一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用

摘要

本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物受逆境的条件下诱导表达。还提供了包含该启动子的表达盒、表达载体，及用该表达盒转化植物的方法。并提供了使用本文所公开的逆境诱导表达启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。

权利要求

1.一种分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在水稻中受盐胁迫或干旱胁迫诱导表达，所述分离的DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达盒，其特征是含有权利要求1所述的DNA。

3.权利要求2所述的表达盒，还包括其可操作地连接在权利要求1所述的DNA的下游的核酸，其中所述核酸能够赋予水稻抗逆的性状，所述抗逆的性状是指耐盐性或抗旱性。

4.用权利要求2或3所述的表达盒转化的转基因水稻的生产方法，其包括：(1)构建权利要求2或3所述的表达盒；

(2)将步骤(1)获得的表达盒导入水稻细胞；

(3)再生出转基因水稻；和

(4)选择出转基因水稻；或

(5)增殖步骤(4)获得的水稻以获得后代。

5.赋予水稻耐逆性状的方法，其包括：(1)选择能够赋予水稻耐逆性状的核酸；

(2)使用步骤(1)获得的核酸构建权利要求2或3所述的表达盒；

(3)将步骤(2)获得的表达盒导入水稻细胞；

(4)再生出转基因水稻；和

(5)选择出赋予了水稻耐逆性状的转基因水稻；或(6)增殖步骤(5)获得的水稻以获得后代，其中所述耐逆性状是指耐盐性或抗旱性。

6.一种在水稻中受盐胁迫或者干旱胁迫诱导表达异源核苷酸序列的方法，所述方法包括向水稻中导入特定表达盒，所述特定表达盒含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

说明书

一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域，具体涉及一个植物逆境诱导表达启动子的分离鉴定和应用。

背景技术

[0002] 植物逆境是指对植物的正常生长发育有不利影响的环境因素。研究发现，对植物产生重要影响的逆境主要有干旱、低温、盐碱、高温等非生物逆境，以及病原体侵害等生物逆境。无论非生物逆境还是生物逆境都会造成各种农作物产量和质量的下降，因此，培育和推广抗逆品种是保证作物稳产高产的有效途径。利用植物自身的抗逆基因，通过常规育种和分子标记辅助育种方法可以培育抗逆新品种，然而，抗性基因在种属间的利用具有一定的局限性，而转基因方法可以克服上述局限，为作物抗逆育种开辟一条新的途径。

[0003] 植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5′端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA 聚合酶,使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。

[0004] 外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子（Battraw and Hall，1990; Christensen et al. 1992），然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

[0005] 此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化（Lin et al. 2003; Chen et al. 2006），但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。因此，克服以上转化技术上的困难，就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子，从而可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。

[0006] 尽管许多植物（如，水稻，尤其是Oryza sativa.japonica等）的基因组序列已经被揭示（如可参见GenBank登录号AP003843.3、GenBank登录号AP004670.4等），但是大量基因组序列的功能仍旧未知。

[0007] 为此，本发明人经过长期研究，发现了一个新的逆境诱导型启动子，在植物基因工程改造中具有良好的应用前景。

发明内容

[0008] 本发明内容给出了本发明的一些实施方式，以及在多种情况中给出了这些实施方式的变动和变更。本发明内容只是很多的和不同的实施方式的示例，所提及的给定实施方式示例也是一个或多个代表性的特点。这样一个实施方式通常可以具有或不具有所提及的特点；同样，这些特点也可以被施用于本发明的其他实施方式中。为了避免过多的重复，本发明内容没有罗列或提及这些特点的所有可能的组合。

[0009] 本发明提供了一个植物逆境诱导型启动子的核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。在一些实施方式中，方法包括（a）将基因核苷酸序列可操作地连接于包括序列SEQ ID No：1的启动子KT620P，以产生表达盒；和（b）生成包括该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述基因核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的转基因植物细胞中再生出转基因植物。具体发明内容如下。

