柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的BM-EF1-α片段及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及柑橘大实蝇内参基因BM-EF1-α片段及其应用，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所获得的柑橘大实蝇BM-EF1-α的224bp的核苷酸序列可作为今后研究柑橘大实蝇的功能基因及在不同发育时期基因表达的内参基因。

权利要求

1.BM-EF1-α基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用，其中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的BM-EF1-α基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用，其特征在于，PCR扩增BM-EF1-α基因片段的引物为：BM-EF1-αF1：5′-GGTGTCAACAAGATGGATTC-3′；和BM-EF1-αR1：5′-CCTTCAGCATTACCTTCCTT-3′。

3.一种柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因BM-EF1-α，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

说明书

柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的BM-EF1-α片段及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因BM-EF1-α片段及其应用。

背景技术

[0002] 内参基因(Endogenous references gene)即内部参照，是指在某个条件下恒定表达的基因，作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物。许多常用内参基因在生物体各类细胞中均有表达，它们是在维持和调控细胞基本生命活动中具有重要的意义。但在一些研究中，发现并非所有常用的内参基因在任何情况下均能稳定表达，在特定条件下，一些内参基因的表达容易变化。因此，在选择使用一个内参基因时，验证其在特定实验条件下是否持续稳定表达是其应用的前提保障。

[0003] 柑橘大实蝇(Bactrocera(Tetradacus)Minax)俗称柑蛆，属节肢动物门，昆虫纲，双翅目，实蝇科，离腹寡毛实蝇属，是危害柑橘类果树的一种重要检疫性害虫。柑橘大实蝇起源于日本九州硫球群岛的奄美大岛，上世纪六七十年代在我国首次发现，现已广泛分布于四川、重庆、湖北、贵州、云南、陕西、广西、广东、湖南等省(区)市。柑橘大实蝇属于全变态类昆虫，其完成一个生命周期需要经过卵、幼虫、蛹及成虫四种虫态。柑橘大实蝇一年仅发生1代，每年4月下旬越冬代成虫羽化出土，6月上旬到7月中旬为成虫产卵时期，7月中旬-9月上旬卵陆续孵化，幼虫成群取食橘瓣，至10月中、下旬老熟幼虫入土化蛹、越冬。

[0004] 本发明选取的BM-EF1-α(α-延伸因子)内参基因，通过半定量RT-PCR技术检测表明其在卵、幼虫、处于滞育状态下的蛹(1天蛹、90天蛹、160天蛹)、雌成虫和雄成虫等不同虫态下均能稳定表达，为深入开展柑橘大实蝇生命活动相关的功能基因及不同发育阶段表达水平等研究奠定基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供BM-EF1-α基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用，其中，所述BM-EF1-α基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

[0006] GGTGTCAACAAGATGGATTCGTCTGAACCACCATACAGCGAAGCTCGTTATGAGGAAATCAAGAAGGAAGTATCCTCATATATCAAGAAGATCGGTTACAATCCAATTGCTGTTTCCTTCGTGCCAATCTCTGGCTGGCATGGGGATAACATGTTGGAACCATCCACCAACATGCCATGGTTCAAGGGTTGGAAGGTCGAACGTAAGGAAGGTAATGCTGAAGG。

[0007] 根据本发明的具体实施方式，在检测上述BM-EF1-α基因片段是否作为内参基因在不同发育时期稳定表达时，使用引物：

[0008] BM-EF1-αF1：5′-GGTGTCAACAAGATGGATTC-3′；和

[0009] BM-EF1-αR1：5′-CCTTCAGCATTACCTTCCTT-3′。

[0010] 根据本发明的具体实施方式，柑橘大实蝇BM-EF1-α基因224bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

[0011] (1)从柑橘大实蝇成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA：

[0012] (2)设计引物：

[0013] (3)以cDNA为模板，利用(2)所设引物，PCR扩增柑橘大实蝇EF1-α内参基因的核苷酸序列片段；

[0014] (4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Transl-T，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含EF1-α片段的阳性克隆子；

[0015] (5)将(4)所获得的阳性克隆子进行序列测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为柑橘大实蝇的EF1-α片段序列。

[0016] 因此本发明提供了柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因片段BM-EF1-α，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0017] 本发明所获得的柑橘大实蝇BM-EF1-α的224bp的核苷酸序列可作为今后研究柑橘大实蝇的功能基因及在不同发育时期基因表达的内参基因。

附图说明

[0018] 图1BM-EF1-α内参基因在柑橘大实蝇不同时期的表达状况；

[0019] 图2BM-EF1-α在柑橘大实蝇不同时期的相对表达量。

具体实施方式

[0020] 实施例1：柑橘大实蝇内参基因BM-EF1-α在不同发育时期的表达分析[0021] 1、不同发育时期的柑橘大实蝇总RNA提取：

[0022] 取柑橘大实蝇卵30头、幼虫/蛹(1天、90天、160天)/成虫(雌雄)各一头放入1.5mL的离心管，加入足量的液氮利用研磨棒将其研成粉末；向研磨成粉末的离心管内加入1mL Trizol，充分振荡混匀，室温放置5min；静置后加入0.2mL的氯仿，充分振荡混匀15s，室温放置5min，在4℃条件下12000转离心15min；吸取上清液于另一EP管，加入0.2mL氯仿，充分振荡混匀15s，室温放置5min，在4℃条件下12000转离心15min；取上清液于另一EP管中加入等体积的异丙醇，振荡混匀，室温放置10min，4℃条件下12000转离心
15min；弃上清液，加入1mL75%的乙醇，在4℃条件下12000转离心10min；弃上清液，加入
1mL75%的乙醇，在4℃条件下12000转离心10min；弃上清液，并在超净工作台放置5min，加入50μL的DEPC处理水，在55-60℃水中5min使RNA沉淀充分溶解，-80℃保存以备用。

[0023] 2、柑橘大实蝇cDNA合成：

[0024] (1)在0.2mL的PCR管中依次加入以下试剂：

[0025]

[0026] (2)轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃加热5min失活TransScriptTM RT与gDNARemover。反应结束后储存于-20℃以备用。

[0027] 3、柑橘大实蝇内参基因BM-EF1-α引物合成：

[0028] BM-EF1-αF1：5′-GGTGTCAACAAGATGGATTC-3′；

[0029] BM-EF1-αR1：5′-CCTTCAGCATTACCTTCCTT-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0030] 4、半定量RT-PCR扩增反应：

[0031] 反应体系为20μL：10×PCR reaction buffer2μL、dNTP Mix(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(2.5U)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.8μL、cDNA模板0.4μL、灭菌ddH2O15.2μL。

[0032] 5、半定量RT-PCR扩增程序：

[0033] 反应条件为：94°C预变性5min；然后进行35个循环：94°C30sec，58°C30sec，72°C1min；最后72°C延伸5min。

[0034] 6、半定量RT-PCR结果检测分析：

[0035] 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，BM-EF1-α基因在柑橘大实蝇不同时期的表达状况如图1；然后利用Image Lab3.0和SPSS软件分析表明BM-EF1-α内参基因在不同发育时期能稳定表达，差异不显著(P>0.05)如图2，说明该基因能用于今后研究柑橘大实蝇功能基因及不同发育时期基因表达的内参基因。