含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体

摘要

本发明公开了含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，利用重组DNA技术将拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白基因融合，构建了融合基因表达质粒表达载体pOBTcol，转化至油料作物中，表达了融合蛋白，获得含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，操作简单、成本低廉、表达量高，含有油体蛋白与重组胶原蛋白肽融合蛋白的油体，具有较高的胶原蛋白活性，能直接应用于外用药物及其化妆品的生产，降低了生产成本，省略了胶原蛋白肽提纯及胶原蛋白肽与乳化剂（或保护剂）混合过程，油体和融合蛋白一体更好地保护重组胶原蛋白。

权利要求

1.一种融合蛋白基因，它是由拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白基因融合而成，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

2.一种融合蛋白，它是由其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因表达的蛋白。

3.一种表达载体pOBTcol，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，利用kpnI和SpeI酶切位点,将35S-Bar基因插入到T-DNA区NOS基因前，获得p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简称：pO；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体pOBTcol。

4.含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，它是由下述方法制备的：将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物表达载体中，获得的表达质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体。

5.根据权利要求4所述的含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，其特征在于：所述的表达质粒是权利要求3所述的一种表达载体pOBTcol。

说明书

含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白融合蛋白及含该融合蛋白的油体。

背景技术

[0002] 胶原是生物体内一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25%~33%。胶原蛋白因其优良的生物学特性而广泛地应用于生物医用材料领域。因此，如何进行高纯度、高产率的提取具有生物活性的胶原蛋白一直是广大研究者关注的课题。胶原蛋白的类型较多，已经发现有26种，分布于皮肤、肌腱等组织中，其中，皮肤中约85%的胶原蛋白属于IV型，IV型胶原是含量最多研究最透彻的胶原，占生物体胶原总量的90%左右。IV型胶原一般为白色、透明、无分支的原纤维，是由两条相同的α1(IV)链和一条α2(IV)链组成的异质胶原(Heterotypic Collagen)。α1(IV)和α2(IV)肽链的螺旋区含有338个(Gly-X-Y)重复序列，X常为脯氨酸，Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸。因此，甘氨酸约占1/3，脯氨酸和羟脯氨酸占1/5以上，还有大量的羟赖氨酸和丙氨酸。α链中吡咯环的存在使N-C键不能自由旋转，构成左手螺旋，螺距为0.87 nm，每转一圈约有3.3个氨基酸残基。三条α链依靠侧链残基相连，最小氨基酸甘氨酸残基位于三股螺旋内侧，螺距为96nm，每圈有36个氨基酸残基，形成了原胶原(tropo collagen)分子特有的三股螺旋结构。

[0003] 胶原蛋白在很多方面都具有生物学功能，包括：（1）胶原蛋白能保护皮肤，提高皮肤的弹性，胶原蛋白在调节表皮更新再生中发挥重要的作用，胶原蛋白可促进细胞粘附和细胞增殖；（2）胶原蛋白具有止血性能；（3）胶原蛋白具有很低的免疫原性；（4）胶原蛋白作为细胞生长的依附和支架物，能诱导上皮细胞等增殖、分化和移行；（5）胶原蛋白由三螺旋结构的胶原纤维构成。作为细胞外基质的骨架，具有易吸收、易同化等特点，因此具有良好的生物相容性。

[0004] 胶原蛋白结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了其在许多领域的重要地位以及良好的应用前景。

[0005] （一）在食品方面的应用

[0006] 胶原蛋白本身就可以作为一种食品，食用胶原蛋白一般来源于动物的真皮、肌腱和骨胶原，其外观通常为白色，口感柔和，味道清淡，易消化。但多数情况下胶原蛋白在食品中会被用作功能物质或营养成分。

[0007] （二）在化妆品方面的应用

[0008] 胶原蛋白具有保湿作用、修复皮肤、美白和润泽头发等作用，使胶原蛋白的这些美容作用，已经广泛应用于化妆品中。

[0009] （三）在生物医学领域中的应用

[0010] 低免疫抗原性、生物相容性、止血作用和可生物降解性是胶原蛋白作为生物医学材料的优势所在。近年来，英美等国采用注射性胶原来整复面部软组织的各种损伤。我国研制的胶原注射剂已广泛应用于美容界，在延缓皮肤衰老、重建受损肌肤等方面取得了良好的效果，是一种理想的医用材料。