[0010] 在第一方面，本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物受逆境的条件下诱导表达。

[0011] 在本文中，这种分离的DNA也可以被称为逆境诱导性启动子，属于顺式作用元件。在逆境诱导性启动子的驱动下，其下游并与其可操作地连接的基因的表达往往在逆境条件下会大幅度提高。在本发明的具体实施方式中，通过肉眼可观测的染色法直接判别本发明的逆境诱导启动子在各种逆境处理条件下的表达。

[0012] 本文中“启动子”一词指DNA调控序列，其中通常含有一个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。

[0013] 在本文中，术语“可操作地连接”指的是一种连接方式，该方式使得连接在下游的核酸的转录和/或表达由本发明的逆境诱导性启动子启始并调控。通常，可操作地连接的核酸是连续的。下游的核酸在保持蛋白翻译读码框的情况下可以间隔少量核苷酸而连接在启动子的下游，接受其调控。

[0014] 在本文中，术语“分离的”DNA指的是DNA从其天然的环境（如植物细胞的基因组）中被分离出来了，或者被化学合成或重组表达出来，并且DNA不含或者基本不含其来源物种的其他核酸、细胞和培养基。本发明的分离的DNA具有较短的核酸序列，优选序列长度小于2000个核苷酸，优选小于1500个核苷酸，更优选小于1200个核苷酸。在本发明的具体实施方式中，本发明的分离的DNA是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的序列。

[0015] DNA还包括DNA还包括具有SEQ ID NO：1所示的序列的DNA的功能等价体，即具有SEQ ID NO：1的变异序列的DNA，其仍旧能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下诱导表达。变异序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1所示的序列DNA杂交的DNA序列。本文中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES（pH6.4）和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

[0016] 变异序列还包括与SEQ ID NO：1所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：
5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

[0017] 变异序列还包括能够保持逆境诱导启动子特性的SEQ ID NO：1所示的序列的片段，例如SEQ ID NO：1中至少150个、200个、300个、500个、800个、直至998个连续核苷酸的DNA序列。

[0018] 本发明中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物（单子叶或双子叶植物等）。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所示启动子序列（或其片段）间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括（但不限于）水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦（Rye）、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦（Spelt）、双粒小麦、亚麻、格兰马草（Gramma grass）、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。

[0019] 在第二方面，本发明提供了表达盒，其包含：

[0020] （a）本发明第一方面的DNA；和

[0021] （b）核酸，其可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游。

[0022] 本发明中所述“表达盒”是指由一个或多个基因及调控其表达的元件所组成，主要含有三种组分：启动子序列、开放阅读框和终止子。表达盒通常是DNA载体用于克隆和转化的组成部分，不同的表达盒在使用正确的调控序列的前提下，可以被转入不同的物种，如细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。在每一个成果的转化体中，表达盒可以通过调控宿主细胞的代谢运行机制来产生相应的目的RNA和蛋白质，实现基因的过表达或表达抑制等调控结果。

[0023] 本发明的表达盒在5’-3’的转录方向上包含本发明第一方面的DNA、可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸、任选的转录和翻译的终止区（如，转录终止元件或多聚腺苷酸化信号）。本发明的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点（例如，来自pBR322或P15A ori的ORI区），土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件（例如，T-DNA的左边界和/或右边界）。本发明表达盒可以包含的其他成分包括，增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等。示例性的增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因、TMV Ω元件和酵母的启动子的增强子元件。也可以采用病毒前导序列来作为具有增强子效用的远见，如来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等。示例性的植物内含子包括来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2的内含子、以及蔗糖合酶内含子。

[0024] 在本文中，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸编码异源蛋白的多核苷酸、编码融合蛋白的多核苷酸、反义序列、编码dsRNA序列的多核苷酸，等等。优选是能够赋予植物有益的性状的核酸，所述性状包括：

