抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体及其应用

摘要

本发明公开一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体及其应用。该单链抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQID NO.2所示的轻链可变区。本发明通过酵母双杂交的方法在人类单链抗体文库中筛选与人类CD44S胞外段相互作用的单链抗体，由于酵母是真核生物，使得CD44的结构更接近在哺乳动物细胞里的结构，再加上高表达的载体以及CD44序列的酵母表达优化，确保了融合蛋白的高表达，筛选所得的单链抗体的可靠性更好；本发明使用CD44S作为抗原筛选单链抗体，由于所有CD44V都包含CD44S的外显子部分，因此筛选所得的单链抗体很可能与所有CD44V都相互作用；本发明所提供的单链抗体是全人源段的，无免疫原性，可更好的使用于人类和开发抗癌药物。

权利要求

1.一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，其特征在于：包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，其特征在于：编码所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，其特征在于：编码所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，其特征在于：由重链可变区、连接链和轻链可变区组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求4所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，其特征在于：编码所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.权利要求1～5任一项所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：通过基因合成编码抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的核苷酸序列，将其克隆至表达载体中，再将其重组后的表达载体转入对应的宿主细胞进行表达，纯化，得到所述的抗CD44的单链抗体。

7.权利要求1～5任一项所述抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体在制备抗癌药物中的应用。

说明书

抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗体领域，特别涉及一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体及其应用。

背景技术

[0002] 近几十年来，不断有人提出假说，认为肿瘤的生长和转移起源于某些干细胞样的“种子细胞"，即当前被称之为肿瘤干细胞。在实体肿瘤中，这一小部分肿瘤干细胞拥有与其他肿瘤细胞不一样的表面标记分子，其增殖、自我更新、体外成瘤等能力都比其他细胞更强，从而帮助癌症的发展。目前治疗癌症的主要手段就是对肿瘤细胞进行杀灭，而不能杀死肿瘤干细胞，导致癌症不能彻底治愈。因此如果能针对肿瘤干细胞设计药物，从而杀死这部分细胞，那么将在很大程度上帮助治疗癌症。

[0003] CD44是细胞外基质中的粘附分子，在淋巴细胞归巢和激活、组织创伤修复、细胞迁移等很多生理过程中起到作用。CD44分为CD44S和CD44V，前者为标准型，后者为突变体，CD44S由10个固定表达的组成型外显子组成，CD44V除了拥有CD44S的10个外显子外，在其第5、6号外显子之间可随机选择性的拼接另外10个外显子组合，形成不同类型的CD44V。近年来，有学者发现，CD44V在多种上皮样癌细胞表面大量表达，且在相关实体瘤中，表达CD44的肿瘤细胞的增殖、迁移、体内外成瘤以及抗肿瘤药物的能力都较强，CD44已经被鉴定作为多种肿瘤干细胞的表面分子标记之一，已经有研究表明抑制肿瘤细胞CD44的表达能有效抑制肿瘤的生长和转移等，因此利用CD44作为癌症治疗的靶点，具有很高的医学价值。

[0004] 单链抗体是一种新型的基因工程抗体，它由完整抗体的重链可变区和轻链可变区以及连接两者的短的柔韧的肽链(10～20个氨基酸)融合而成，分子质量非常小，约30kDa。相对于完整的抗体，单链抗体具有分子量小、免疫原性低、体外表达方便、容易穿透血管和实体瘤、方便改造等优点，无论是用于癌症的治疗或者检测都具有较高的应用价值。
目前，尚未发现有关抗CD44的单链抗体的报道。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区;

[0008] 所述的重链可变区的氨基酸序列如下所示:

[0009] QVQQQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNEYAESVKSRIIINADTSKNQLSLQLNSVTPEDTAVYYCAR；

[0010] 所述的轻链可变区的氨基酸序列如下所示:

[0011] EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGHSP；

[0012] 编码所述的重链可变区的核苷酸序列如下所示:

[0013] CAGGTACAGCAGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGAGTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACGCAGACACATCCAAGAACCAGTTGTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGA；

[0014] 编码所述的轻链可变区的核苷酸序列如下所示:

[0015] GAAATTGTGCTGACTCAATCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTATATTACTGTCAGCAGTATGGTCATTCACCT；

[0016] 由于单链抗体的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区特异性的基因序列决定的，因此，可通过基因工程方法对如上提供的编码重链链可变区和编码轻链可变区的核苷酸序列进行重组，得到不同类型的抗体;

