刺参假单胞菌HS1菌株及用途转让专利
申请号 : CN201310029081.3
文献号 : CN103289913B
文献日 : 2015-03-11
发明人 : 许淑芬 , 刘小林 , 常亚青 , 费世洲 , 王高学 , 李丹 , 冷晓飞 , 邹闯
申请人 : 大连海宝渔业有限公司
摘要 :
本发明公开一种刺参假单胞菌HS1菌株（CCTCC M2012512），属于假单胞菌，菌株代码HS1，拉丁文学名Pseudomonaselyacovii，已2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC NO：M2012512，可作为刺参饲料添加剂使用。能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促进刺参消化吸收的能力，可提高刺参的生长性能；在水体中能够存活并且对藻类无杀灭作用；大量地增殖，可与水体中病原菌竞争营养以及分解了水体中的有机质，起到净化水质的作用；是真正意义上的可定植优势菌，可以替代化学药物进行疾病防治且不破环生态环境。
权利要求 :
1.一种刺参假单胞菌HS1菌株，分类命名为刺参Elyacovii 假单胞菌(Pseudomonas elyacovii)HS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012512。
2.根据权利要求1所述的刺参假单胞菌HS1菌株，其特征在于：所述刺参假单胞菌HS1菌株的16S rDNA的基因片段序列如下：
CAGGGGCGGGCGGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTTAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTAAAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGCTCTTCGGAGTTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCCGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTTCTAGAGATAGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTAGGGAGGACGTTACCACGGGAGGGTTCCCTGA 。
3.一种如权利要求1或2所述的刺参假单胞菌HS1菌株作为制备刺参饲料添加剂的用途。
说明书 :
刺参假单胞菌HS1菌株及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从刺参肠道优势菌群中分离的益生菌，尤其是一种可作为刺参饲料添加剂的刺参假单胞菌HS1菌株及用途。技术背景
[0002] 刺参(Apostichopus japonicus) 是八大海珍之一，素有“海中人参”之称，具有补肾益精、生肌养血、延缓机体衰老、保持肌肤光滑等诸多功效，自古以来，就被人们作为一种药食同源的滋补佳品。随着市场需求的激增，近年来刺参已成为我国海域重要的养殖品种之一，创造了巨大的经济效益和社会效益，仅2006年，全国刺参养殖面积就已达到84200公顷，产量突破70000吨，直接经济效益超100亿元。然而随着养殖集约化程度的不断加深，水产养殖环境日益恶化以及刺参种质资源退化等原因，养殖刺参各阶段的病害频发严重制约了该产业的健康持续发展。
[0003] 传统的病害防治手段主要是使用抗生素及化学药物，不仅会破坏动物机体正常的菌群平衡，导致动物机体免疫功能下降，而且会导致动物体内耐药菌株的增加，进一步加大病害防治的难度。长期以来，抗生素及化学药物的滥用，对生态环境和人类健康构成了很大的威胁，药物残留带来的食品安全问题也层出不穷。在保障食品安全、追求绿色生态养殖呼声越来越高的今天，益生菌作为一种高效安全的病害防治手段受到越来越多的关注。益生菌在抑制病原菌、调节肠道菌群平衡、帮助消化和增强机体免疫力、改良水质等方面发挥着显著作用。同抗生素和化学药物相比，益生菌取材于动物体内或者其养殖环境，具有高效安全、天然无污染等优点。
