呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体及制备方法和应用，杂交瘤细胞SEM/4G6，CCTCC，CCTCCNO:C201150。其步骤：A、将半抗原CPSEM与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；B、将半抗原CPSEM与卵清蛋白偶联得到包被原；C、利用步骤A的免疫原制备得到保藏号为CCTCCNO:C201150杂交瘤细胞株SEM/4G6所分泌的单克隆抗体；D用步骤B的包被原包被固相载体；E、将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物；F、对待测物进行酶联免疫检测。试剂盒在动物可食性组织中呋喃西林残留检测中的应用。方法简便、快速、灵敏、准确，可用于开发能检测动物可食性组织中氨基脲残留的酶联免疫试剂盒。

权利要求

1.一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体，其特征在于：该抗体由杂交瘤细胞SEM/4G6，CCTCC，CCTCC NO:C201150分泌。

2.一种呋喃西林残留标示物氨基脲的检测方法，其步骤是：A.将半抗原CPSEM与卵清蛋白偶联得到包被原；

B.利用保藏号为CCTCC NO:C201150杂交瘤细胞株SEM/4G6制备单克隆抗体；

C.用步骤A的包被原包被固相载体；

D.将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物；

E.对步骤D的待测物进行酶联免疫检测；

步骤D中，待测样品的处理步骤具体如下：

(1)称取2.00±0.02g均质的组织样品于50mL具塞离心管内，加入4mL双蒸水，1M盐酸溶液0.5mL；和10mM苯甲醛200uL，漩涡震荡1min，50℃超声2h；

(2)分别加入0.1M K2HPO45mL,1M NaOH0.5mL；和6mL的乙酸乙酯，涡旋2min。在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min,取出1.5mL的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气吹干；

(3)用1mL正已烷溶解干燥物，然后加入1mL PBS,涡旋2min,室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；

(4)取下层水相50uL用于分析。

步骤D样品稀释液的组分及配比为：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g，加双蒸水定容至1000mL。

3.权利要求1所述的一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体的试剂盒，其特征在于：⑴包被有包被原CPSEM-OVA的酶标板；

⑵CPSEM标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4μg/L；

⑶SEM/4G6细胞株单克隆抗体工作液；

⑷辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

⑸浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O29.0g，KCl2.0g，加双蒸水至1000mL；

⑹浓缩洗涤液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O29.0g，KCl2.0g，Tween-205mL，加双蒸水至1000mL；

⑺底物混合液：准确吸取底物B液10mL，加入100μL底物A液，混匀，现配现用；

⑼终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体的试剂盒，其特征在于：所述的酶标板的制备方法，其步骤是：⑴包被：用碳酸盐缓冲液将CPSEM-OVA稀释成0.2μg/mL包被原溶液，吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h；

⑵洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次；

⑶封闭：吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h；

⑷洗板：甩出封闭液，吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次；

⑸烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h；

⑹封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装；

所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

5.权利要求3所述的一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体的试剂盒在动物可食性组织中呋喃西林残留检测中的应用。

说明书

呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能检测呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)的单克隆抗体，同时还涉及一种能检测呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)的单克隆抗体的制备方法，还涉及一种能检测呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)的单克隆抗体的用途。

背景技术

[0002] 呋喃西林属于硝基呋喃类药物，具有5-硝基呋喃环的基本结构，是一种广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原虫等均有效，曾在养殖业中被广泛使用。毒理学试验证明呋喃西林及其代谢物均有显著的致癌、致突变等严重毒性作用。欧盟已于1993年禁止呋喃西林在养殖业中使用，我国发布的193号公告《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》将硝基呋喃类药物列入禁用清单。

[0003] 由于呋喃西林价格便宜、药效快，目前仍有很多养殖户违禁使用。我国对硝基呋喃类药物的残留监控形势依然严峻，必须尽快完善筛选检测体系，以保证公众的生命健康安全和促进国内外经济贸易的顺利进行。

