一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法

摘要

本申请提供了一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。该方法包括：将昆虫冷冻干燥；将冷冻干燥后的昆虫用有机溶剂进行萃取；取萃取液，进行GC-MS分析。该方法可以最低限度减少昆虫自身所带的水分对萃取的干扰，以提高萃取的高分子量体壁碳氢化合物的含量和质量，分离出现有技术的方法无法分离出的成分，使得能够检测出更多种类的高分子量体壁碳氢化合物，以便对其进行进一步的研究。

权利要求

1.一种分析昆虫体壁的高分子量碳氢化合物组分的方法，包括：将昆虫进行麻醉；

使用液氮将昆虫进行速冻后立即放入冻干机进行冻干，其中所述冻干的条件为冷阱温度-64℃至-84℃，真空度0.01mbar以下，冻干时间为12-24h；

用有机溶剂萃取冷冻干燥后的昆虫体壁的高分子量碳氢化合物；

吸取萃取后的上清液并进行浓缩，进行GC-MS分析。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述麻醉在密闭容器内使用麻醉剂进行。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述的麻醉剂是无机麻醉剂。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述的麻醉剂是二氧化碳。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述麻醉的时间是15-180秒。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂是丙酮、氯仿、乙醇、二氯甲烷或正己烷。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述有机溶剂是二氯甲烷或正己烷。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述萃取时间为1-6h。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述的昆虫是绿盲蝽。

说明书

一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法

技术领域

[0001] 本申请涉及植物保护技术领域，具体地涉及一种昆虫分析方法，更具体地，涉及一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。

背景技术

[0002] 昆虫信息素是生物体之间起化学通讯作用的化合物的统称，是昆虫交流的化学成分。昆虫信息素是一类碳氢化合物，它们是同种个体之间相互作用的化学物质，能影响彼此的行为、习性，乃至发育和生理活动。信息素由体内腺体合成，直接排出体表，分布在体表或散发到体外。信息素依靠接触、空气、水等传导媒介传给其它个体。信息素主要有性信息素、聚集信息素、报警信息素、示踪信息素和标记信息素等。

[0003] 性信息素由性成熟昆虫释放至空气中后随气流扩散，刺激异性触角中的化学感觉器官，引起异性个体性冲动及引诱雄虫向释放源定向飞行，并与释放性信息素成虫交配以繁衍后代。聚集信息素能够招引同种其他个体前来一起栖息，共同取食，攻击异种对象，从而形成种群聚集。白蚁、蜜蜂、蚂蚁等昆虫组成几十万只个体共同生活的群体，聚集信息素在群体生活中起主要作用。报警信息素是当某一昆虫个体受到敌害攻击侵扰时，所发出一种特殊的化学信号物质，使同伴得到信号以后，引起警觉或逃避。蚜虫受到敌害侵袭时，从腹管中放出微量化学物质，警告同伴离开。蜜蜂、蚂蚁等群体生活的昆虫都有较多的报警信息素。蜜蜂的报警信息素由大颚腺产生的2-庚酮和螫腺产生的异戊基乙酸酯混合组成。当外敌侵害蜂巢时，执勤工蜂一齐向外敌进攻，直到外敌消除方才安静下来。示踪信息素多数为蚁类所分泌，它们用这种物质标记路线，使其它的蚁按原路找到合适的食物。被霉菌腐烂的木头所产生的一种物质能引诱东方地下白蚁，并已证明为东方或南方地下白蚁追迹信息素，其结构为3Z，6Z，8E-12：OH。许多昆虫的性信息素都有专一性，而追迹信息素无专一性。标记信息素多为昆虫产卵后标记在产卵部位的碳氢化合物，引诱或阻止其它昆虫产卵。

