一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法

摘要

本发明公开了一种猪肉中5种主要致病菌五重PCR快速检测方法。该方法是先提取待测肉样中总细菌DNA，然后合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示引物；进行五重PCR反应，PCR产物用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果进行判断。用本发明方法检测猪肉中种食源性致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌O157:H7)的最低检测限分别为142、51、9、33和670cfu/mL。与传统细菌培养和单重PCR相比，本发明有检测速度快、成本低，灵敏度高、特异性强的特点，适合食品行业对大批量猪肉及猪肉产品在销售过程中致病菌的日常安全监测。

权利要求

1.一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取待测肉样中总细菌DNA，

（2）合成SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.12所示的5种目标菌株的特异性靶基因和细菌16S rRNA内控基因所对应的引物；

（3）以步骤（1）的总细菌DNA为模板，加入步骤（2）的6对引物，进行五重PCR反应，PCR产用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果判断待测肉样中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌；

其中，多重 PCR 25 μL反应体系如下：Premix Taq 5 U/μL，0.125 μL；10×PCR

2+

Buffer（Mg Free）2.5 μL，MgCl2（25 μM）1.5 μL；dNTP Mixture 2.5 mM ，2 μL；各引物浓度分别为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6均为0.24 μM、

10 μmol/L； SEQ ID NO.3和SEQID NO.4、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10均为0.16 μM、10 μmol/L； SEQ ID NO.7和SEQID NO.8为0.4 μM、10 μmol/L； SEQ ID NO.11和SEQID NO.12为0.04 μM、1 μmol/L；待测肉样中总细菌DNA模板2 μL，加灭菌蒸馏水至25 μL。

说明书

一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明所属食品中致病菌快速检测技术领域，涉及一种五重PCR快速检测方法，具体涉及猪肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌5种主要致病菌五重PCR快速检测方法。

背景技术

[0002] 当前全球食品安全主要问题之一就是食源性疾病，其中食源性致病菌的污染是其重要因素之一。猪肉及产品营养丰富，在生猪饲养、屠宰加工、包装、贮藏、运输、销售等过程中极易感染或污染各种致病性微生物，进而引发肉品安全问题。为确保肉品安全，需要大力加强肉品检测的力度，尤其是肉中食源性致病菌的快速检测技术。可传统检测技术，检测时间长，检测程序繁琐，己无法满足肉品行业对于食源性致病菌快速检测的要求。近年来，随着PCR技术的发展，针对某一种或一类致病菌的PCR检验方法已被建立起来，但是食品污染哪一种致病菌是不确定的，且往往不止污染一种致病微生物，一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费或者漏检。因此，急需建立一种快速、有效且高通量的PCR检测方法。多重PCR（multiplex PCR）技术实现了对多种菌的同步检测，更加节省时间和成本，是快速检测食源性致病菌的重要研究方向。

[0003] 多重PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种食源性致病菌的目的。目前，应用多重PCR对食品中常见致病菌进行检测已有较多报道，如二重（Blais BW,Phillippe LM.Food Control1995,4(6):211–214）、三 重（Elizaquivel P,Aznar R.Food Microbiol2008,25:705-713）、四 重（Koh SF,et al.Journal of Microbiological Methods2012,90:305–308），但是同时对食品中五种及以上食源性致病菌进行多重PCR检测报道较少。

[0004] 猪肉营养丰富，易污染多种食源性致病菌，猪肉中常检出的食源性致病菌主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森氏菌及单增李斯特菌等（Mataragas M,et al.International Journal of Food Microbiology2008,126:1-12）。目前，针对猪肉中上述常见食源性致病菌进行多重PCR的研究中，但有关小肠结肠炎耶耳森菌的多重PCR尚无报道。小肠结肠炎耶尔森菌是重要的食品致病菌，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。该菌广泛分布于猪、牛等家畜、家禽等，可以通过食品等途径传染给人，引起各种人畜共患性疾病。此外，已有研究证实，细菌16S rRNA基因作为内控基因可以验证所提取的DNA源自于食品中的细菌（Germini A,et al.Food Control2009,20:733-738）。然而，猪肉中食源性致病菌的五重以上PCR研究中，以细菌16S rRNA基因作为内控基因的研究未见报道。