[0004] HPLC-MS/MS是目前公认的硝基呋喃类药物药物残留检测的确证手段，对牛奶、蛋类、猪肉、禽肉、及虾肉等样品的检测限可达0.1～0.3μg/kg。虽然该方法的灵敏度和精确度均很高，但需要配备昂贵的仪器和专业技术人员，不适合室外操作及高通量筛选。

[0005] 通常用于高通量筛选的免疫学检测方法基于抗原抗体的生物学反应，灵敏度高并且易于操作。该类药物已有的免疫学检测报道均为多克隆抗体，Cooper(2007)及Vass(2008a，b)等作者制备兔多克隆抗体，抗体的IC50值(以SEM计算浓度)分别为0.86μg/L和0.14μg/L，采用直接或间接竞争ELISA方法对鸡肉、猪肉、蛋类等样品中SEM残留进行检测的最低检测限分别为0.21μg/kg、0.11μg/kg和0.13μg/kg。多克隆抗体虽灵敏度高，但兔个体差异性导致其在标准化生产过程中存在缺陷，不能实现长期连续的标准化生产，给检测技术的标准化建立带来困难。

发明内容

[0006] 本发明的目的是在于提供了一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能检测呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)的单克隆抗体)，该抗体能特异性识别SEM，与其他类似物无交叉反应。

[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能检测呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)的单克隆抗体)的制备方法，本发明制备的单抗可识别氨基脲，方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，可用于开发能检测动物可食性组织中氨基脲残留的酶联免疫试剂盒，该方法是由半抗原SEM衍生物(CPSEM)与牛血清白蛋白偶联制备的免疫原免疫小鼠，经细胞融合与克隆筛选后，获得了能特异性分泌SEM单克隆抗体的细胞株杂交瘤细胞株SEM/4G6，CCTCC NO：C201150。

[0008] 本发明的第三个目的是在于提供了一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能识别呋喃西林残留标示物SEM)的试剂盒，该试剂盒能广泛应用于动物可食性组织中呋喃西林的残留检测，准确提供动物可食性组织中SEM的残留量信息。

[0009] 本发明的第四个目的是在于提供了提供了一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能识别呋喃西林残留标示物SEM)的试剂盒在动物可食性组织中呋喃西林残留检测中的应用，为动物源性食品中呋喃西林的残留监控提供了可靠的技术手段。

[0010] 本发明通过以下技术方案实现：

[0011] 为了实现本发明的任务，发明人制备了一种能识别SEM的单克隆抗体，其特征在于，它是由杂交瘤细胞SEM/4G6所分泌的。

[0012] 上述杂交瘤细胞SEM/4G6，保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201150。

[0013] 所用的免疫原是由半抗原CPSEM与牛血清白蛋白偶联制备的。

[0014] 进一步，本发明提出了一种适用于SEM残留检测的酶联免疫(ELISA)方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理等步骤，一种能识别呋喃西林残留标示物SEM的单克隆抗体的制备方法，其步骤是：

[0015] A、将半抗原CPSEM与牛血清白蛋白采用活性酯法进行偶联合成免疫原；

[0016] B、将半抗原CPSEM与卵清蛋白采用活性酯法进行偶联合成包被原；

[0017] C、利用步骤A的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201150杂交瘤细胞株SEM/4G6所分泌的单克隆抗体；

[0018] D、用步骤B的包被原包被固相载体(如酶标板)；

[0019] E、将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物；

[0020] F、对步骤E的待测物进行酶联免疫检测；

[0021] 步骤E样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水定容至1000mL。

[0022] 一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能识别呋喃西林残留标示物SEM的单克隆抗体)的试剂盒，其组成如下：

[0023] (1)包被有包被原CPSEM-OVA的酶标板；

[0024] (2)CPSEM标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4μg/L；

[0025] (3)SEM/4G6细胞株单克隆抗体工作液；

[0026] (4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

[0027] (5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl2.0g，加双蒸水至1000mL；

[0028] (6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，Tween-205mL，加双蒸水至1000mL

[0029] (7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

[0030] (9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

[0031] 一种酶标板的制备方法，其步骤是：

[0032] (1)包被：用碳酸盐缓冲液将CPSEM-OVA稀释成0.2μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