[0017] 所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体，由重链可变区、连接链和轻链可变区组成，其氨基酸序列如下所示:

[0018] QVQQQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNEYAESVKSRIIINADTSKNQLSLQLNSVTPEDTAVYYCARGGWPYYYYMDVWGQGTLVTVSSAAAITSYNVYYTKLLARQEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGHSP;

[0019] 编码所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的核苷酸序列如下所示:

[0020] CAGGTACAGCAGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGAGTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACGCAGACACATCCAAGAACCAGTTGTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGGGTTGGCCCTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATAACTTCGTATAATGTGTACTATACGAAGTTATTGGCGCGCCAGGAAATTGTGCTGACTCAATCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTATATTACTGTCAGCAGTATGGTCATTCACCT;

[0021] 编码所述抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的重链可变区的基因由303个碱基组成，编码101个氨基酸，可变区含有2个CDR(互补决定簇）区:CDRl编码7个氨基酸，为SNSAAWN；CDR2编码18个氨基酸，为RTYYRSKWYNEYAESVKS，它是属于家族6，Germlinel的单链抗体;

[0022] 编码所述抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的轻链可变区的基因由288个碱基组成，编码96个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区:CDRl编码12个氨基酸，为RASQSVSSSYLA;CDR2编码7个氨基酸，为GASSRAT;CDR3编码7个氨基酸，为QQYGHSP，它是属于家族kabat3，Germline20的单链抗体;

[0023] 所述的抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体可通过基因合成编码抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体的核苷酸序列，将其克隆至表达载体中，再将其重组后的表达载体转入对应的宿主细胞进行表达，纯化，即可得到所述的抗CD44的单链抗体。

[0024] 所述抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体在制备抗癌药物中的应用。

[0025] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

[0026] (1)本发明通过酵母双杂交的方法在人类单链抗体文库中筛选与人类CD44S胞外段相互作用的单链抗体，由于酵母是真核生物，使得CD44的结构更接近在哺乳动物细胞里的结构，再加上高表达的载体以及CD44序列的酵母表达优化，确保了融合蛋白的高表达，筛选所得的单链抗体的可靠性更好。

[0027] (2)本发明使用CD44S作为抗原筛选单链抗体，由于所有CD44V都包含CD44S的外显子部分，因此筛选所得的单链抗体很可能与所有CD44V都相互作用。

[0028] (3)本发明所提供的单链抗体是全人源段的，无免疫原性，可更好的使用于人类和开发抗癌药物。

附图说明

[0029] 图l是pGBKT7-CD44双酶切电泳验证图，其中:泳道M为DNA Marker，泳道l为pGBKT7-CD44未酶切的样品，泳道2是pGBKT7-CD44用EcoR I和Baw7H I双酶切后的样品。

[0030] 图2是诱饵质粒pGBKT7-CD44转化AHl09的PCR验证图，其中:泳道1为DNAMarker，泳道2为针对CD44设计的特异引物PCR产物。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0032] 实施例lpGBKT7-CD44质粒的构建

[0033] (1)从NCBI中查询人类CD44S的胞外段cDNA序列，由南京金斯瑞公司进行酵母表达优化后合成并插入pGBKT7质粒中形成pGBKT7-CD44，合成的CD44胞外段序列如下:

[0034] GACTTGAACATCACTTGTAGATTTGCTGGTGTATTCCACGTAGAAAAGAACGGTAGATATTCCATCAGTAGAACAGAAGCCGCCGACTTGTGTAAGGCTTTTAATTCAACATTGCCTACCATGGCACAAATGGAAAAGGCCTTGTCTATCGGTTTCGAAACTTGTAGATACGGTTTCATCGAAGGTCATGTTGTAATTCCAAGAATACACCCTAACTCTATTTGCGCTGCAAATAACACTGGTGTTTACATCTTGACTTCAAACACATCCCAATACGATACATACTGTTTTAACGCCAGTGCTCCACCTGAAGAAGACTGCACCTCTGTAACTGATTTGCCAAATGCATTCGACGGTCCTATTACCATAACTATCGTCAACAGAGATGGTACAAGATATGTTCAAAAGGGTGAATACAGAACCAATCCAGAAGATATCTATCCATCTAACCCTACTGATGACGATGTATCTTCAGGTTCCAGTTCTGAAAGATCATCCACATCAGGTGGTTATATTTTCTATACATTCTCCACCGTCCATCCAATTCCTGACGAAGATTCACCATGGATCACTGACTCCACAGATAGAATACCAGCTACCAGAGACCAAGATACTTTCCATCCAAGTGGTGGTTCTCATACTACACACGGTAGTGAATCTGATGGTCATTCACACGGTTCCCAAGAAGGTGGTGCCAATACAACATCAGGTCCTATCAGAACTCCTCAAATTCCAGAA。

