改善干细胞的疗效的组合物和方法

摘要

本发明涉及以令人惊讶的疗效治疗损伤的组合物和方法。该组合物包含来源于人脐带血的细胞的群体，所述细胞表达下列标志物之一：CD34、CD45和CD31;CD34+衍生的内皮细胞的群体；和仿生胶（biomimetic gel），优选纤维蛋白。用于获得该组合物的方法包括从CD34+细胞衍生内皮细胞的群体，随后在仿生胶内共培养CD34+细胞与CD34+衍生的内皮细胞。

权利要求

1.一种组合物，其包含:

о来源于人脐带血的CD34+细胞的群体；

о衍生于所述CD34+细胞的内皮细胞群体，其表达下列标志物的至少一种：vWF、Flk-1/KDR、CD31、血管内皮钙粘蛋白、Ac-LDL；和о仿生胶；

治疗有效量的所有先前的组分。

2.权利要求1的组合物，其还包含足够量的赋形剂。

3.权利要求1的组合物，其中所述仿生胶是下列物质中的至少一种：纤维蛋白凝胶、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、胶原或PEG衍生物。

4.权利要求3的组合物，其中所述仿生胶是纤维蛋白凝胶。

5.权利要求4的组合物，其中纤维蛋白凝胶包含终浓度为1-100mg/ml的纤维蛋白原和终浓度为1-500U/ml的凝血酶。

6.权利要求4的组合物，其中纤维蛋白凝胶包含终浓度为10-30mg/ml的纤维蛋白原和终浓度为2-50U/ml的凝血酶。

7.权利要求1的组合物，其中所述CD34+细胞的群体包含自体细胞、同种异基因细胞或其混合物。

8.权利要求4-6的任一项的组合物，其包含：о浓度为每1mL纤维蛋白凝胶10×102至10×106个细胞的CD34+细胞,о并且CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为10:1至5:1。

9.权利要求4-6的任一项的组合物，其中CD34+细胞以每1mL纤维蛋白凝胶4.0×106个细胞的浓度存在。

10.权利要求1-7的任一项的组合物，其中CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为

0.5:1至1:1。

11.权利要求1-7的任一项的组合物，其中CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为

3:1。

12.权利要求1-7的任一项的组合物，其中CD34+细胞的群体通过与浓度在20ng/mL至

100ng/mL的范围内的VEGF165接触而获得所述内皮细胞。

13.权利要求1-7的任一项的组合物，其还包含由胶原I、胶原IV、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、蛋白水解酶、趋化性试剂、生长因子组成的组的成员。

14.权利要求1-7的任一项的组合物，其还包含纤维蛋白或糖蛋白。

15.权利要求13的组合物，其中蛋白水解酶是胶原酶。

16.权利要求13的组合物，其中所述生长因子的至少一种是细胞因子。

17.权利要求16的组合物，其中细胞因子选自：о VEGF、PDGF、血管生成素–Ang、ephrin-Eph、成纤维细胞生长因子-FGF、胎盘生长因子-PIGF、转化生长因子β-1[(TGF)-β1]、红细胞生成素、血小板生成素、转铁蛋白、胰岛素、干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或其混合物。