发明内容

[0005] 本发明针对上述现有技术的不足，以细菌16S rRNA基因作为内控基因，建立猪肉中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌这五种食源性致病菌的多重PCR检测方法。为猪肉中致病菌的检测提供快速、灵敏度高、特异性强的多重PCR检测技术，为保障猪肉安全控制提供技术支撑。

[0006] 本发明的具体步骤如下：

[0007] （1）提取待测肉样中总细菌DNA，

[0008] （2）合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示的5种目标菌株的特异性靶基因和细菌16S rRNA内控基因所对应的引物；

[0009] （3）以步骤（1）的总细菌DNA为模板，加入步骤（2）的6对引物，进行五重PCR反应，PCR产用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果判断待测肉样中是否含有沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌。

[0010] 本研究所选用的目的菌株的引物序列均参考国内外公开发表文献中报道的具有的致病性的特异性靶基因所对应核苷酸序列，并运用NCBI中的BLAST程序进行比对，选择最佳的引物用于试验研究。引物委托上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen Company,China）合成。引物信息见表1。

[0011] 2.细菌DNA提取

[0012] 五株目标菌株及阴性对照菌株（表2）分别活化后各取2mL菌液，按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）的操作说明提取细菌基因组DNA，作为PCR特异性验证的模板。

[0013] 本发明优化出的多重PCR最佳反应体系如下（25μL）：Premix Taq（5U/μL）2+
0.125μL，10×PCR Buffer（Mg Free）2.5μL，MgCl2（25μM）1.5μL，dNTP Mixture（各
2.5mM）2μL（以上试剂均为宝生物工程大连有限公司）；各引物浓度分别为沙门氏菌（SEQ ID NO.1和SEQID NO.2）、大肠杆菌O157:H7（SEQ ID NO.5和SEQID NO.6）均为0.24μM（10μmol/L）；单增李斯特菌（SEQ ID NO.3和SEQID NO.4）、金黄色葡萄球菌（SEQ ID NO.9和SEQID NO.10）均为0.16μM（10μmol/L）；小肠结肠炎耶尔森菌（SEQ ID NO.7和SEQID NO.8）为0.4μM（10μmol/L）；16S rRNA（SEQ ID NO.11和SEQID NO.12）0.04μM（1μmol/L）；待测肉样中总细菌DNA模板（2μL），加灭菌蒸馏水至25μL。

[0014] 扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共35循环；72℃延伸10min。PCR产物用2%琼脂糖进行电泳分析。细菌样本均会出现1300bp条带，同时还具有119bp、404bp、678bp、170bp、270bp条带的，分别对应为沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌。

[0015] 表1目标菌株及所对应的特异性靶基因及其引物序列

[0016]

[0017] 五重PCR检测方法的灵敏度试验：选用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌五个目标菌株测定五重PCR方法的灵敏度。分别取用平板计数法已测定过其浓度的标准菌株原菌液，分别进行梯度稀释0 9
（10-10cfu/mL），用TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基过夜培养，取各自稀释度菌液2mL用于提取细菌基因组DNA，取2μL DNA作为模板，以细菌16S rRNA基因作为内控基因进行多重PCR反应，并运用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

[0018] 表2菌株来源及多重PCR引物特异性的评价

[0019]

[0020]

[0021] 表2（续）：

[0022]