[0035] (2)双酶切验证pGBKT7-CD44

[0036] 1)抽提pGBKT7-CD44质粒

[0037] 具体按照OMEGA Plasmid Mini Kit I说明书操作:

[0038] A、将含有pGBKT7-CD44质粒的大肠杆菌DH5α菌株(南京金斯瑞公司提供)接种于含有20μg/ml卡那霉素的同体LB平板中，37°C培养约18小时。

[0039] B、挑取一个生长良好的单克隆接种于5ml含有20μg/ml卡那霉素的液体LB中，37°C，200rpm培养约16小时。

[0040] C、取4ml菌液10000g离心lmin，弃去上清。

[0041] D、加入250μl Solution I/RNase A，充分混匀，漩涡震荡20秒。

[0042] E、加入250μl Solution II，反转颠倒5次，室温下静置2min。

[0043] F、加入350μl Solution III，立即反转颠倒5次，溶液里出现白色絮状物。13000g离心l0min。

[0044] G、取出一个收集管，并将DNA结合柱（ Miniprep Column）放入管中，小心吸取上清至DNA结合柱中，10000g离心1min，弃去收集管中的液体。

[0045] H、向DNA结合柱中加入500μl Buffer HB，10000g离心1min，弃去收集管中的液体。

[0046] I、向DNA结合柱中加入700μl DNA Wash Buffer，l0000g离心lmin，弃去收集管中的液体。

[0047] J、重复步骤I。

[0048] K、13000g空离心DNA结合柱2min以去除酒精。

[0049] L、将DNA结合柱转移至一个干净的EP管，加入40μl Elution Buffer或无菌去离子水至柱面上，室温静置1～2min，13000g离心lmin。得到的溶液就是所提取的质粒溶液，利用分光光度计测量浓度。

[0050] 2)进行双酶切验证:

[0051] A、反应体系

[0052]

[0053] 37°C水浴2小时。

[0054] B、取l0ul酶切后的溶液，加入l0×Loading Bufferl.1μl，混匀后在质量体积比1%的琼脂糖凝胶中进行DNA电泳，结果显示酶切出的片段与设计的CD44片段吻合(图1)。

[0055] (3)取抽提的pGBKT7-CD44质粒送到华大基因公司进行测序，结果显示正确。

[0056] 实施例2AHl09的表型鉴定

[0057] (1)将未转化任何质粒的空酵母AHl09菌株(购自Clontech公司)划线于YPDA板，30°C倒置培养3～5天，观察酵母的生长情况，发现AHl09正常生长。

[0058] (2)用无菌接种环挑取AHl09单克隆，分别划线于SD/-Met、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Ade、SD/-His板上。30°C倒置培养4～6天，观察酵母的生长情况，发现酵母除了在SD/-Met生长以外，其他培养基上均不能正常生长。

[0059] 以上结果证明AHl09表型是正确的。

[0060] 实施例3pGBKT7-CD44质粒转化AHl09，并进行自激活检测

[0061] 具体按照clontech公司YeastmakerTMYeast Transbrmation System2说明书操作:

[0062] (1)制备AHl09感受态

[0063] 1)接种AHlO9于YPDA固体培养基平板中，30°C倒置培养约3天。

[0064] 2)挑取一个生长良好的菌落(2～3mm)接种于5mlYPDA液体培养基中，30°C，200rpm培养约12小时。

[0065] 3)转移5μl菌液至50ml新鲜的YPDA液体，于250ml三角烧瓶中30°C，200rpm培养约18小时至0D600达到0.15～0.3。

[0066] 4)室温下700g离心5min，弃去上清，加入100ml新鲜的YPDA重悬，30°C，200rpm培养约4小时，0D600达到0.4～0.5。

[0067] 5)分装至两个50ml离心管，700g离心5min，弃去上清。

[0068] 6)每管加入1.5mll.l×TE/LiAc(试剂盒中提供l0×LiAc和l0×TEbuffer，lOmll.l×TE/LiAc的配方是:1.lmll0×LiAc加入1.lmll0×TE buffer后补充无菌双蒸水到l0ml)重悬。