[0004] 目前在国内水产养殖中应用的益生菌主要有光合细菌，拮抗菌，营养和产消化酶微生物群（乳酸菌、酵母菌等）以及改善水质菌群（硝化细菌、反硝化菌等）。这些细菌大多源自陆生动物或借鉴陆生动物思路研制，应用于水产中存在难以在养殖环境中存活及在动物体内难以定植的不足，其功效难以发挥。益生菌的筛选原则在国际上已经被广泛接受：必须对宿主无害；能够在宿主体内定植并繁殖；能够到达需要其发挥功能的部位；在体外和体内的实际效果要一致；不含有致病基因及耐药基因。益生菌种的内源和外源是影响益生菌效果的重要因素，从生物体内或其生存的天然环境中筛选益生菌是最好同时也是最有效的途径，Gate认为健康动物中正常的优势菌或次优势菌可以作为益生菌的来源。优势菌群具有可以定植并对宿主及环境无害的优点，极具开发为高效可定植益生菌的潜力。而长期以来，水产动物专业益生菌的筛选研究多集中于肠道菌群鉴定及一些已知的常见益生菌（乳酸菌、芽孢杆菌等）的筛选，忽略了肠道优势菌群的作用。
发明内容
[0005] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可作为刺参饲料添加剂的刺参假单胞菌HS1菌株及用途。
[0006] 本发明的技术解决方案是：一种刺参假单胞菌HS1菌株（CCTCC M 2012512），属于假单胞菌，菌株代码HS1，拉丁文学名Pseudomonas elyacovii，已2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC M 2012512。
[0007] 所述的刺参假单胞菌HS1菌株，其特征在于：所述刺参假单胞菌HS1菌株的16S rDNA的基因片段序列如下：
[0008] CAGGGGCGGGCGGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTTAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTAAAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGCTCTTCGGAGTTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCCGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTTCTAGAGATAGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTAGGGAGGACGTTACCACGGGAGGGTTCCCTGA
[0009] 一种上述刺参假单胞菌HS1菌株作为动物饲料添加剂的用途。
[0010] 与现有技术相比，本发明的假单胞菌HS1菌株具有以下优点：
[0011] 1）能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促进刺参消化吸收的能力，可提高刺参的生长性能；
[0012] 2）在水体中能够存活并且对藻类无杀灭作用；大量地增殖，可与水体中病原菌竞争营养以及分解了水体中的有机质，起到净化水质的作用；
[0013] 3）是真正意义上的可定植优势菌，能够调节肠道正常微生态平衡，提高机体免疫力，在肠道内能够同病原菌竞争黏附位点，可以替代化学药物进行疾病防治且不破环生态环境。
附图说明
[0014] 图1是依据16S rDNA序列构建的刺参假单胞菌HS1菌株的系统进化树图。
[0015] 菌种保藏日期：2012年12月6日
[0016] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）
[0017] 保藏号：CCTCC M 2012512。
具体实施方式
[0018] 1．刺参假单胞菌HS1菌株（CCTCC M 2012512），属于假单胞菌，菌株代码HS1，拉丁文学名Pseudomonas elyacovii，已2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC M 2012512。
[0019] 2．刺参假单胞菌HS1菌株（CCTCC M 2012512）的制备方法：
[0020] 1）刺参来源
[0021] 采自大连海域。
[0022] 2）菌株的分离与纯化
[0023] 用75 % 酒精冲洗刺参体表。在无菌条件下，用剪刀剪开刺参体腔，取出刺参消化道，用0.9 % 生理盐水冲洗肠道外壁，挤出肠道内容物，将肠壁置于无菌试管中，称重后将肠壁置于研钵中，用5 mL无菌生理盐水充分研磨均匀为样品。用无菌生理盐水对样品进行-6倍比稀释至10 ，各稀释度样品均用旋窝振荡器震荡均匀。选取合适梯度，分别取100 μL涂布2216E平板，每个平板3个重复，28℃培养5 d。挑取不同形态的菌株在2216E培养基上多次划线分离纯化，直到单一菌落为止。将得到的纯种菌株保存于 -80℃备用。
[0024] 所述的2216E培养基的组分及配比为：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01 g，海水1000 mL，pH 7.2~7.4，121℃灭菌20 min。