[0023] ﹡ 江苏出入境检验检疫局；

[0024] ﹡﹡ 江苏省疾病预防控制中心；

[0025] CICC 中国工业微生物菌种保藏管理中心；

[0026] ATCC 美国模式菌种收集中心；

[0027] + 表示目标菌扩增产物为阳性；

[0028] - 表示目标菌扩增产物为阴性。

[0029] 人工污染试验：猪肉试样购自于当地超市，剔除表皮后每份取为25g，紫外照射20min，并按ISO（国际标准化组织）所规定的检测方法进行检测，以证实所取肉样中不含有金黄色葡萄球菌（ISO6888-1:1999）、沙门氏菌（ISO6579:2002）、大肠杆菌O157:H7（ISO16654:2002）、单增李斯特氏菌（ISO11290-2:1998）和小肠结肠炎耶尔森菌（ISO10273:2003），方可用于人工污染。肉样放入无菌均质袋中，分别进行五菌株混合接种9 1 9 1
和单一接种，接种剂量分别为：10-10cfu/mL和5×10-5×10cfu/mL；4℃过夜浸润；每份肉样中加入225mL TSB（胰蛋白胨大豆肉汤），用BagMixter均质仪（Interscince，法国）均质1min，吸取100μL用选择性培养基进行平板计数。接种单一菌株的在37℃过夜培养（小肠结肠炎耶尔森菌在25℃过夜培养）；接种混合菌株的在30℃过夜培养。培养后吸取2mL提取DNA，以细菌16S rRNA基因作为内控基因进行多重PCR试验。

[0030] 本发明结果表明：本五重PCR方法可快速同时检测猪肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌5种食源性致病菌，特异性强（表2）；且运用单重PCR与五重PCR方法比较，扩增的条带亮度差异性不显著（图1）。五3
菌株菌液培养增菌后，同时检测出五菌株的灵敏度为10cfu/mL，与其他相关报道相比较，本方法灵敏度较好；五菌株中单一菌株检出的灵敏度为10cfu/mL（图2）。通过人工污染猪肉，基于五重PCR方法成功检测猪肉中五种食源性致病菌，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157:H7的最低检测限分别为142、51、9、33和
670cfu/mL（表3）。总之，本发明的五重PCR方法对于猪肉种上述五种食源性致病菌的快速监测及安全评估体系提供了便捷的技术平台。

[0031] 表3沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157:H7混合菌液以不同浓度接种猪肉后，基于五重PCR方法进行检测；同时，通过传统培养方法进行选择性平板计数

[0032]

[0033]

[0034] a五种菌株混合菌液梯度稀释后接种猪肉样品，选择性培养基37℃培养24-48h后(小肠结肠炎耶尔森菌在25℃培养)进行平板计数。数据采用平均值±标准偏差，每一种菌株计数采用四个重复取平均值。

[0035] b30℃过夜培养后运用多重PCR方法进行检测。+表示目标菌扩增产物为阳性；-表示目标菌的扩增产物为阴性。

[0036] 本发明的有益效果：本发明的五重PCR快速检测方法，与传统方法及单重PCR方法相比，检测速度快、成本较低、灵敏度高、特异性强，适合食品行业对大批量猪肉及猪肉产品在销售过程中食源性致病菌的日常安全监测，应用前景良好。

附图说明

[0037] 图1基于五重PCR方法进行五种食源性致病菌快速检测的特异性评价。

[0038] S：沙门氏菌；Y：小肠结肠炎耶尔森菌；St：金黄色葡萄球菌；Lm：单增李斯特菌；

[0039] E：大肠杆菌O157:H7；M：五株目标菌株；B：空白对照；L：100bp DNA ladder。

[0040] 图2基于五重PCR方法进行五种食源性致病菌快速检测的灵敏度评价。

[0041] 五株目的菌株的混合菌悬液10倍系列梯度稀释（109,108,107,106,105,104,103,102,10,<10）；B：空白对照；L：100bp DNA ladder。

具体实施方式

[0042] 下面内容是具体实验方式举例。

[0043] 1材料与方法

[0044] 1.1材料

[0045] 1.1.1培养基

[0046] 沙门氏菌：HE琼脂

[0047] 金黄色葡萄球菌：Baird-Parker琼脂平板

[0048] 大肠杆菌O157:H7：改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC）琼脂

[0049] 单增李斯特菌：PALCAM琼脂

[0050] 小肠结肠炎耶尔森菌：CIN-1培养基

[0051] TSB培养基

[0052] 上述培养基均购于北京陆桥有限公司。

[0053] 1.1.2主要试剂

[0054] PCR Premix（包 括 TaKaRa Taq、dNTP Mixture、Taq Buffer）、DNA Marker（DL2000bp）均购于宝生物工程（大连）有限公司