[0033] (2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

[0034] (3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

[0035] (4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

[0036] (5)烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

[0037] (6)封装：酶标板烘干后和干燥剂(硅胶、无水氯化钙)一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

[0038] 一种呋喃西林残留标示物氨基脲单克隆抗体(能识别呋喃西林残留标示物SEM)的试剂盒在检测动物可食性组织中SEM残留中的应用，其步骤是：

[0039] (1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

[0040] (2)加标准液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

[0041] (3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

[0042] (4)加酶标抗体液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

[0043] (5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

[0044] (6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min。

[0045] (7)加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

[0046] 发明人以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组装成能同时检测多种动物组织中SEM残留的酶联免疫试剂盒，对酶联免疫方法进行了验证，实现了本发明的任务，从而完成了本发明。

[0047] 本发明的主要优点是：

[0048] 1.本发明制备的单克隆抗体能够识别CPSEM，而CPSEM是呋喃西林的残留标示物SEM的衍生物；

[0049] 2.本发明设计的半抗原合成工艺简便，合成效率高，所用的试剂是毒性较小的对醛基苯甲酸，对操作者身体健康危害较小。

[0050] 3.本发明试剂盒样品前处理使用的衍生试剂是苯甲醛，较其他常用的衍生试剂邻硝基苯甲醛相比，具有毒性小的优点。

附图说明

[0051] 图1为一种呋喃西林残留标示物SEM残留ELISA标准曲线图。

[0052] 其中，x轴以100倍添加浓度的对数值绘制，y轴以各药物浓度下测定孔与零药物孔的检测OD值的比值(B/B0)绘制。

具体实施方式

[0053] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

[0054] 实施例1：半抗原SEM衍生物(CPSEM)的合成

[0055] 将呋喃西林残留标示物SEM与对羧基苯甲醛(4-CBA)在三蒸水和N，N-二甲基甲酰胺的介质中进行反应，具体过程如下：称取SEM·HCl 0.15g和4-CBA 0.23g，分别加入4mL三蒸水和DMF溶解，用Na2CO3调节SEM水溶液至中性后，缓慢加至4-CBA溶液中，室温(20-25℃，以下相同)反应3h。反应终止，抽滤，用三蒸水和无水乙醇分别洗3次，得到淡黄色固体，干燥后冷藏保存，此为半抗原CPSEM。

[0056] 实施例2：完全抗原的合成

[0057] 免疫原的合成将CPSEM与牛血清白蛋白采用活性酯法进行偶联合成免疫原，具体过程如下：称取CPSEM 20.7mg溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)14.4mg和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)27.5mg，室温(20-25℃，以下相同)搅拌反应过夜。10000r/min离心10min，取上清备用，此为A液。称取牛血清白蛋白(BSA)167mg溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)10mL中备用，此为B液。磁力搅拌下将A液逐滴加入到B液中，冰浴反应10h，10000r/min离心15min，收集上清液。将上清液在4℃下用磷酸盐缓冲液(pH7.4)透析3d。分装、冻干，得到免疫原，命名为CPSEM-BSA，于-20℃保存。

[0058] 包被原的合成：将CPSEM与卵清蛋白采用活性酯法进行偶联合成包被原，具体过程如下：称取CPSEM 20.7mg溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)14.4mg和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)27.5mg，室温搅拌反应过夜。10000r/min离心10min，取上清备用，此为C液。称取卵清蛋白(OVA)200mg溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)10mL中备用，此为D液。磁力搅拌下将C液逐滴加入到D液中，冰浴反应10h，10000r/min离心
15min，收集上清液。将上清液在4℃下用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)透析3d。分装、冻干，得到包被原，命名为CPSEM-OVA，于-20℃保存。

[0059] 实施例3：单克隆抗体的制备

[0060] 杂交瘤细胞株的制备：参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版中的方法：以实施例2制备的CPSEM-BSA偶联物免疫Balb/C小鼠，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在体积比为75％的酒精中浸泡5min消毒。

[0061] 将3～5×107SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到50mL离心管中，混匀，1500r/min离心5min。弃上清，并用灭菌的滤纸吸干。轻轻敲击管底，使管底细胞松动。将离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入预温至37℃的50％PEG 0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌30sec，静置1min。