[0025] 刺参假单胞菌HS1菌株的鉴定：
[0026] 1）形态学的特征
[0027] 刺参假单胞菌HS1菌株在2216E培养基上生长呈红棕色，表面光滑，生长良好。培养特征见表1。
[0028] 表1 刺参假单胞菌HS1菌株的培养特征
[0029]编号 形状 颜色 光滑度 凸起程度 边缘 透明度 大小 菌体特征 革兰氏染色
HS1 圆状 红棕色 光滑湿润 高起 全缘 不透明 6mm 杆状单个 阴性
HS1 圆状 红棕色 光滑湿润 高起 全缘 不透明 6mm 杆状单个 阴性
[0030] 2）、刺参假单胞菌HS1菌株的分子生物学鉴定。
[0031] (1) 刺参假单胞菌HS1菌株16S rDNA的基因片段序列测定
[0032] 将刺参假单胞菌HS1菌株纯培养物接种于普通肉汤，28℃摇床培养48 h，离心收集菌体，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。扩增刺参假单胞菌HS1菌株16S rDNA的基因采用通用引物，正向引物为：
[0033] 5＇－CAGGCCTAACACATGCAAGTC－3＇ （对应于E．coli 16S rDNA 5＇ 43-63f），反向引物为： 3＇－GGGCGGWGTGTACAAGGC－5＇（对应于E．coli 16S rDNA 3＇1405-1387r），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系（50 μL）：Mix
25 μL，ddH2O 19 μL，正向引物 1 μL, 反向引物1 μL，DNA 4 μL。PCR反应条件：在
95℃预变性2 min，进入循环扩增阶段：95℃ 变性1 min→ 55℃复性30 s → 72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃ 延伸10 min。结束反应后， PCR产物用1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收，上海生工生物工程技术服务有限公司测序。假单胞菌HS1菌株的16S rDNA的基因片段序列长度是1433 bp。
25 μL，ddH2O 19 μL，正向引物 1 μL, 反向引物1 μL，DNA 4 μL。PCR反应条件：在
95℃预变性2 min，进入循环扩增阶段：95℃ 变性1 min→ 55℃复性30 s → 72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃ 延伸10 min。结束反应后， PCR产物用1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收，上海生工生物工程技术服务有限公司测序。假单胞菌HS1菌株的16S rDNA的基因片段序列长度是1433 bp。
[0034] 16S rDNA序列信息：
[0035] CAGGGGCGGGCGGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTTAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTAAAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGCTCTTCGGAGTTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCCGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTTCTAGAGATAGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTAGGGAGGACGTTACCACGGGAGGGTTCCCTGA
[0036] （2）刺参假单胞菌HS1菌株序列分析和系统进化树的构建
[0037] 将测定的刺参假单胞菌HS1菌株16S rDNA序列，与GenBank数据库中的所有已测定的原核生物16S rDNA进行比对，依据同源序列搜索结果，下载数株同代表菌株相似度最高的菌株的16S rDNA序列，与代表菌株一同根据Clustal W方法进行匹配排列（Alignment），用MEGA5.0软件中的 Kimura2-Parameter Distance模型以及neighbour-joining分析法构建得到系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。刺参假单胞菌HS1菌株的系统发育树见图1。
[0038] 试验例1：刺参假单胞菌HS1菌株产酶能力分析
