肺炎支原体检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种肺炎支原体检测试剂盒，包括基于环介导等温扩增技术设计的外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环状引物，其序列分别如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.5所示，本试剂盒所采用的引物特异性好，准确性高，灵敏度高，操作简单，可以用于肺炎支原体肺炎的快速检测，为临床的早期诊断和治疗提供保证。

权利要求

1.一种肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体检测试剂盒包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环状引物，所述引物序列如下：外引物F3：

5’TTGGTGGAAAACACGGCC3’；

外引物B3：

5’GTTGAGTGGGCTGGCATTA3’；

内引物FIP：

5’CCTTTCATCCCACTCACGGGGATGGCTTGTTTACCCTGCTC3’；

内引物BIP：

5’AAGTGCAAACGACTTACCCGGTTAAGGAGGCAATTTTGGCGG3’；

环状引物LOOP：

5’CAAGTCCGACCAAAAGGCC3’。

2.如权利要求1所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于：所述外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环状引物是基于环介导等温扩增技术设计的。

说明书

肺炎支原体检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种基于环介导等温扩增技术设计的肺炎支原体检测试剂盒。

背景技术

[0002] 肺炎支原体日益成为社区获得性肺炎的主要感染病原体，约占致病病原体的30-40%，爆发流行时甚至能达到60%。如确诊为肺炎支原体肺炎，需要给与大环内酯类抗生素治疗，所以在感染初期进行明确诊断就显得尤为重要。

[0003] 目前，肺炎支原体感染的检测诊断方法，除了咳嗽、发热等临床症状，拍胸片，末梢血和CRP检测外，主要有从呼吸道样本进行分离培养，血清抗体效价检测等方法。分离培养法虽然是金标准，但是需要特殊的实验室设备和人员，耗时长，需要一周以上，血清抗体检测中抗体水平上升也需要时间，这两种方法都不能做到初期快速诊断。巢式PCR（nested PCR）技术是近几年来应用最普遍的肺炎支原体检测方法之一，虽然敏感性和特异性较高，但是也存在操作繁琐，效率低等缺点。

[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是近十几年来发展起来的一种新的核酸扩增技术，只需要在60-65℃的恒温条件下60分钟即可完成扩增反应，不需要热循环，肉眼即可观察结果。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性。该方法不仅克服了传统PCR方法检测的不足，并且具有直观，重复性好，特异性强，敏感性高，不易污染和易于操作等特点。

[0005] LAMP的高特异性和高敏感性是通过特殊的引物设计来实现的。LAMP用的引物由内，外引物构成，识别模板的六个不同区域，另外还会有环状引物用来加强扩增反应。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于环介导等温扩增技术的肺炎支原体检测试剂盒。

[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种肺炎支原体检测试剂盒，包括基于环介导等温扩增技术设计的外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环状引物，所述引物序列如下：

[0008] 外引物F3：

[0009] 5’TTGGTGGAAAACACGGCC3’（如SEQ ID NO.1所示）；

[0010] 外引物B3：

[0011] 5’GTTGAGTGGGCTGGCATTA3’（如SEQ ID NO.2所示）；

[0012] 内引物FIP：

[0013] 5’CCTTTCATCCCACTCACGGGGATGGCTTGTTTACCCTGCTC3’（如SEQ ID NO.3所示）；

[0014] 内引物BIP：

[0015] 5’AAGTGCAAACGACTTACCCGGTTAAGGAGGCAATTTTGGCGG3’（如SEQ ID NO.4所示）；

[0016] 环状引物LOOP：

[0017] 5’CAAGTCCGACCAAAAGGCC3’（如SEQ ID NO.5所示）。

[0018] 本发明所提供的检测试剂盒针对肺炎支原体标准株，采用了用于环介导恒温扩增反应的特异性引物，并进行了特异性和敏感性，以及临床标本的检测，证明该引物特异性好，准确性高，灵敏度高，操作简单，可以用于肺炎支原体肺炎的快速检测，为临床的早期诊断和治疗提供保证。

