7个植株在成熟后分蘖数较高。

[0056] 3）小麦成熟期田间鉴定22个F2植株的分蘖数，结果（见表1）具有H461的gpw346等位位点的植株分蘖数（1-3个）显著低于具有川麦107的gpw346等位位点的植株分蘖数（8-10个）；实际结果与预期结果一致，说明本发明的寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1确实有显著降低分蘖数的作用；同时本发明的分子标记gpw346可以用于选择寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1。

[0057] 表1用小麦H461寡分蘖主效QTL QLtn.sicau-2D.1的分子标记预测衍生后代的分蘖能力对比结果表（Line代表田间的行号）

[0058]

[0059] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。