[0039] 将刺参假单胞菌HS1菌株点种于蛋白酶选择培养基、淀粉酶选择培养基和脂肪酶选择培养基上，28℃培养48 h。若菌落周围产生透明环，说明菌株具有相应产酶活力，测量并记录菌落周围透明环与菌落直径比值。相关培养基配方如下：
[0040] 蛋白酶选择培养基：酪蛋白10 g，酵母膏1 g，琼脂16 g，人工海水1000 mL；调pH至7.4。121.5℃，灭菌20 min。
[0041] 淀粉酶选择培养基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，琼脂16 g，人工海水1000 mL；调pH至7.4。121.5℃，灭菌20 min。
[0042] 脂肪酶选择培养基：蛋白胨10 g，吐温－80 10 mL，CaCl2•7H20 0.1 g，琼脂9 g，人工海水1000 mL；调pH至7.4。121.5℃，灭菌20 min。
[0043] 实验结果见表2。
[0044] 表2 刺参假单胞菌HS1菌株产酶能力分析
[0045]
[0046] 由表2可知，刺参假单胞菌HS1菌株能分泌蛋白酶、淀粉酶以及脂肪酶，具有促进消化吸收的能力，能够提高刺参养殖过程中饲料的利用率，促进刺参的健康生长。
[0047] 试验例2：刺参假单胞菌HS1菌株的安全性试验
[0048] （1）溶血性试验：将无菌的山羊血平板复温至25℃，再将已活化的假单胞菌HS1菌株接种于山羊血平板培养基上，25℃恒温培养箱中培养48 h后，观察发现菌落周围并未出现溶血环，表明该细菌无溶血能力。
[0049] （2）浸浴试验：选取小规格健康稚参暂养在6个盛有10 L自然海水的玻璃缸内，每缸放20头稚参。实验分为试验组和对照组两组，每组三个重复，试验组加入假单胞菌HS17
菌株的菌悬液使浓度达到10 cfu/mL；对照组为无菌海水。试验期间水温恒定并持续曝气，不换水不投饵，持续7天，试验组和对照组刺参，均未出现死亡，解剖试验组没有病理现象。
菌株的菌悬液使浓度达到10 cfu/mL；对照组为无菌海水。试验期间水温恒定并持续曝气，不换水不投饵，持续7天，试验组和对照组刺参，均未出现死亡，解剖试验组没有病理现象。
[0050] 说明刺参假单胞菌HS1菌株对刺参没有毒性，可安全使用。
[0051] 试验例3：刺参假单胞菌HS1菌株对刺参生长试验及生产应用效果
[0052] 将刺参假单胞菌HS1菌株接种于海洋2216E固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，用生理盐水洗刮板，将所得菌悬液，用血球计数板测定浓度后备用。实验分为两组，9
一组为试验组即按10 cfu/g 饲料比例加菌投喂，另一组为对照组仅用饲料投喂，每组设置三个重复。选取规格大小比较均匀一致的刺参，其初始重量为495头/斤，投入6个2吨容量的水池中，进行为期60天的生长实验。各池海参初始总重量为1397 g , 实验所用饲料为公司现有饲料，实验条件为：从海洋中抽取海水经沙滤后实验所用海水，养殖过程中水温
18.5℃~20.8 ℃，盐度31~34 ‰，pH 7.5 ~ 7.9，溶解氧不低于5 mg/L；每天下午16：00点饲喂，投饵量为体重的3~5 %；次日12:00点流水换水1/4,每10天倒池一次。饲养实验结束后，统计各池刺参总重量，取样统计刺参重量并计数。
一组为试验组即按10 cfu/g 饲料比例加菌投喂，另一组为对照组仅用饲料投喂，每组设置三个重复。选取规格大小比较均匀一致的刺参，其初始重量为495头/斤，投入6个2吨容量的水池中，进行为期60天的生长实验。各池海参初始总重量为1397 g , 实验所用饲料为公司现有饲料，实验条件为：从海洋中抽取海水经沙滤后实验所用海水，养殖过程中水温
18.5℃~20.8 ℃，盐度31~34 ‰，pH 7.5 ~ 7.9，溶解氧不低于5 mg/L；每天下午16：00点饲喂，投饵量为体重的3~5 %；次日12:00点流水换水1/4,每10天倒池一次。饲养实验结束后，统计各池刺参总重量，取样统计刺参重量并计数。
[0053] 试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析（ONE-WAY ANVOA）进行统计分析，均值采用LSD法进行多重比较,试验结果见表3
[0054] 表3 刺参假单胞菌HS1菌株对刺参生长性能和存活率的影响
[0055]组别初始体重（g） 终末体重（g） 增重率（%） 初始规格（头/斤） 终末规格（头/斤） 存活率（%）处理1397 2675.33±103.78* 91.51±7.43* 495 236 91.30*
对照1397 2201±164.67 57.55±11.79 495 275 87.53
