一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法转让专利

申请号 : CN201310188135.0

文献号 : CN103278543B

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发明人 : 吕保樱唐艳平

申请人 : 桂林市产品质量监督检验所

摘要 :

本发明公开了一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法。该方法包括:1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液;2)采用CHI660D电化学工作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度,确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系为线性关系;CHI660D电化学工作站的参数为:以掺硼金刚石膜电极为工作电极,检测电位为0.9~1.15V,电解池中为pH7.2~7.6的PBS溶液;3)将待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;利用已得的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合样品的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度。该方法操作简单,检测时间仅需1h,检出限可达1000cfu/mL。

权利要求 :

1.一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于包括以下步骤:

1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液;

2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系

采用CHI660D电化学工作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度,以掺硼金刚石膜电极为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,设置工作电极的检测电位为0.9~1.15V,电解池中为pH7.2~7.6的磷酸-磷酸盐缓冲溶液;将上述步骤1)获得的多份沙门氏菌溶液逐一进样,记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值,根据全部进样的沙门氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线,得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线,该曲线为一直线,确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系为线性关系;

3)沙门氏菌浓度的快速检测

3.1)按步骤2)中的检测条件,将待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;所述待测水体样品是没有沉淀的,如有沉淀需要采用膜过滤或离心等方式将沉淀去除;

3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度。

2.根据权利要求1所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于:步骤2)中,所述工作电极的检测电位为0.95~1.05V,电解池中为pH7.3~7.5的磷酸-磷酸盐缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于:步骤2)中,所述工作电极的检测电位为1.0V,电解池中为pH7.4的磷酸-磷酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于:步骤1)中,获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液的具体操作为:取沙门氏菌菌液用无菌生理盐水稀释,分多次取适量稀释液分别注入到多个培养瓶中,计算各培养瓶中沙门氏菌的菌落数,得到多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液。

5.根据权利要求4所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于:步骤1)中,获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液的具体操作为:取沙门氏菌菌液用无菌生理盐水稀释,分多次取适量稀释液分别注入到多个培养瓶中,将各个培养瓶中稀释液分别涂布于LB平板上,于35~37℃培养箱中培养24h,通过计算各个LB平板上沙门氏菌的菌落数获得各培养瓶中沙门氏菌的菌落数,从而得到多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液。

6.根据权利要求1~3中任一项所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,其特征在于:所述的响应电流-沙门氏菌浓度曲线用于拟合表达掺硼金刚石膜电极的响应电流与沙门氏菌浓度依从关系的公式,拟合得到的公式为ΔI=Kx,其中ΔI为计时电流变化,单位为μA,K为常数,x为沙门氏菌浓度,单位为cfu/mL。

说明书 :

一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物含量的测定方法,具体涉及一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法。