[0062] 缓慢加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为：第1min逐滴加1mL，第2min加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边轻摇离心管。缓慢加入40mL RPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀，1500r/min离心5min。弃上清，10mL滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150μL/孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

[0063] 从融合当天起计为0d，3d后每个培养孔滴加1滴HAT培养基，5d后有规律地每隔2d吸去1/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4d，开始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融合率。在融合后6～7d，待孔内细胞长至孔底1/10～1/5时，取培养上清，用间接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置0孔和200μg/L药物孔，每孔中加入50μL培养上清进行间接竞争ELISA检测。

[0064] 选择4～6个上清检测呈强阳性且只有1～2个形态良好集落生长的孔，用有限稀释法进行亚克隆。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌SEM特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株.。申请人将该杂交瘤细胞命名为SEM/4G6，并于2011年6月29日送交位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201150。

[0065] 腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCCNO：
6
C201150的杂交瘤细胞株SEM/4G6扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×10 个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。

[0066] 实施例4：ELISA检测方法的建立

[0067] ELISA条件的优化根据方阵滴定初步选择抗原包被浓度和抗体稀释度。将包被原用碳酸盐缓冲液依次倍比稀释成8个浓度，每个浓度包被1列。将腹水抗体用一抗稀释液依次倍比稀释成8个梯度。测定时，首先每孔加入PBS 50μL，然后按行加入8个稀释度的抗体，50μL/孔。孵育30min，洗板，加入酶标二抗，100μL/孔。继续孵育30min，洗板，加入底物，100μL/孔。显色15min，终止反应，用酶标仪检测波长450nm处的吸光度值(OD450nm)。挑选OD值接近2.0、相邻孔OD值相差最显著的包被原浓度和抗体稀释度的组合，为最佳包被原浓度的确定提供依据。方阵滴定结果如表1所示，(0.1，16000)和(0.2，32000)两孔的OD值与相邻孔的差别较大，是包被原浓度和抗体稀释度的较优组合。

[0068] 表1SEM/4G6单克隆抗体方阵滴定

[0069]

[0070] 分别将包被原稀释至0.1μg/mL和0.2μg/mL，包被酶标板。以1∶16000和1∶32000为相应抗体稀释度，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50(见表2)。
由于0.2μg/mL包被浓度对应的IC50值较小，抗体表现的灵敏度更高，因此挑选包被浓度
0.2μg/mL作为抗原最佳包被浓度。

[0071] 表2最佳包被浓度优化

[0072]

[0073] 以0.2μg/mL包被浓度包被酶标板，将抗体稀释度等差设计为1∶26000、1∶28000、1∶30000、1∶32000，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50(见表3)。
从表13中确定抗体最佳稀释度为1∶30000。

[0074] 表3最佳抗体稀释度优化

[0075]

[0076]

[0077] 标准曲线的建立用DMF将CPSEM药物配制成1mg/mL的母液，然后用PBS将其依次稀释至4、2、1、0.5、0.25、0μg/L等5个浓度，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50。如图1所示，本发明标准曲线的回归方程为y＝-0.516x+1.4938，相关指数r＝0.9942，IC50值为0.848±0.0757μg/L(n＝5)，线性范围为0.25～4μg/L。

[0078] 特异性用交叉反应率反映方法的特异性。分别将硝基呋喃类药物、残留标示物及其衍生物、卡巴胂、氯霉素、磺胺二甲嘧啶、环丙沙星等竞争物倍比稀释成梯度浓度，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50。将CPSEM的IC50值与竞争物的IC50值相比，即得到竞争物的交叉反应率(见表4)。结果表明，本研究所制备的单克隆抗体对氨基脲衍生产物CPSEM有较高特异性，对同类其他药物及其他类药物均无交叉反应。

[0079] 表4本发明试剂盒的交叉反应率

[0080]