对照1397 2201±164.67 57.55±11.79 495 275 87.53
[0056] 注：*表示差异显著（p<0.05）
[0057] 从表3中可以看出，刺参假单胞菌HS1菌株添加后能够显著提高刺参生长率(P<0.05)，平均增重率同比提高33.96 %，两组刺参成活率均较高，但添加假单胞菌HS1后仍能提高刺参的成活率(P<0.05)。
[0058] 试验例4：刺参假单胞菌HS1菌株对刺参免疫机能的影响
[0059] 实验分为两组，一组为试验组即按109 cfu/g 饲料比例加菌投喂，另一组为对照组仅用饲料投喂，每组设置三个重复。选用70 L 容量的泡沫箱，将9 g左右规格刺参各30头置于6个箱中进行为期28天的饲喂实验。实验水温控制在17~20℃，连续充气，不间断采用适量淡水补充水分蒸发减少的水量。投饵量控制在刺参体重的3 % 左右，并依据刺参摄食9
情况调整，投菌量按10 cfu/g饲料比例。实验每七天采样一次，测定各组刺参免疫指标。采样时，每组随机抽取三头刺参，腹腔解剖取体腔液，吸取抗凝剂至与体腔液的体积比为l:1，所得抗凝剂稀释过的体腔液，一部分直接用于体腔细胞计数、呼吸爆发活性的测定;另一部分用低温超速离心机 3000 g 4 ℃离心10 min得到血清，保存于-20 ℃用于体液免疫指标酸性磷酸酶(ACP)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、血清溶菌酶(LZM)的测定。体液免疫指标的测定，均采用南京建成生物工程研究所生产的相应指标检测试剂盒测定，操作过程按照使用说明进行。细胞免疫指标测定方法如下：
情况调整，投菌量按10 cfu/g饲料比例。实验每七天采样一次，测定各组刺参免疫指标。采样时，每组随机抽取三头刺参，腹腔解剖取体腔液，吸取抗凝剂至与体腔液的体积比为l:1，所得抗凝剂稀释过的体腔液，一部分直接用于体腔细胞计数、呼吸爆发活性的测定;另一部分用低温超速离心机 3000 g 4 ℃离心10 min得到血清，保存于-20 ℃用于体液免疫指标酸性磷酸酶(ACP)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、血清溶菌酶(LZM)的测定。体液免疫指标的测定，均采用南京建成生物工程研究所生产的相应指标检测试剂盒测定，操作过程按照使用说明进行。细胞免疫指标测定方法如下：
[0060] 1．血细胞计数：取50 μL体腔液涡旋混匀，利用血球计数板在光学显微镜400倍下直接计数，计算出每毫升体腔液中体腔细胞数目。
[0061] 2．吞噬活性的测定：每个处理随机取两头刺参，在其背部注射0.2mg/mL的酵母悬液0.2 mL，四小时后腹腔解剖刺参取其体腔液，用等体积的抗凝剂稀释，直接在400倍光学显微镜下观察计数。吞噬率=发生吞噬的体腔细胞数/选定的体腔细胞数（100）。
[0062] 3．呼吸爆发活力的测定：呼吸爆发活力测定采取NBT还原法。首先，用RPMI 16406
培养基将体腔液稀释至2×10 cell/mL的浓度；将0.5 mL稀释的体腔液、0.5 mL NBT、11 μL佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、89 μL培养基一起加入无菌的1.5 mL离心管中；25℃放置1 h后，540 g低温离心10 min后倾去上清。加入1 mL 70 %甲醇终止反应后，使反应生成的月甲替(NBT 氧化产物)溶解于600 μL 2 M KOH和700 μL DMSO中，并于630 nm波长下测定OD值。
培养基将体腔液稀释至2×10 cell/mL的浓度；将0.5 mL稀释的体腔液、0.5 mL NBT、11 μL佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、89 μL培养基一起加入无菌的1.5 mL离心管中；25℃放置1 h后，540 g低温离心10 min后倾去上清。加入1 mL 70 %甲醇终止反应后，使反应生成的月甲替(NBT 氧化产物)溶解于600 μL 2 M KOH和700 μL DMSO中，并于630 nm波长下测定OD值。
[0063] 试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析（ONE-WAY ANVOA）进行统计分析，均值采用Tukey法进行多重比较,试验结果见表4
[0064] 表4 刺参假单胞菌菌株HS1对刺参免疫指标的影响
[0065]
[0066] 注：*表示差异显著（p<0.05）
[0067] 从表4可以看出，刺参假单胞菌菌株HS1能够提高刺参细胞免疫和体液免疫各项指标水平，增强刺参免疫力。