[0025] （a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高；

[0026] （b）所述核酸所转录的反义RNA抑制转化植物中同源基因表达产物含量的提高；

[0027] （c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

[0028] （d）抗植物病虫害能力的提高；

[0029] （e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

[0030] （f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

[0031] 相应地，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸可以编码蛋白的基因，如昆虫抗性基因、细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或品质的基因、养分利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、可选择标记物基因、可筛选标记物基因、阴性可选择标记物基因、阳性可选择标记物基因、影响植物农学特征(如产率)的基因、环境胁迫抗性基因(例如，赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐性的基因)、改善淀粉特性或数量、油品数量或品质、氨基酸或蛋白质组成的基因，等等。另外，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸也可以编码dsRNA、反义RNA、siRNA、miRNA，其与其同源的基因多核苷酸序列（如，需要下调表达的植物启动子，寄生植物体生物存活、生长或繁殖所必须的植物基因）互补并导致这些多核苷酸基因表达产物的下调。

[0032] 本发明的表达盒可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

[0033] 在第三方面，本发明提供了含有本发明第二方面的所述表达盒的表达载体。

[0034] 本发明的实施例中DNA构建体含有操作性连接于基因编码序列或核苷酸片段上的启动子，该启动子含有本发明公开的全部序列或部分序列，并可在植物细胞中驱动上述基因编码序列或核苷酸片段进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述DNA构建体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。

[0035] 在第四方面，本发明提供了用本发明第二方面的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞。

[0036] 本发明的具体实施方式已经通过在有代表性的单子叶植物中的有效应用证明了本发明的逆境诱导启动子的植物使用范围，因此本发明的逆境诱导启动子可用于转化任何植物物种，例如来自以下属的植物：苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、小黑麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡芦巴属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属，优选的植物包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，更优选是水稻。

[0037] 本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官（如叶、根、茎等）、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。

[0038] 这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

[0039] 在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的植物的生产方法，其包括：

[0040] （1）构建本发明第二方面的表达盒；

[0041] （2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

[0042] （3）再生出转基因植物；和

[0043] （4）选择出转基因植物，其中本发明第一方面的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下被诱导表达；并且

[0044] （5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

[0045] 发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术（可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第 1 卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等 .Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第 1 卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.128-143，等）。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于实施例中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于实施例中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

[0046] 在第六方面，本发明还提供了赋予植物性状的方法，其包括

[0047] （1）选择能够赋予植物性状的核酸：

[0048] （2）使用步骤（1）获得的核酸构建本发明第二方面的表达盒；

[0049] （3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

[0050] （4）再生出转基因植物；和

[0051] （5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

[0052] （6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

[0053] 其中，所述性状选自下列组：

[0054] （a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高；

[0055] （b）所述核酸所转录的反义RNA抑制转化植物中同源基因表达产物含量的提高；

[0056] （c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

[0057] （d）抗植物病虫害能力的提高；

[0058] （e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

[0059] （f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

[0060] 本文中，“选择”可以是田间或温室选择，也可以是使用遗传标记的遗传选择。在本文中，“增殖”可以有性繁殖，也可以是无性繁殖。在有性繁殖中，显然可以进行额外的杂交步骤，并选择出继承了转基因性状的后代。

[0061] 由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达，优选在经受逆境诱导处理的植物中表达。

[0062] 根据RNA干扰技术（RNA interference，RNAi），操作性连接于本文所公开的KT620P 逆境诱导表达启动子上的异源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链RNA分子。当导入到植物细胞中后，反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源 mRNA 互补，并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。

[0063] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。

附图说明

[0064] 图1 是KT620基因的逆境诱导表达谱。其中KT620基因的序列如SEQ ID No：2所示，长度为2067bp 。KT620为KT620基因的扩增产物；ACTIN为水稻内参基因ACTIN的扩增产物；CK为正常生长对照；D1为干旱处理至叶片微卷时；D2为干旱处理至叶片半卷时；D3为干旱处理至叶片全卷时；S1为盐处理至叶片微卷时；S2为盐处理至叶片半卷时；S3为盐处理至叶片全卷时。