[0011] （四）在造纸工业中的应用

[0012] 作为原料的应用:胶原纤维分子中含有大量的羧基、氨基、羟基，而纤维素中也含有大量羟基和少量羧基，正是由于这两种天然高分子中含有许多的活性基团和活性部位，可通过化学或物理的方法制成复合材料，用于制造书面革、膜塑包装材料、壁纸、生活用纸、遮光纸、农副产品包装材料、生物胶原包装纸、复合生物降解材料等。

[0013] 油体作为乳化剂。在生产食品、饲料、药物、个人护理产品和工业产品等中得到广泛的应用。与来自矿物的乳化剂相比，更加环保和可再生。油体蛋白是油体中主要的膜蛋白。油体蛋白存在2-4个亚型。它们在种子发育过程中可呈现出不同的表型，并且伴随着种子的萌发而发生变化。油体蛋白是碱性的疏水蛋白，三个部分组成油体蛋白：亲脂的C端和N端 ，和中间疏水区域，它是通过磷脂膜进入到油体内部。N端和C端则镶嵌在油体表面，暴露在细胞质中。油体蛋白的结构以及它的特异性，使油体在生物技术中得到广泛的应用。

发明内容

[0014] 本发明的目的是提供一种拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白肽的融合基因及其表达的蛋白。

[0015] 一种融合蛋白基因，它是由拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白基因融合而成，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示；

[0016] 一种融合蛋白，它是由上述基因表达的蛋白；

[0017] 一种表达载体pOBTcol，它是由下述方法制备的：

[0018] 1）以p1301为基本骨架，利用kpnI和SpeI酶切位点,将35S-Bar基因， T-DNA区NOS基因前，获得p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简称：pO；

[0019] 2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

[0020] 3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

[0021] 4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体pOBTcol。

[0022] 含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，它是由下述方法制备的：将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物表达载体中，获得的表达质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体。

[0023] 所述的表达质粒是一种表达载体pOBTcol。

[0024] 本发明提供了含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，本发明人根据植物偏好性改造了重组胶原蛋白基因，利用重组DNA技术将拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白基因融合，插入以p1301为基本骨架改造的植物特异表达载体pOBT，拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白融合基因表达质粒表达载体pOBTcol，转化至油料作物中，表达了融合蛋白，获得了含油体蛋白与胶原蛋白融合蛋白的油体，从而使融合蛋白表达量大大提高。含有油体蛋白与重组胶原蛋白肽融合蛋白的油体，具有较高的胶原蛋白活性，省略了胶原蛋白的提纯过程，以及胶原蛋白肽与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。可以直接应用于外用制剂及其化妆品的开发，油体和融合蛋白为一体，可以更好地保护重组胶原蛋白肽，类似PEG修饰的作用，直接将含有重组胶原蛋白肽的油体应用于化妆品、头发护理等产品中，同时，还可以直接携带重组胶原蛋白肽直接作用于患处，更好的发挥外用药物的效果。油体还可以作为乳化剂，含有重组胶原蛋白肽的油体可以用于治疗皮肤病类药物和口服药中的成分，促进重组胶原蛋白肽的吸收。

[0025] 用本方法生产重组胶原蛋白肽的方法具有操作简单、成本低廉、表达量高等特点；在纯化阶段，由于油体蛋白与重组胶原蛋白肽相偶联表达，所以通过不同浓度梯度离心的方法可以出去95%以上的杂蛋白，净化融合蛋白。

附图说明

[0026] 图1 菜豆启动子的核酸电泳图；

[0027] 图2 菜豆终止子的核酸电泳图；

[0028] 图3植物油体表达载体构建pOBT示意图；

[0029] 图4 含有重组胶原蛋白基因的植物油体表达载体pOBTcol示意图；

[0030] 图5重组胶原蛋白肽的SDS-PAGE检测图。

具体实施方式

[0031] 实施例1：重组胶原蛋白肽基因col的合成

[0032] 首先根据植物密码子的偏好性对从GENBANK中找到的胶原蛋白肽的核苷酸序列进行改造，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成重组胶原蛋白肽基因（SEQ ID NO.1）。