[0004] 昆虫体壁上附着大量的碳氢化合物，昆虫体壁碳氢化合物对于昆虫来说是重要的相互识别信息化合物，主要用于群居昆虫个体的相互识别，天敌对寄主的识别等。此外，昆虫体壁碳氢化合物的组分在昆虫分类中也是重要的指标。信息素物质从体壁内部向外分泌，体壁上存在控制信息素物质释放速度的特殊组织结构，体壁内的水分用于锁定信息素物质。目前分析信息素物质的方法多采用有机溶剂二氯甲烷直接浸泡提取昆虫体壁的碳氢化合物，然后进行GC-MS分析。使用该技术能够分离小分子碳氢化合物，但对于分子量较大的种类，由于不能萃取出能够被GC-MS检测出的足够量，而无法分析出种类。分子量较大的信息素物质与体壁结合较为紧密，直接用有机溶剂提取时，如果提取时间太短，由于体壁水分的封锁，不能充分地提取昆虫体表较深层的碳氢化合物；如果提取时间过长，由于昆虫体内物质经由口器或肛门逸出，可能把体内的物质也提取出来，两种情况都会影响实验结果。

发明内容

[0005] 本申请的目的是提供一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。

[0006] 本申请提供了一种昆虫表皮碳氢化合物组分的分析方法，包括：

[0007] 将昆虫冷冻干燥；

[0008] 将冷冻干燥后的昆虫用有机溶剂进行萃取；

[0009] 取萃取液，进行GC-MS分析。

[0010] 在一个实施方案中，在所述冷冻干燥步骤前将昆虫进行麻醉，优选在密闭容器内使用麻醉剂进行麻醉。

[0011] 在一个实施方案中，所述的麻醉剂是无机麻醉剂，优选是二氧化碳。

[0012] 在一个实施方案中，所述麻醉的时间是15-180秒。

[0013] 在一个实施方案中，所述冷冻干燥步骤包括使用液氮进行速冻后立即放入冻干机进行冻干。

[0014] 在一个实施方案中，所述冻干的条件为冷阱温度-64℃至-84℃，真空度0.01mbar以下，冻干时间为12-24h。

[0015] 在一个实施方案中，所述有机溶剂是丙酮、氯仿、乙醇、二氯甲烷或正己烷，优选二氯甲烷或正己烷。

[0016] 在一个实施方案中，所述萃取时间为1-6h。

[0017] 在一个实施方案中，所述取萃取液的步骤包括吸取萃取后的上清液并进行浓缩。

[0018] 在一个实施方案中，所述的昆虫是绿盲蝽。

[0019] 本申请的方法可以检测多种昆虫，包括但不限于绿盲蝽、棉铃虫、蜜蜂、家蚕等。

[0020] 本申请的方法首先将活体昆虫冷冻干燥，然后萃取其体壁碳氢化合物。这样可以最低限度减少昆虫自身所带的水分对萃取的干扰，以提高萃取的高分子量体壁碳氢化合物的含量和质量，分离出现有技术的方法无法分离出的成分，使得能够检测出更多种类的高分子量体壁碳氢化合物，以便对其进行进一步的研究。

附图说明

[0021] 图1显示使用二氯甲烷直接提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

[0022] 图2显示本申请实施例1使用二氯甲烷提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

[0023] 图3显示使用正己烷直接提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

[0024] 图4显示本申请实施例2使用正己烷提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

具体实施方式

[0025] 下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本申请的范围仅由所附权利要求界定。

[0026] 下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。下述实施例中的试验，均设置三次重复实验。

[0027] 实施例1

[0028] 材料与方法

[0029] 材料：

[0030] 试验的雌绿盲蝽成虫来自中国农业科学院棉花研究所东试验农场；实验中所用仪器的具体型号见下述。

[0031] 方法：

[0032] 麻醉

[0033] 在2个密闭容器内分别放入雌绿盲蝽成虫20头，使用二氧化碳进行麻醉120秒。

[0034] 冷冻干燥

[0035] 收集其中一个密闭容器内麻醉后的绿盲蝽，使用液氮进行速冻，立即放入冻干机(德国Christ Alpha1-2LD)进行冻干，冻干条件为冷阱温度-64℃，真空度0.01mbar以下，冻干时间为12h。

[0036] 萃取

[0037] 将冷冻干燥后的绿盲蝽放入一个色谱瓶，加入5mL二氯甲烷进行萃取，萃取2h后，吸取上清液至另一干净色谱瓶，使用氮吹仪(北京东方精华苑科技有限公司DSY-V)浓缩上清液至500μL，备用。