[0065] 图2是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；EcoRI和BamHI分别表示限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点；诱导型启动子即为本发明所分离鉴定的逆境诱导表达启动子。

[0066] 图3是KT620P转基因水稻的组织器官GUS染色。A为水稻愈伤染色；B为T0苗干旱处理后的叶片染色；C为T0苗干旱处理后的根系染色。

[0067] 图4是KT620P转基因水稻T2苗的GUS染色。A：正常生长条件下的水稻幼苗的GUS染色；B：干旱处理后水稻幼苗的GUS染色；C：盐处理后水稻幼苗的GUS染色。

[0068] 图5是KT668(KT620P::AtDREB)干旱处理。A：干旱处理前苗的生长状态；B：干旱处理后苗的生长状态；C：正常生长一周后苗的生长状态；D：干旱处理后的存活率统计。

[0069] 图6是KT668(KT620P::AtDREB)盐处理。A：盐处理前苗的生长状态；B：盐处理后苗的生长状态；C：正常生长一周后苗的生长状态；D：盐处理后的存活率统计。

具体实施方式

[0070] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。

[0071] 1．KT620基因的逆境表达谱分析

[0072] 选取两叶期的水稻中花11材料进行逆境处理。其中干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1（D1）：叶轻微卷，相对含水量（RWC）在90%-95%；期2（D2）：叶半卷，相对含水量（RWC）在80%-85%；期3（D3）：叶完全卷，相对含水量在70%-75%。D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。200mM 高盐处理的材料和样品也分以上三个时期进行收集和保存。

[0073] 分别提取以上各时期干旱和盐处理材料的总RNA，通过反转录得到cDNA，具体反应为：取约2μg的总RNA，加入1μl 10×DNase buffer，1μl的DNase，补DEPC处理过的水至10μl体系，混匀，37℃温育30min后，加入1μl的RQ DNase stop solution,65℃温育10min以终止反应后，加入2μl Oligo(dT)18 primer(0.1μg/μl)， 4μl 5× First-strand buffer，1μl Ribonuclease inhibitor(40U/μl)， 2μl 4×dNTP( 各
10mM)，1μl MMLV Reverse Transcriptase (200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后
70℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA均稀释10倍，作为RT-PCR的扩增模板。

[0074] 其中，KT620基因的RT-PCR检测引物是：

[0075] 引物1：5'AAGATACCACCTGCGAAACC 3'

[0076] 引物2：5' TGCGACGGACATCCAACT 3'

[0077] KT620基因的RT-PCR扩增片段是221bp。引物1的序列如SEQ ID No：3所示，引物2的序列如SEQ ID No：4所示。

[0078] Actin基因的RT-PCR引物：

[0079] 引物3：5’- TGTTCCTGCCATGTATGT -3’

[0080] 引物4：5’- ATGTCCCTCACAATTTCC -3’

[0081] ACTIN基因的RT-PCR扩增片段是252bp。引物3的序列如SEQ ID No：5所示，引物4的序列如SEQ ID No：6所示。

[0082] 以上引物分别以经过上述干旱和200mM盐处理后的水稻幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正常生长的中花11幼苗cDNA，检测这些基因在盐处理和干旱处理中的表达变化，PCR检测体系和程序为：10×buffer ，2μl ；10mM dNTP ，0.4μl ；10 M引物F，0.4μl；10 M引物R，0.4μl；Taq polymerase，0.4μl；cDNA，1μl；ddH2O，15.4μl。

[0083] PCR反应条件为：预变性：95℃,5分钟；变性：94℃，30秒，退火：55℃，30秒，延伸：72℃，2min，28个循环；72℃，10分钟。

[0084] 反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图1，其中：D表示干旱处理；S表示盐处理；字母后的数字1、2和3分别指干旱处理和盐处理的三个程度。KT620 指该基因的扩增产物；Actin指水稻 actin 基因的扩增产物。可见，KT620基因在水稻幼苗中呈干旱和高盐诱导性。