[0033] 实施例2：克隆菜豆种子特异启动子与终止子

[0034] 为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚酶链式反应（PCR），从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段（如图1和图2），扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2和3所示。

[0035] 菜豆启动子引物

[0036] Primer5F: GAATTCATTGTACTCCCAG

[0037] Primer5R：AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG

[0038] 菜豆终止子引物

[0039] tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC

[0040] tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA

[0041] 实施例3：构建植物特异表达载体pOBT

[0042] 将pUC57-菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶pstI和NcoI消化，回收目的片段菜豆启动子序列，同时用pstI和NcoI消化基本质粒pO（以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒，），将菜豆启动子（用来启动油体蛋白与胶原蛋白的融合基因）与基本质粒pO连接，转化大肠杆菌，获得pOB中间载体；将pUC57-终止子的克隆载体用HindIII和kpnI消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化pOB中间载体，将终止子与酶切后的pOB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物特异表达载体pOBT（见图4）。

[0043] 实施例4：拟南芥油体蛋白基因的克隆

[0044] 取拟南芥种子，提取DNA基因组，用引物：

[0045] 1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

[0046] 2：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG

[0047] 进行扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；扩增的片段经限制性内切酶（NcoI酶和EcoRI酶）消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。

[0048] 实施例5：构建含有拟南芥油体蛋白与重组胶原蛋白肽融合基因的植物油体特异表达载体pOBTcol

[0049] 以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和重组胶原蛋肽基因为模板，设计融合基因引物，通过融合PCR技术，获得oleosin-col融合基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。将融合基因用限制性内切酶NcoI与HindIII进行酶切，同时用这两个酶对pOBT载体进行酶切，然后将融合基因与酶切后的pOBT载体连接，转化大肠杆菌，产生pOBTcol植物油体表达载体。

[0050] 拟南芥油体蛋白与col融合基因引物

[0051] 1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

[0052] 2：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG

[0053] 3：CCAGCACACTACTCCACCCGGT

[0054] 4：CCCAAGCTTCCACCGGC

[0055] 实施例6：pOBTcol质粒转化农杆菌EHA105

[0056] (1)取100μL农杆菌EHA105感受态细胞置于冰浴中10min使其融化备用。 (2)取1μLpOBTcol质粒加入到农杆菌感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打，使其混合均[0057] 匀，冰浴30分钟。 (3)冰浴后立即将其置于液氮中冷冻5min，立刻取出放入37℃热击5min。 (4)加1mL不含抗性YEP液体培养基至离心管中，28℃，180rpm/min摇菌4h。 (5)使用离心机5000rpm，离心5min，弃上清，加入100μLYEP培养基重悬。

[0058] (6)将重悬液涂布于含三抗（100 μg/mLRif Str、50 μg/mLKan和50μg/mL))的YEP固体培养基平板内，在28℃恒温箱内培养2~3天。

[0059] 利用该方法把pOBTcol转化到农杆菌感受态中，挑取单菌落进行液体震荡培养，经行菌液PCR筛选转化子，经鉴定为阳性的菌液即为含目的基因pOBTcol的农杆菌工程菌菌株。用70%甘油保种阳性菌株，-80℃冰箱保存。

[0060] 实施例7：Flori dip方法进行的遗传转化

[0061] 首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至50ml含有三抗（100 μg/ml Rif、50 μg/ml Str和50 μg/ml Kan)的YEP液体培养基中，进行预培养（180rpm/min，28℃）；取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养基中，进行扩大培养，直至OD5900=1.0~1.2；把农杆菌菌液移到离心管中，20℃，4000rpm离心20min，收集菌体，去除三抗培养基。用Floral-Dip Buffer重悬菌体，使其OD590达到0.8~0.9。转化前剪掉种荚、开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置7分钟，然后吸弃过多的菌液。平放转化后的钵体，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种子。