背景技术

[0002] 沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。沙门氏菌病除可感染人外,还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态,也可表现为有临床症状的致死疾病,它可能加重病态或死亡率,或者降低动物的繁殖生产力。
[0003] 目前,对水体中沙门氏菌的浓度一般采用传统的常规检测方法,主要是通过增菌、分离、生化鉴定完成检测,如平板计数法等,这些方法也是国内外大多数检测机构使用的方法。但是这些方法或多或少存在着检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等不足,如果样品量大时,这些技术则很难满足快速计数沙门氏菌的需要。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法。该方法操作简单,检测周期短。
[0005] 本发明的原理为:基于BDD电极良好的电化学功能,将其置于含沙门氏菌的电解质溶液中,BDD电极表面占据活性位点的羟基自由基将会引起沙门氏菌细胞膜的脂质过氧化,从而在BDD电极上产生氧化电流,根据氧化电流的变化与沙门氏菌数量变化的关系,实现对水体中沙门氏菌浓度的检测。
[0006] 本发明所述的快速检测水体中沙门氏菌浓度的方法,包括以下步骤:
[0007] 1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液;
[0008] 2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极(BDD电极)响应电流的依从关系[0009] 采用CHI660D电化学工作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度,以掺硼金刚石膜电极为工作电极,铂丝电极为对电极,以饱和甘汞电极为参比电极,设置工作电极的检测电位为0.9~1.15V,电解池中为pH7.2~7.6的磷酸-磷酸盐缓冲溶液;将上述步骤1)获得的多份沙门氏菌溶液逐一进样,记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电流的电流值,根据全部进样的沙门氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线,得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线,该曲线为一直线,确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系为线性关系;
[0010] 3)沙门氏菌浓度的快速检测
[0011] 3.1)按步骤2)中的检测条件,将待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;
[0012] 3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度。
[0013] 上述方法中:
[0014] 步骤2)中,所述工作电极的检测电位优选为0.95~1.05V,最佳的检测电位为1.0V;电解池中磷酸-磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.3~7.5,最好是采用pH7.4的磷酸-磷酸盐缓冲溶液。
[0015] 步骤1)中,获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液的操作可以按现有常规方法进行,优选按以下操作进行:取沙门氏菌菌液用无菌生理盐水稀释,分多次取适量稀释液分别注入到多个培养瓶中,计算各培养瓶中沙门氏菌的菌落数(计算时采用现有常规方法),得到多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液。为了使沙门氏菌在后序检测时具有更好的活性,优选在上述操作中增加培养增菌的操作,在此基础上获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液的具体操作为:取沙门氏菌菌液用无菌生理盐水稀释,分多次取适量稀释液分别注入到多个培养瓶中,将各个培养瓶中的稀释液分别涂布于LB平板上,于35~37℃培养箱中培养24h,通过计算各个LB平板上沙门氏菌的菌落数获得各培养瓶中沙门氏菌的菌落数,从而得到多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液。该步骤中,用无菌生理盐水稀释沙门氏菌菌液6
时,稀释的倍数与现有技术相同,通常是将沙门氏菌液用无菌生理盐水稀释至约10 个/ml,以便于后续沙门氏菌菌落数的计数。
[0016] 上述方法中,所述的响应电流-沙门氏菌浓度曲线用于拟合表达掺硼金刚石膜电极的响应电流与沙门氏菌浓度依从关系的公式,拟合得到的公式为ΔI=Kx,其中ΔI为计时电流变化,单位为μA,K为常数,x为沙门氏菌浓度,单位为cfu/mL。
[0017] 在上述检测条件下,本方法检测水体中沙门氏菌的检出限为1000cfu/mL。
[0018] 本发明所述的检测方法中,掺硼金刚石膜电极在每次检测完成后需要再生后再进行下一次的实验,最好是在每记录一次进样的掺硼金刚石膜电极响应电流的电流值后即对掺硼金刚石膜电极进行再生,之后再将掺硼金刚石膜电极置于电解池中进行工作。所述对掺硼金刚石膜电极进行再生的操作为:将掺硼金刚石膜电极置于硫酸钠水溶液中,加高电压活化一段时间,以除去电极表面的吸附物。其中硫酸水溶液的浓度不宜过高,通常使用0.05~0.5mol/L的Na2SO4水溶液,加高电压至2.0~3.0V活化20~60s;在上述范围内,如果Na2SO4水溶液的浓度较低,则活化的时间相应延长,反之则缩短活化时间。优选是采用
0.1mol/L的Na2SO4水溶液,加高电压至2.5V活化30s。
[0019] 本发明所述方法中涉及的掺硼金刚石膜电极可以从市场上直接购买,也可自行制备,自行制备时,优选采用下述方法进行:
[0020] 采用微波等离子化学气相沉积法(MWCVD)在硅片上生长掺硼金刚石膜来制备掺硼金刚石膜电极。以固体B2O3为硼掺杂源,选择高阻硅(100)基片,硅衬底的尺寸约为15mm×15mm。先在硅衬底上用热丝CVD方法沉积约5μm厚的本征金刚石薄膜,生长条件为:热丝功率3kW,衬底至灯丝距离约5mm,C/H原子摩尔比为1%,气体压力40KPa,衬底温度850℃,生长时间1h。然后把样品转移到微波CVD反应室内继续生长掺硼金刚石薄膜,微波功率850W,衬底温度约为515℃,生长时间为5h,获得的金刚石膜平均厚度为20μm,晶粒形状清楚,晶粒生长良好,有棱角,颗粒比较均匀,相互间致密,平均粒径为1μm,以复晶形式生长,表面高度起伏为0.2~0.6μm。
[0021] 本发明所述方法中,作为待测水体的样品应没有沉淀,如有沉淀需要采用膜过滤或离心等方式将沉淀去除。
[0022] 采用本发明所述方法与现有平板计数法对多份样品进行检测,所得测试结果的偏差均在10%以内。
[0023] 与现有技术相比,本发明的特点在于:
[0024] 1、操作简单,检测时间短,仅需1小时;
[0025] 2、检测灵敏度高,检出限可达1000cfu/mL。

附图说明

[0026] 图1为用本发明所述方法当BDD电极在磷酸-磷酸盐缓冲溶液(pH7.4,0.1mol·L-1
)中的循环伏安图;
[0027] 图2为用本发明所述方法在BDD电极电位为1.0V,在0.1mol·L-1(pH7.4)的磷酸-磷酸缓冲溶液中,根据电解池中每次增加一定数量的沙门氏菌菌液而产生的电流变化做得的I-t曲线。