附图说明

[0019] 图1为SP引物灵敏度实验，A为新设计的SP引物；B为文章发表的引物；1：空白对照；2：6个MP拷贝；3：60个MP拷贝；4：600个MP拷贝；5：6000个MP拷贝；6：60000个MP拷贝。

[0020] 图2为使用不同菌株的标准株检测SP引物的特异性，A为阴阳性结果判定：1.阴性对照；2.UU(ATCC27813)；3.MH(ATCC15488)；4.大肠杆菌(ATCC25922)；5.阴沟肠杆菌(ATCC700323)；6.金黄色葡萄球菌(ATCC29213)；7.肺炎可雷白杆菌(ATCC1705)；
8.MP(FH，ATCC15531)；B为扩增曲线图：唯一扩增的为A中8号FH标准株。

[0021] 图3为LAMP方法检测临床标本MP感染并与PCR进行比较，A为用LAMP方法检测临床标本；B为相同的临床标本用巢式PCR方法进行检测；C为LAMP方法与PCR方法检测结果的比较。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0023] 实施例1.肺炎支原体检测试剂盒的制备及验证

[0024] 1.利用商业化DNA提取试剂盒提取样品总DNA。

[0025] 2.以肺炎支原体特异基因序列SDC1序列（GenBank accession No.M35024）为模板，设计出外引物（F3和B3），内引物（FIP和BIP），另外设计了一条加速扩增反应的环状引物。引物序列如下：

[0026] 外引物F3：

[0027] 5’TTGGTGGAAAACACGGCC3’（如SEQ ID NO.1所示）；

[0028] 外引物B3：

[0029] 5’GTTGAGTGGGCTGGCATTA3’（如SEQ ID NO.2所示）；

[0030] 内引物FIP：

[0031] 5’CCTTTCATCCCACTCACGGGGATGGCTTGTTTACCCTGCTC3’（如SEQ ID NO.3所示）；

[0032] 内引物BIP：

[0033] 5’AAGTGCAAACGACTTACCCGGTTAAGGAGGCAATTTTGGCGG3’（如SEQ ID NO.4所示）；

[0034] 环状引物LOOP：

[0035] 5’CAAGTCCGACCAAAAGGCC3’（如SEQ ID NO.5所示）。

[0036] 恒温扩增的反应体系：

[0037]MPFIP 40pmol
MPBIP 40pmol
MPF3 20pmol
MPB3 20pmol
MPLOOP 10pmol
dNTP 1.4mM
2×ReactionMix 12.5μl
BstDNA酶 8单位
模板DNA 2μl

[0038] 3.恒温扩增程序：使用商业化恒温扩增仪，扩增反应为63℃，60分钟。

[0039] 4.扩增产物结果判读：使用商业化恒温扩增仪，根据反应液浊度进行判定。

[0040] 5.灵敏度测定：将肺炎支原体标准株(FH,ATCC15531)DNA进行十倍梯度稀释，取2μl各梯度的DNA作为反应模板，对该引物的检测灵敏度进行测试，判定该引物的灵敏度为60个拷贝，优于已报道的肺炎支原体引物（600个拷贝），结果见图1。

[0041] 6.特异性测定：将下列菌种DNA为对照组，测试该引物的特异性。包括：UU(ATCC27813)；MH(ATCC15488)；大肠杆菌(ATCC25922)；阴沟肠杆菌(ATCC700323)；金黄色葡萄球菌(ATCC29213)；肺炎可雷白杆菌(ATCC1705)；MP所有上述对照组检测结果均为阴性。结果见图2，说明该引物对肺炎支原体具有较好的特异性。

[0042] 7.临床标本的检测：收集临床疑似肺炎支原体肺炎患者的咽拭子，以商业化DNA提取试剂盒提取的样品总DNA为模板进行恒温扩增检测。对47份临床标本与巢式PCR进行结果对比，结果见图3。

[0043] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。