[0069] 7)将悬液分别转移至两个EP管中，1000g离心15秒，弃去上清。

[0070] 8)每管加入600μ11.l×TE/LiAc重悬，至此，AHl09感受态就已经制备完毕。

[0071] (2)pGBKT7-CD44转化AHl09感受态细胞

[0072] 1)取一个EP管，加入pGBKT7-CD44质粒100ng和Yeastmaker CalTier DNA(试剂盒中提供，工作浓度为10μg/μ1)5μl。

[0073] 2)加入50μl感受态AHl09，轻轻混匀。

[0074] 3)加入500μl PEG/LiAc(试剂盒中提供l0×TE LiAc，l0×TE buffer和50%PEG3350，l0mlPEG/LiAc的配方是:lmll0×TE LiAc加入lmll0×TE buffer后再加入
8m150%PEG3350)，轻轻混匀。

[0075] 4)30°C孵育30min，每l0min混匀一次。

[0076] 5)加入20μl DMSO，混匀。

[0077] 6)42°C热击15min，每5min轻轻涡旋一次。

[0078] 7)10000g离心15秒，弃去上清，加入lml YPD Plus Liquid Medium(试剂盒中提供)，30°C，200rpm培养1小时。

[0079] 8)10000g离心15秒，弃去上清，加入0.9%(w/v)的NaCl溶液lml重悬。

[0080] 9)涂布100μ1按体积比1:10和1:100的稀释液于直径为100mm的SD/-Trp平板中，30°C培养3～5天。

[0081] (3)从生长出阳性克隆中抽提pGBKT7-CD44质粒

[0082] 具体按照 Yeast Plasmid Kit说明书操作：

[0083] 1)挑取一个生长良好的克隆接种于5ml SD/-Trp中，30°C，200rpm培养约20小时。

[0084] 2)吸取3ml菌液，6000g离心5min，弃去上清。

[0085] 3)加入480μl Buffer SE、l0μl β-巯基乙醇和20μl Lyticase Solution，充分重悬细胞，置30°C孵育45min。

[0086] 4)6000g离心5min，弃去上清。

[0087] 5)加入250μl Buffer YP I/RNase A重悬，加入50mg玻璃小球，充分漩涡5min，转移悬液至另一个干净的EP管。

[0088] 6)加入250μl YPII，反转颠倒5次，得到透明的溶菌产物，室温静置2min。

[0089] 7)加入350μl YPIII，反转颠倒5次，溶液中出现白色絮状物。13000g离心l0min。

[0090] 8)将新的DNA结合柱放入2ml的收集管中，小心吸取上清加入DNA结合柱中，[0091] 9)10000g离心2min，弃去收集管中的液体。

[0092] 10)加入500μl Buffer HB至DNA结合柱中，10000g离心lmin，弃去收集管中的液体。

[0093] 11)加入700μlDNA Wash Buffer至DNA结合柱中，10000g离心lmin，弃去收集管中的液体。

[0094] 12)重复上步。

[0095] 13)13000g空离心DNA结合柱2min以去除酒精。

[0096] 14)将DNA结合柱转移至一个干净的EP管，加入40μl Elution Buffer或无菌去离子水至柱面上，室温静置1～2min，13000g离心lmin，得到的溶液就是所提取的质粒溶液，测量DNA浓度。

[0097] (4)PCR鉴定转化入AHl09的质粒

[0098] l)PCR引物信息如下:

[0099] 正向引物:5'-CGGAATTCTGGCACAAATGGAAAAGGC-3'

[0100] 反问引物:5'-CGGGATCCGATGGACGGTGGAGAAT-3'

[0101] 2)PCR反应体系如下:

[0102]

[0103]

[0104] 3)PCR反应条件如下:

[0105]

[0106] 3)PCR完毕，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况，证明成功扩增出特定的436bp片段(图2)，说明转化进入AHl09的质粒为pGBKT7-CD44。

[0107] (5)诱饵质粒自激活检测

[0108] 从SD/-Trp板上挑取转化入诱饵质粒的酵母AHl09单克隆，分别分区划线于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade板上划线，30°C倒置培养3～5天，检测MELl、HIS3、ADE2报告基因的表达。