[0085] 2．KT620P启动子的分离和鉴定

[0086] 设计克隆启动子KT620P所需引物：

[0087] 引物5：5'- ggatccGTGCCACTATCGCCCTTGCTACA-3'

[0088] 引物6：5'-gaattcTTTCCTGCGACTTCAGAAGCTCC-3'

[0089] 引物5（序列如SEQ ID No：7所示）中序列ggatcc为BamHI的酶切位点，引物6（序列如SEQ ID No：8所示）中序列gaattc为EcoRI的酶切位点。

[0090] 利用启动子的正反向引物（其中带下划线部分的序列为启动子序列），以植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是： 95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列为预期的KT620P启动子序列。

[0091] 3．构建表达载体

[0092] 将测序验证已经插入KT620P启动子序列的T载体质粒用BamHI和EcoRI 双酶切，连入同样用BamHI和EcoRI 双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-KT620P。

[0093] 菌落PCR检测所需引物：

[0094] 引物7：5'- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3'

[0095] 引物8：5'- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3'

[0096] 引物7（序列如SEQ ID No：9所示）和引物8（序列如SEQ ID No：10所示）为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环；72℃延伸10分钟。

[0097] 所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图2所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因（序列如SEQ ID No：11所示）；T35S表示35S基因的终止子；EcoRI和BamHI分别表示内切EcoRI和BamHI的酶切位点；诱导启动子即为本发明所述的启动子。

[0098] 4．农杆菌共转化

[0099] 利用热激法将质粒pHPG-KT620P转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化。

[0100] 5．启动子功能鉴定

[0101] 将转基因植株进行干旱和200mM盐处理后，进行GUS活性检测，将处理过的材料置于含有GUS染色缓冲液的EP管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

[0102] 将转基因T0苗置于空气中进行干旱处理后，剪取叶片和根等组织器官进行染色，结果如图3C所示，干旱处理后，叶片的染色程度加深，其中CK为正常生长的苗染色结果，Drought为干旱处理的苗染色结果。

[0103] 将转基因T2苗进行干旱和200mM NaCl处理后，剪取叶片、茎和根等组织器官进行染色，结果如图4所示，其中CK为正常生长的苗染色结果，salt为盐处理后的染色结果。从图中可以清楚看出，经过干旱和盐处理后，叶片、茎和根的染色程度明显加深。

[0104] 6．KT668(KT620P::AtDREB1A)转基因T1代植株的耐旱性分析

[0105] 收获KT668 T1代转基因水稻种子，选取5个系进行干旱胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT668 的T1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期时（第3片叶完全舒展），进行急性干旱处理。旱筛前将苗根部洗净，选生长状态（粗细、株高）一致的苗（图5A），用吸水纸将根部水吸干，放入干燥的新三角瓶中。每瓶详细记录干旱起始时间，筛选至对照茎秆部分九成干或以上。旱筛过程大约9个小时左右（视表型而定），然后复水，三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。干旱处理后的苗生长状态如图5B所示，复水正常培养一周后苗恢复状态如图5C所示。最后统计各株系的苗存活率，如图5D的柱形图所示，CK的存活率为16.7%，而转KT620::AtDREB基因的株系的存活率均在70%及以上，存活率远高于对照。

[0106] 此实验说明KT668具有增强水稻耐旱性的作用，KT620P具有逆境诱导的作用。

[0107] 7.KT668(KT620P::AtDREB1A)转基因T1代植株的耐盐性分析

[0108] 收获KT668 T1代转基因水稻种子，选取5个系进行盐胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT668 的T1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶
15株，三个重复。培养至三叶期（第3片叶完全舒展），其生长状态如图6A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时（图6B），洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。一周后照相（图6C），统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图6D（横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比）。实验结果显示，T1代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，KT668转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，转空载体的中花11对照（CK）植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡（图6C）。

[0109] 此实验说明KT668具有增强水稻耐盐性的作用，KT620P具有逆境诱导的作用。