[0055] 细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）购于北京天根生化科技有限公司

[0056] 琼脂糖（Sunshine，美国）购于天根生物技术公司

[0057] 溴化乙锭（EB）购于天根生物技术公司

[0058] 生化鉴定试剂盒购于北京陆桥有限公司

[0059] 其他试剂：无水乙醇、95%乙醇、甘油、氯化钠等均为国产分析纯。

[0060] 1.1.3引物的设计与合成

[0061] 本试验所用引物均由上海Invitrogen公司合成，引物具体情况见“发明内容”部分的表1。1.1.4主要仪器

[0062] GelDoc2000system凝胶成像仪（BioRad,美国）

[0063] Mastercycler ep personal PCR仪（Enperndorf,德国）

[0064] 水平电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）

[0065] 均质仪BagMixter（Interscince，法国）

[0066] 64R台式高速冷冻离心机（Beckman,美国）

[0067] Anke TLG-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）

[0068] LX-100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔公司）

[0069] SW-CF-IF超净工作台（苏州安泰充气技术有限公司）

[0070] GKYS洁净工作台（苏州安泰充气技术有限公司）

[0071] WH-2连续点动微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）

[0072] SHW.W-600/420型智能电热恒温水箱（北京东方精瑞科技发展有限公司）[0073] PYX-DHS-4隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）

[0074] LDX-50KBS立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）[0075] SIM-F-124制冰机（SANYO，日本）

[0076] SC276Haier控温冰箱（青岛海尔）

[0077] 1.2试验方法

[0078] 1.2.1猪肉样品采集及处理

[0079] 2012年6月-2013年5月，选取南京市5个超市、6个农贸市场，购买猪肉样品165份。每份肉样取25g，放入无菌均质袋中,加入225mL TSB，用BagMixter均质仪（Interscince，法国）均质1min。

[0080] 1.2.2微生物培养

[0081] 吸取均质液100μL，用各致病菌选择性培养基，置于培养箱中37℃（小肠结肠炎耶尔森菌25℃）培养24-48h，计数。同时，挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒进行鉴定。

[0082] 1.2.3多重PCR检测

[0083] 1.2.3.1增菌培养

[0084] 剩余均质液置于培养箱中30℃培养过夜，然后进行细菌DNA提取。

[0085] 1.2.3.2细菌DNA提取

[0086] 取10mL增菌液，200×g离心10min，取上清液2mL至离心管，8700×g离心15min，弃上清液；向菌体沉淀加入1mL无菌水，涡旋机充分振荡1-2min；12500×g离心15min，沉淀按北京天根生化科技有限公司细菌DNA提取试剂盒的操作说明提取细菌基因组DNA。

[0087] ①向菌体沉淀加入250μL的BPI，充分振荡至菌体彻底悬浮，放入水浴锅中65℃温水浴10min；若此时溶液呈不透明，则置于离心机中以12,000rpm的转速离心1min，弃沉淀，上清液转至新的离心管；

[0088] ②加250μL70%的乙醇，振荡15s，此时可能出现白色沉淀；

[0089] ③将管内液体（可包括白色沉淀）一同转至带吸附柱DB的新离心管中，置于离心机中以12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱DB放入收集管中；

[0090] ④向吸附柱DB中加入500μL的去蛋白溶液WP，置于离心机中以12,000rpm的转速离心1min，弃废液，将吸附柱DB放入收集管中；

[0091] ⑤向吸附柱DB中加入600μL的漂洗液WB，置于离心机中以12,000rpm的转速离心1min，弃废液，将吸附柱DB放入收集管中；

[0092] ⑥重复上操作一次；

[0093] ⑦空管置于离心机中以12,000rpm的转速离心1min，以除尽漂洗液；

[0094] ⑧将吸附柱DB转入一个干净的离心管中，分两次每次向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2-3min，12,000rpm离心1min，完成洗脱。