具体实施方式

[0028] 本申请中,关于BDD电极引起水体中沙门氏菌的氧化及BDD电极的再生情况:
[0029] 图1是BDD电极在磷酸-磷酸盐缓冲溶液(pH7.4,0.1mol·L-1)中的循环伏安图。从图中可以看到,在BDD电极上,除了在电位大于1.5V因析氧而出现电流增大外,在1.0~1.25V之间出现一个明显氧化峰,该峰对应于水分解生成·OH的过程,且·OH被吸附于BDD电极表面,占据着BDD电极表面的活性位点。其反应如下:
[0030] S[]+H2O→S[·OH]+H++e-
[0031] 其中S[]表示BDD电极表面的活性位点。将BDD电极置于含沙门氏菌的电解质溶液中,BDD电极表面占据活性位点的羟基自由基将会引起沙门氏菌细胞膜的脂质过氧化,从而在BDD电极上产生氧化电流,根据氧化电流的变化与沙门氏菌数量变化的关系,即可实现对水体中的沙门氏菌进行计数(即实现对水体中沙门氏菌浓度的检测)。
[0032] 用CHI660D电化学工作站,采用电化学计时电流的方法,快速检测水体中沙门氏-1菌的浓度,电解池中工作电极的电位设定为1.0V,在0.1mol·L ,pH7.4的磷酸-磷酸缓冲溶液(PBS)中,根据电解池中每次增加一定数量的沙门氏菌菌液而产生的电流变化做-1
I-t曲线。每次实验结束后将BDD电极放入0.1mol·L 的Na2SO4溶液中,加高电压进行活化,除去电极表面吸附物
[0033] 当每次在电解池溶液中增加2.7×106个沙门氏菌时,BDD电极上响应的电流也随之改变,但是随着沙门氏菌的数量不断增加,电极上响应的电流变化值却越来越小,如图2所示。
[0034] 沙门氏菌在BDD电极上的氧化,是由于·OH引起沙门氏菌细胞膜脂质过氧化作用。羟基自由基主要是H2O在BDD电极表面放电生成并吸附在BDD电极表面(S[·OH]),S[·OH]具有强氧化性,与沙门氏菌发生氧化反应。但是,在产生氧化电流的同时,还有一部分氧化反应的中间产物残留在电极表面,影响了沙门氏菌在电极上的氧化,所以,虽然增加同样数量的沙门氏菌,但增加的氧化电流减少。正是因为中间产物的残留,因此BDD电极在使用一定时间必须经过再生处理,处理方法通常是将BDD电极置于0.1mol/L的Na2SO4溶液中,加大工作电极上的电压至2.5V,使水在此BDD电极上产生氧气,利用氧气带走沙门氏菌被氧化的中间产物。
[0035] 下面以具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不局限于这些实施例。
[0036] 实施例1
[0037] 1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液:
[0038] 取第一个浓度沙门氏菌菌液用无菌生理盐水稀释103、104、105、106、107、108倍,各取200μL沙门氏菌的稀释液分别注入到12个培养皿中(每个稀释倍数做平行样)。将各个培养皿中的稀释液分别涂布于LB平板上,于35~37℃培养箱中培养24h,计数每个平板上的可疑菌落数,挑取可疑菌落进行生化和血清学鉴定验证后,得到1个已知浓度的沙门氏菌溶液。以同样的步骤对第二个浓度进行培养分析,以此类推得到一系列(7个)不同已知浓度的沙门氏菌溶液。
[0039] 2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系
[0040] 采用CHI660D电化学工作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度,以掺硼金刚石膜电极为工作电极,铂丝电极为对电极,以饱和甘汞电极为参比电极,设置工作电极的检测电位为1.0V,电解池中为pH7.4的磷酸-磷酸盐缓冲溶液;将上述6
步骤1)获得的7份沙门氏菌溶液逐一进样,每次加入沙门氏菌的量为10 个的倍数,待计时电流曲线稳定后读数,记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值,检测上述步骤1)中的7份不同已知浓度的沙门氏菌液结果如表1所示;根据全部进样的沙门氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线,得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线(横坐标为沙门氏菌的浓度,纵坐标为响应电流变化值),拟合的公式为:ΔI/μA=-7 2
1.215×10 x-0.0223(R=0.9988);
[0041] 3)沙门氏菌浓度的快速检测
[0042] 3.1)按步骤2)中的检测条件,取200μL待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;
[0043] 3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度。
[0044] 本实施例中,在每记录一次进样的掺硼金刚石膜电极响应电流的电流值后即对掺硼金刚石膜电极进行再生,之后再将掺硼金刚石膜电极置于电解池中进行工作。所述对掺硼金刚石膜电极进行再生的操作为:将掺硼金刚石膜电极置于0.1mol/L的Na2SO4水溶液中,加高掺硼金刚石膜电极电压至2.5V活化30s,以除去电极表面的吸附物。
[0045] 表1电流变化与沙门氏菌数量的关系表
[0046]
[0047] 实施例2
[0048] 1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液:
[0049] 同实施1步骤1)。
[0050] 2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系
[0051] 采用CHI660D电化学工作站用电化学计时电流的方法快速检测沙门氏菌的浓度,以掺硼金刚石膜电极为工作电极,铂丝电极为对电极,以饱和甘汞电极为参比电极,设置工作电极的检测电位为1.05V,电解池中为pH7.2的磷酸-磷酸盐缓冲溶液;将上述步骤1)获7
得的多份沙门氏菌溶液逐一进样,每次加入沙门氏菌的量为10 个的倍数,待计时电流曲线稳定后读数,记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值,检测上述步骤1)中的7份不同已知浓度的沙门氏菌液结果如表2所示;根据全部进样的沙门氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线,得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线(横坐标为沙门氏菌-7
的浓度,纵坐标为响应电流变化值),拟合的公式为:ΔI/μA=1.215×10 x-0.0181;
[0052] 3)沙门氏菌浓度的快速检测
[0053] 3.1)按步骤2)中的检测条件,取200μL待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;
[0054] 3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度。
[0055] 本实施例中,在完成第2)步骤对7份不同已知浓度的沙门氏菌液的掺硼金刚石膜电极响应电流的电流值的记录后再对掺硼金刚石膜电极进行再生,之后再将掺硼金刚石膜电极置于电解池中进行工作。所述对掺硼金刚石膜电极进行再生的操作为:将掺硼金刚石膜电极置于0.1mol/L的Na2SO4水溶液中,加高掺硼金刚石膜电极电压至2.5V活化30s,以除去电极表面的吸附物。
[0056] 表2电流变化与沙门氏菌数量的关系表
[0057]
[0058] 实施例3
[0059] 1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液:
[0060] 同实施2步骤1)。
[0061] 2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系
[0062] 重复实施例2,不同的是:设置工作电极的检测电位为1.15V,电解池中为pH7.6的磷酸-磷酸盐缓冲溶液;
[0063] 检测上述步骤1)中的7份不同已知浓度的沙门氏菌液结果如表3所示;根据全部进样的沙门氏菌液浓度和与其对应响应电流的电流值作曲线,得到响应电流-沙门氏菌浓度曲线(横坐标为沙门氏菌的浓度,纵坐标为响应电流变化值),拟合的公式为:ΔI/μA=-71.215×10 x-0.0191;
[0064] 3)沙门氏菌浓度的快速检测
[0065] 3.1)按步骤2)中的检测条件,取200μL待测水体样品进样,记录掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;
[0066] 3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度。
[0067] 本实施例中,掺硼金刚石膜电极的再生同实施例1。
[0068] 表3电流变化与沙门氏菌数量的关系表
[0069]
[0070] 实施例4:根据实施例1确定的依从关系检测含沙门氏菌液样品的浓度[0071] 1)获得多份不同已知浓度的沙门氏菌溶液:
[0072] 分别取从实验室配置的含沙门氏菌液的4份样品,分别离心后再分别收集上层清液,作为待检测的水体样品。
[0073] 取其中一份含沙门氏菌菌液水样用无菌生理盐水稀释103、104、105、106、107、108倍,各取200μL沙门氏菌的稀释液分别注入到12个培养皿中(每个稀释倍数做平行样)。将各培养皿中的稀释液分别涂布于LB平板上,于35~37℃培养箱中培养24h,计数每个平板上的可疑菌落数,挑取可疑菌落进行生化和血清学鉴定验证后,得到1个已知浓度的沙门氏菌溶液。其余三个样品同上操作,分别获得4份样品(分别标号为样品1、样品2、样品3和样品4)的沙门氏菌浓度。
[0074] 2)确定沙门氏菌与掺硼金刚石膜电极响应电流的依从关系
[0075] 同实施例1。
[0076] 3)沙门氏菌浓度的快速检测
[0077] 3.1)按实施例1中步骤2)中的检测条件,分别将4份样品逐一进样(每个样品均取200μL),待计时电流曲线稳定后读数,记录每次进样时掺硼金刚石膜电极的响应电泳的电流值;
[0078] 3.2)利用步骤2)确定的响应电流-沙门氏菌浓度曲线,结合上述步骤3.1)记录的各电流值读出该电流值对应的沙门氏菌浓度,该浓度即为待测水体的沙门氏菌浓度,具体结果如表4所示。
[0079] 本实施例中,掺硼金刚石膜电极的再生同实施例1。
[0080] 在将上述4份样品用本发明所述方法检测的同时,也将它们分别用平板计数法进行检测,所得结果如表4所示。
[0081] 表4:
[0082]
[0083] 可见,以本发明所述方法对水体中沙门氏菌浓度的检测结果与现有平板计数方法的检测结果偏差在10%以内,因而可知,本发明的方法能满足现代社会快速检测筛查的需要,特别适用于公共卫生事业和环境监测等领域快速检测水中沙门氏菌浓度。