[0038] 将另一容器内麻醉后的绿盲蝽直接放入一个色谱瓶中，加入5mL二氯甲烷进行萃取，萃取2h后，吸取上清液至另一干净色谱瓶，使用氮吹仪(北京东方精华苑科技有限公司DSY-V)浓缩上清液至500μL，备用。

[0039] 分析

[0040] 使用GC-MS分别对上述两种浓缩后的上清液进行分析，所用的GC-MS分析仪为气质联用系统GC-MS(Agilent 7890A/5975C)，进样口温度250℃，分流9∶1，进样口流速为40mL/min，色谱柱为HP-5MS，柱流速为1mL/min，升温程序：40℃保持3min，以6℃/min升至
250℃，保持3min，载气为氦气，压力20kPa。电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV，GC-MS接口温度250℃。离子源温度200℃，灯丝电流150A。扫描速度0.4s/scan，质量扫描范围：
m/z29～350。

[0041] 结果

[0042] 所得结果分别如图1和图2所示。

[0043] 图1显示采用现有技术、使用二氯甲烷直接提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。在保留时间10-15min萃取出的化合物为绿盲蝽的性信息素物质。

[0044] 图2显示使用二氯甲烷提取经冷冻干燥的绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

[0045] 与图1相比，本申请的分析方法在保留时间28-38min时的化合物峰值增高、种类增加。图2在保留时间28-38min萃取出的化合物为大分子的脂类化合物，每一个峰代表一类化合物。与图1相比，图2在保留时间28-38min萃取出的化合物种类增加，而且丰度较高，说明萃取出的量较大。图2在10-15min没有峰说明本申请的分析方法不适用于萃取低分子量、挥发性强的体壁碳氢化合物，而适用于萃取高分子量体壁碳氢化合物。

[0046] 实施例2

[0047] 材料与方法

[0048] 材料：

[0049] 试验的雌绿盲蝽成虫来自中国农业科学院棉花研究所东试验农场；实验中所用仪器的具体型号见下述。

[0050] 方法：

[0051] 麻醉

[0052] 在2个密闭容器内分别放入雌绿盲蝽成虫20头，使用二氧化碳进行麻醉180秒。

[0053] 冷冻干燥

[0054] 收集其中一个密闭容器内麻醉后的绿盲蝽，使用液氮进行速冻，立即放入冻干机(德国Christ Alpha1-2LD)进行冻干，冻干条件为冷阱温度-84℃，真空度0.01mbar以下，冻干时间为24h。

[0055] 萃取

[0056] 将冷冻干燥后的绿盲蝽放入一个色谱瓶，加入5mL正己烷进行萃取，萃取6h后，吸取上清液至另一干净色谱瓶，使用氮吹仪(北京东方精华苑科技有限公司DSY-V)浓缩上清液至500μL，备用。

[0057] 将另一容器内麻醉后的绿盲蝽直接放入一个色谱瓶中，加入5mL正己烷进行萃取，萃取6h后，吸取上清液至另一干净色谱瓶，使用氮吹仪(北京东方精华苑科技有限公司DSY-V)浓缩上清液至500μL，备用。

[0058] 分析方法与实施例1相同。

[0059] 结果

[0060] 所得结果分别如图3和图4所示。

[0061] 图3显示采用现有技术、使用正己烷直接提取绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。在保留时间10-15min萃取出的化合物为绿盲蝽的性信息素物质。

[0062] 图4显示使用正己烷提取经冷冻干燥的绿盲蝽体壁碳氢化合物的GC-MS分析结果。

[0063] 与图3相比，本申请的分析方法在保留时间29-38min时的化合物峰值增高、种类增加。图4在保留时间29-38min萃取出的化合物为大分子的脂类化合物，每一个峰代表一类化合物。与图3相比，图4在保留时间29-38min萃取出的化合物种类增加，而且丰度较高，说明萃取出的量较大。图4在10-15min没有峰说明本申请的分析方法不适用于萃取低分子量、挥发性强的碳氢化合物，而适用于萃取高分子量体壁碳氢化合物。

[0064] 由以上实施例可知，本申请的方法通过冷冻干燥除去昆虫体内的水分，解除体壁内的水分对碳氢化合物的锁定，能够提取出常规方法无法提取出的高分子量体壁碳氢化合物种类。

[0065] 综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。