[0095] 提取的DNA置于-20℃的冰箱存放，待用。

[0096] 1.2.3.3五重PCR反应

[0097] 五重PCR扩增最佳反应体系（25μL）：Premix Taq（5U/μL）0.125μL，10×PCR2+
Buffer（Mg Free）2.5μL，MgCl2（25μM）1.5μL，dNTP Mixture（各2.5mM）2μL（以上试剂均为宝生物工程大连有限公司）；各引物浓度分别为沙门氏菌（SEQ ID NO.1和SEQID NO.2）、大肠杆菌O157:H7（SEQ ID NO.5和SEQID NO.6）均为0.24μM（10μmol/L）；单增李斯特菌（SEQ ID NO.3和SEQID NO.4）、金黄色葡萄球菌（SEQ ID NO.9和SEQID NO.10）均为0.16μM（10μmol/L）；小肠结肠炎耶尔森菌（SEQ ID NO.7和SEQID NO.8）为0.4μM（10μmol/L）；16S rRNA（SEQ ID NO.11和SEQID NO.12）0.04μM（1μmol/L）；待测肉样中总细菌DNA模板（2μL），加灭菌蒸馏水至25μL。

[0098] 扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共35循环；72℃延伸10min。

[0099] PCR产物用2%琼脂糖进行电泳分析。

[0100] 2结果与分析

[0101] 2.1不同检测方法比较猪肉中致病菌污染情况

[0102] 分别应用传统微生物培养鉴定方法和多重PCR方法对南京市165份猪肉样品进行5种致病菌污染调查，结果见表4。由表4可知，多重PCR检测结果，5种致病菌的检出率为
29.7%；高于传统培养方法的检测率（24.8%）。不同致病菌污染率明显不同，金黄色葡萄球菌的检出率居首位，达12.7%，其次为沙门氏菌、单增李斯特氏菌，最后为小肠结肠炎耶尔森菌和出血性大肠杆菌。

[0103] 表4不同检测方法对南京市猪肉市场调查

[0104]

[0105] 2.2不同采样地点猪肉中致病菌污染情况

[0106] 南京市165份猪肉样品，其中55份取自6个超市，110份取自5个农贸市场。运用多重PCR对猪肉样品进行5种致病菌污染调查，结果见表5。由表5可知，农贸市场的5种致病菌的检出率为40.0%，显著高于超市5种致病菌的检出率(10.9%)。而且，无论是超市还是农贸市场，金黄色葡萄球菌的检出率均最高，分别为5.5%和16.4%。

[0107] 表5不同采样地点猪肉中致病菌污染情况

[0108]

[0109] 2.3不同采样时间猪肉中致病菌污染情况

[0110] 于2012年6月～2013年5月对南京市165份猪肉样品，运用多重PCR对猪肉样品进行5种致病菌污染调查，结果见表6。由表6可知，7、8月份5种致病菌的总检出率（60%以上）显著高于其他月份的检出率。1-3月份和10-12月份检出率全年最低。而且，5种致病菌中，金黄色葡萄球菌在不同时间的检出率均较高。

[0111] 3结论

[0112] 本试验运用多重PCR方法对南京市165份猪肉样品进行5种致病菌污染状况调查，结论如下：

[0113] （1）多重PCR检测得到的5种致病菌的检出率（29.7%）高于传统培养方法的检测率（24.8%）。猪肉中不同致病菌污染率明显不同，金黄色葡萄球菌的检出率最高。

[0114] （2）农贸市场的5种致病菌的检出率为40.0%，显著高于超市5种致病菌的检出率（10.9%）。

[0115] （3）不同调查时间猪肉中致病菌的污染率明显不同，7、8月份5种致病菌的检出率（60%以上）显著高于其他月份的检出率。1-3月份和10-12月份检出率全年最低。

[0116] 本试验结果表明，多重PCR检测方法比传统培养方法更灵敏高效，南京市猪肉中致病菌的污染情况较严重，应引起重视，应该加强猪肉产品的监督管理。

[0117] 表6不同采样时间猪肉中致病菌污染情况

[0118]