[0081] 实施例5：本发明ELISA检测试剂盒的组装

[0082] 试剂盒组成成分

[0083] (1)包被有包被原CPSEM-OVA的酶标板；

[0084] (2)CPSEM标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4μg/L；

[0085] (3)SEM/4G6细胞株单克隆抗体工作液；

[0086] (4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

[0087] (5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl2.0g，加双蒸水至1000mL；

[0088] (6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，Tween-205mL，加双蒸水至1000mL

[0089] (7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

[0090] (9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

[0091] 一种酶标板的制备方法，其步骤是：

[0092] (1)包被：用碳酸盐缓冲液将CPSEM-OVA稀释成0.2μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

[0093] (2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

[0094] (3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

[0095] (4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

[0096] (5)烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

[0097] (6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

[0098] 实施例6：

[0099] 一种能识别呋喃西林残留标示物SEM的试剂盒在检测动物可食性组织中SEM残留量中的应用，其步骤是：

[0100] 试剂配制

[0101] 洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用双蒸水10倍稀释后使用。

[0102] 样品稀释液：准确称取NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KCl 0.2g于500mL烧杯中，加少量双蒸水溶解，双蒸水定容至1000mL。

[0103] 1M盐酸：准确吸取浓盐酸8.2ml，双蒸水定容至100mL。

[0104] 10mM苯甲醛溶液配制：准确称取苯甲醛1.06g，甲醇定容至1000mL。

[0105] 0.1M K2HPO4溶液：准确称取K2HPO4·3H2O 22.8g，加少量双蒸水溶解，双蒸水定容至1000mL。

[0106] 1M NaOH：准确称取NaOH 4g，加少量蒸馏水溶解，蒸馏水定容至100mL。

[0107] 底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1∶100的比例混匀，现配现用。

[0108] 组织样品处理

[0109] (1)称取2.00±0.02g均质的组织样品于50mL具塞离心管内，加入4mL双蒸水，1M盐酸溶液0.5mL；和10mM苯甲醛200uL，漩涡震荡1min，50℃超声2h；

[0110] (2)分别加入0.1M K2HPO45mL，1M NaOH 0.5mL；和6mL的乙酸乙酯，涡旋2min。在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min，取出1.5mL的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气吹干；

[0111] (3)用1mL正己烷溶解干燥物，然后加入1mL PBS，涡旋2min，室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；

[0112] (4)取下层水相50uL用于分析。(稀释倍数：2)。

[0113] ELISA测定程序

[0114] (1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

[0115] (2)加标准液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

[0116] (3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

[0117] (4)加酶标抗体液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

[0118] (5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

[0119] (6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min。

[0120] (7)加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

[0121] 结果判定

[0122] 将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100％，即为抑制率。在0.25～4μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中SEM的残留浓度。

[0123] (公式1)

[0124] 实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

[0125] 本发明试剂盒的灵敏度

[0126] 以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白组织样品，进行ELISA检测，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值 将 代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)，结果见表5。

[0127] 表5SEM在各种动物组织样品中的最低检测限

[0128]

[0129] 本发明试剂盒的精密度

[0130] 将CPSEM标准品稀释成0、0.25、0.5、1、2、4μg/L 5个浓度，各浓度3个平行孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，将各标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，以此判断试剂盒的精密度，结果见表6。

[0131] 表6本发明试剂盒的板内与板间变异系数

[0132]

[0133]

[0134] 本发明试剂盒的准确度

[0135] 在匀质好的各种组织样品中加入SEM标准溶液，使其终浓度分别为0.5μg/kg和1μg/kg。每个浓度5个平行样，然后进行样品处理，ELISA测定药物浓度，重复3批，计算回收率，回收率按公式3计算，并计算批内和批间变异系数，结果见表7～10。可见，本发明试剂盒的添加回收均在60％～130％，批内批间变异＜20％，表明准确度良好。

[0136] (公式2)

[0137] 表7猪肌肉中SEM添加回收率及变异系数

[0138]

[0139]

[0140] 表8鱼肉中SEM添加回收率及变异系数

[0141]

[0142] 表9虾肉中SEM添加回收率及变异系数

[0143]

[0144] 表10蜂蜜中SEM添加回收率及变异系数

[0145]