[0109] 观察发现，酵母在SD/-Trp/X-α-Gal板上有生长，但克隆未变蓝，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade板上均未生长，说明诱饵质粒pGBKT7-CD44不存在自激活现象。

[0110] 实施例4酵母双杂交筛选与CD44相互作用的单链抗体

[0111] (1)已含有pGBKT7-CD44质粒的AHl09感受态制备

[0112] 1)接种含有pGBKT7-CD44质粒的AHl09于SD/-Trp固体培养基平板中，30°C倒置培养约4天。

[0113] 2)挑取一个生长良好的菌落(2～3mm)接种于5mlSD/-Trp液体培养基中，30°C，200rpm培养约12小时。

[0114] 3)转移5μl菌液至50ml新鲜的SD/-Trp液体，于250ml三角烧瓶中30°C，200rpm培养约18小时至0D600达到0.15～0.3。

[0115] 4)室温下700g离心5min，弃去上清，加入100ml新鲜的SD/-Trp重悬，30°C，200rpm培养约4小时，0D600达到0.4-0.5。

[0116] 5)分装至两个50ml离心管，700g离心5min，弃去上清。

[0117] 6)每管加入1.5mll.l×TE/LiAc重悬。

[0118] 7)将悬液分别转移至两个EP管中，10000g离心15秒，弃去上清。

[0119] 8)每管加入600μl1.l×TE/LiAc重悬，至此，含有pGBKT7-CD44质粒的AHl09感受态就已经制备完毕。

[0120] (2)文库质粒pSF50-scFv(百奥泰生物科技(广州)有限公司)大规模转化已含有pGBKT7-CD44的AHl09感受态细胞

[0121] 1)取一个15ml管，加入文库质粒10μg和Yeastmaker Carrier DNA(试剂盒中提供，工作浓度为l0μg/μl)20μl。

[0122] 2)加入600μl含有pGBKT7-CD44质粒的AHl09感受态细胞，轻轻混匀。

[0123] 3)加入2.5mlPEG/LiAc，轻轻混匀。

[0124] 4)30°C孵育45min，每15min混匀一次。

[0125] 5)加入160μlDMSO，混匀。

[0126] 6)42°C热击20min，每l0min轻轻涡旋一次。

[0127] 7)1000g离心5min，弃去上清，加入3ml YPD Plus Liquid Medium，30°C、200rpm培养90min。

[0128] 8)1000g离心5min，弃去上清，加入0.9%(w/v)的NaCl溶液lml重悬。

[0129] 9)涂布100μl按体积比1:10和1:l00和1:1000的稀释液于含有SD/-Trp/-Lue的100mm平板中，计算转化效率。

[0130] 10)离心剩下的菌液，去除800μl上清，余下的混匀后，涂布于含有SD/-Trp-Lue/-His/-Ade固体培养基的150mm培养皿中。

[0131] 11)30°C培养5到7天，直到阳性克隆长到2到3mm。

[0132] 实施例5回复性转化鉴定阳性克隆

[0133] 1)提取阳性酵母克隆内的质粒(参照以上方法)。

[0134] 2)转化大肠杆菌DH5α

[0135] 具体按照碧云天公司一步法感受态细菌制备试剂盒说明书操作:

[0136] A、接种一个生长良好的大肠杆菌DH5α(碧云天公司)克隆于LB培养基中37°C，200rpm培养约16小时。

[0137] B、吸取50μl上述培养液重新接种于5ml的新鲜LB中，200rpm，37°C培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5。

[0138] C、4°C，2000g离心5分钟收集细菌，用500μl预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀，加入500μl在冰浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5分钟，分装至1.5ml离心管中，每管分装100μl。至此感受态制备完毕。

[0139] D、向一管感受态中加入10μl酵母质粒提取液，手指轻轻弹离心管，以混匀细菌和质粒，冰浴放置30分钟。

[0140] E、42°C水浴，热休克2分钟。热休克后立即置于冰浴中，2分钟。

[0141] F、加入900微升LB，37°C，200rpm培养1小时。

[0142] G、2000-3000g离心1分钟使细菌充分沉淀下来。去除约900-950微升LB培养液，细菌沉淀用余下的LB培养液重悬，然后全部涂布到含浓度为100μg/ml的氨苄西林抗生素的LB平板上。37°C培养约18小时。