[0062] 实施例8：农杆菌介导的遗传转化

[0063] 取1μg pOBTcol质粒DNA加入到100微升EHA105感受态细胞中，轻轻混匀冰浴放置5min；然后置于液氮中冷冻5min后迅速转至37℃水浴中温育5min，加入1mlLB液体培养基，在28℃摇床上180rpm振荡培养4h，取适量菌液涂布到含有链霉素和卡那霉素的LB固体培养上，置28℃培养24h，经抗性筛选、PCR检测阳性单菌落。

[0064] 从平板上挑取含有pOBTcol质粒的农杆菌单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50mlLB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养至OD600为0.8，然后离心重悬，悬浮液OD=0.6即可。

[0065] 将红花、油菜、大豆、花生等植物子叶节在重悬液中侵染10min，放在含有合适激素的培养基上培养，然后转到含有0.5%basta和250mg/L头孢霉素的筛选培养基上培养，大约30d后可见抗性芽出现，待抗性芽伸长到2cm后，转入生根培养基中。

[0066] 实施例9：转基因植株的PCR检测

[0067] 提取转基因植株的基因组DNA，以基因组为模板，用拟南芥油体蛋白与col融合基因引物：

[0068] 1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

[0069] 4：CCCAAGCTTCCACCGGC

[0070] 扩增拟南芥油体蛋白和col基因融合基因片段，扩增出预期的目的条带。

[0071] 实施例10：筛选表达量高的转基因株系

[0072] 转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因T1代种子，当T1代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与col的融合蛋白，采用ELISA法，按照胶原蛋白IV型ElISA试剂盒（上海拜力生物科技有限公司）说明书操作，检测重组胶原蛋白肽的表达量，以p13900Rcol为对照，筛选出高表达的转基因株系。结果表明，本发明构建的pOBTcol重组载体经农杆菌介导转化的红花、油菜、大豆、花生植株与p13900Rcol经农杆菌介导转化的植株相比，表达量明显提高，如下表所示。

[0073]pOBTcol(pg/ml) p13900Rcol(pg/ml)
红花2366.7±30.4 2213.4±29.7
油菜2422.8±29.7 2197.8±28.9
大豆2198.3±28.1 2016.5±30.3
花生2226.9±29.5 2086.1±27.5

[0074] 实施例11：含有oleosin-col融合蛋白的转基因种子油体提取及SDS-PAGE检测[0075] （1）取200~1000mg转基因种子， 放入研钵中，加入1ml Buffer A，用研棒充分研磨。直至溶液变浑浊，看不见种粒。放入离心机12000rpm ，4℃，离心10min；

[0076] （2）离心后溶液分为三层，即表层为白色油状层，中间层液体，和底层沉淀。将上层油体部分和液体部分混合均匀，全部吸出，注意不要吸出底层沉淀，将吸出的液体转移至另一离心管中，加Buffer A，离心12000rpm，4℃，10min，重复1、2步骤，3~4次。

[0077] （3）将重复1、2步骤离心后吸出的液体加500µl的Buffer B混匀，在离心机中4℃， 12000rpm，离心10min。

[0078] （4）此时离心后分为两层，为上层油脂部分和下层液体部分，将下层液体吸出，弃掉。再重复3、4步骤，3~4次。

[0079] （5）往含有油脂部分的EP管内，加入40µl Buffer B和10µl上样缓冲液，混均，沸水中煮10min，取15µl用12%的SDS-PAGE做鉴定，见图5。从图5中可见转基因植株在26kDa左右位置出现特异条带，并且野生型在该处没有条带。进一步证明了Oleosin与col融合蛋白已经在拟南芥种子中得到表达。

[0080] Buffer A：0.4M Sucrose，0.5M NaCl，0.05M Tris-HCl(pH=8.0)；

[0081] Buffer B：20 mM Na2HPO4，20 mM NaCl(pH=8.0)。

[0082] 实施例12：含有oleosin-col融合蛋白的油体活性检测

[0083] 用MTT法测定含有oleosin-col融合蛋白的油体、野生型油体和阳性对照标准college蛋白对Balb/c 3T3细胞的促分裂活性。结果表明，含有融合蛋白的油体ED50为1.4ng/ml，野生型油体的ED50为0.32ng/ml，阳性对照标准college的ED50为1.8 ng/ml。