[0143] 3)抽提质粒(参照以上方法)，递交华大基因测序，上游测序引物为5'-5-TTTGTTTCCTCGTCATTGT3-3'。

[0144] 4)将以上pSF5O-scFv再转化入含有pGBKT7-CD44质粒的AHl09(参照以上方法)，涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal，30°C培养，观察菌落生长情况及是否变蓝，结果依然生长并变蓝。

[0145] 通过酵母双杂交筛选和测序得到一个能与CD44相互作用的单链抗体，命名为CAl4，通过测序得到该单链抗体的序列信息如下:

[0146] CAGGTACAGCAGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGAGTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACGCAGACACATCCAAGAACCAGTTGTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGGGTTGGCCCTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATAACTTCGTATAATGTGTACTATACGAAGTTATTGGCGCGCCAGGAAATTGTGCTGACTCAATCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTATATTACTGTCAGCAGTATGGTCATTCACCT。

[0147] 实施例6抗体片段序列分析

[0148] 测得的序列在NCBI的lg blast中进行数据比较，获得单链抗体CAl4的基本信息如下:编码所述的重链可变区的基因由303个碱基组成，编码101个氨基酸，可变区含有2个CDR(互补决定簇)区:CDRl编码7个氨基酸，为SNSAAWN;CDR2编码18个氨基酸，为RTYYRSKWYNEYAESVKS，它是属于家族6，Germlinel的单链抗体;编码所述的轻链可变区的基因由288个碱基组成，编码96个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区:CDRl编码12个氨基酸，为RASQSVSSSYLA;CDR2编码7个氨基酸，为GASSR4T;CDR3编码7个氨基酸，为QQYGHSP，它是属于家族kabat3，GeTmline20的单链抗体。

[0149] 实施例中所用到培养基的组成如下:

[0150] (l)LB培养基(lL)

[0151]

[0152] 注:加入lL去离水溶解以上药品，12l°C高压蒸汽灭菌15min，使用前加入与所用载体相应的抗生素，卡那霉素的使用浓度为20μg/ml，氨苄西林的使用浓度为100μg/ml。

[0153] (2)YPDA培养基(lL)

[0154]

[0155] 注:葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0156] (3)SD/-Met培养基(lL)

[0157]

[0158] 注:100ml的l0×-Met DO Supplement中含有-Met DO Supplement量为0.77g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0159] (4)SD/-Leu培养基(lL)

[0160]

[0161] 注:100ml的l0×-Leu DO Supplement中含有-Leu DO Supplement量为0.69g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0162] (5)SD/-Ade培养基(lL)

[0163]

[0164] 注:100ml的l0×-Ade DO Supplement中含有-Ade DO Supplement量为0.77g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0165] (6)SD/-His培养基(lL)

[0166]

[0167]

[0168] 注:1OOml的lO×-His DO Supplement中含有-His DO Supplement量为0.77g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。(7)SD/-Trp培养基(lL)[0169]

[0170] 注:1OOml的lO×-Trp DO Supplement中含有-Trp DO Supplement量为0.74g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。(8)SD/-Trp/-Leu培养基(lL)[0171]

[0172] 注:100ml的l0×-Trp/-Leu DO Supplement中含有-Trp/-Leu DO Supplement量为0.64g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0173] (9)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基(lL)

[0174]

[0175]

[0176] 注 :100ml 的 l0×-Trp/-Leu/-His/-Ade DO Supplement 中 含有-Tw/-Leu/-His/-Ade DO Supplement量为0.6g。葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，除葡萄糖以外的药品加入去离子水950ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，冷却至55°C左右，再加入灭菌的浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)。

[0177] (10)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal培养基(lL)

[0178]

[0179] 注:葡萄糖溶液单独配制和灭菌(12l°C，l5min)，20mg/mlX-α-Gal是用二甲基甲酰胺溶制的。除葡萄糖和X-α-Gal以外的药品加入去离子水948ml，调节PH至6.5，12l°C高压灭菌15min，再加入浓度为质量体积比40%的葡萄糖溶液50ml(葡萄糖最终含量为2%)和20mg/mlX-α-Gal2ml。

[0180] (11)5O×TAE电泳缓冲液(lL)

[0181]

[0182] 注:使用时稀释50倍

[0183] (12)1%琼脂糖胶

[0184]

[0185] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。