18.权利要求17的组合物，其中VEGF是VEGF165。

19.权利要求18的组合物，其中VEGF165的浓度为30-100ng/mL。

20.权利要求18的组合物，其中VEGF165的浓度为50ng/mL。

21.权利要求4-6的任一项的组合物，其中纤维蛋白凝胶包含浓度为15％至20％v/v的FBS。

22.权利要求21的组合物，其中纤维蛋白凝胶包含浓度为18％v/v的FBS。

23.权利要求6的组合物，其中从患者的血液样品分离所述纤维蛋白凝胶的纤维蛋白原。

24.权利要求1-7的任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物或化妆品组合物。

25.权利要求1-7的任一项的组合物，其中组合物是局部用制剂或注射制剂。

26.权利要求1-25的任一项中描述的组合物用于制备药物或化妆品的用途。

27.权利要求1-25的任一项的组合物在制备用于治疗糖尿病哺乳动物的创伤的药物中的用途。

28.权利要求1-25的任一项的组合物在制备用于治疗缺血性和血管性疾病的药物中的用途。

29.一种使用从脐带血分离的CD34+细胞促进内皮分化的方法，包括：

1)从脐带血单核细胞分离CD34+细胞；

+

2)在包含FBS和VEGF165的分化培养基中培养CD34细胞；

3)将CD34+衍生的内皮细胞与CD34+细胞在纤维蛋白凝胶前体溶液中共培养。

30.权利要求29的方法，其中步骤2)中所述培养基包括内皮生长培养基-2-EGM-2、FBS和VEGF165。

31.权利要求29-30的任一项的方法，其中步骤2)中所述培养基中的细胞接种密度为10×104细胞/cm2。

32.获得权利要求1-25的任一项中描述的组合物的方法，其具有下列步骤：о包括从脐带血单核细胞分离CD34+细胞；

о使用从脐带血分离的CD34+细胞在充足培养基中进行内皮分化；

о将CD34+细胞与从CD34+分化的内皮细胞在仿生胶内组合。

33.权利要求32的方法，其中所述仿生胶是纤维蛋白。

34.权利要求32-33的任一项的方法，其中所述充足培养基包括内皮生长培养基-2-EGM-2、FBS和VEGF165。

说明书

改善干细胞的疗效的组合物和方法

[0001] 发明的技术领域

[0002] 本发明涉及仿生胶(biomimetic gel)中的人脐带来源的CD34+细胞与从CD34+细胞衍生的内皮细胞的共培养物的组合物，其用于损伤的治疗。

[0003] 背景

[0004] 本发明顺应对用于治疗慢性损伤（特别地糖尿病患者的）的更有效方法的需要而产生。

[0005] 据估计15%的糖尿病患者具有未愈的足溃疡。近年来，已努力开发治愈慢性损伤的新型先进方法，包括使用局部生长因子或基于细胞的疗法。在干细胞的情况下，治疗是基于下列假定：干细胞的局部施用调节愈合反应。

[0006] 最近的数据显示健康成体干细胞/祖细胞改善糖尿病慢性损伤的愈合。已显示外周血来源的CD34+细胞但非CD34-细胞可加速糖尿病损伤的血管生成和愈合(Schatteman GC等人,2003)。然而，成人血液来源的细胞的血管生成潜能似乎因糖尿病而减小。最近的研究试图通过使用胎儿(Invernici G等人,2009)或成人(Tredget EE等人,2007)间充质干细胞来克服该问题，然而，从胎儿主动脉分离干细胞具有将来临床应用面临的几个问题；从糖尿病患者分离的间充质干细胞可能因衰老和疾病而具有受损的性质。在胎儿主动脉干细胞的情况下，结果表明干细胞释放因子(例如VEGF和IL-8)，所述因子刺激血管生成和激活Wnt信号转导，促进糖尿病缺血性溃疡的愈合。

[0007] 人脐带血(UCB)可以是用于愈合糖尿病患者的慢性损伤之愈合的健康的内皮祖细胞的潜在来源。可非侵袭性地获得此类细胞，可将所述细胞贮存超过15年而不丢失生物学性质，并且它们具有低免疫原 性，这使得它们成为用于同种异体移植的吸引人的候选者。最近已在两个人非糖尿病患者中报导了损伤愈合的改善，所述非糖尿病患者局部接受纤维蛋白凝胶中的UCB来源的CD34+细胞(Dejana AM等人,2004)。尽管存在该潜能，但人脐带血干细胞未曾用于糖尿病患者的损伤治愈，糖尿病患者的愈合过程受到削弱或甚至不存在的。在该情况下，干细胞可能需要生物活性剂的刺激和细胞间相互作用来获得存活和治疗效果。这是本发明的焦点。

[0008] 在本专利中，在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠中测试CD34+细胞或CD34+细胞与CD34+-衍生的EC的组合的疗效，所述小鼠先前已用于研究基于细胞的疗法对损伤愈合的疗效(Invernici G等人,2009,Wu Y,2008)。重要地，没有研究已证明UCB来源的CD34+细胞在糖尿病损伤的情况下的再生潜能。此处，我们显示相较于利用单独的凝胶或PBS覆盖的损伤，纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞与CD34+-衍生的EC一起的移植（而单独的CD34+细胞则不）增强了损伤愈合。相当大一部分的细胞(超过90%)在3天的时间中死亡。这与其它显示干细胞在损伤位置的急剧减少的研究一致(Invernici G等人,2009)]。即使这样，在我们的研究中在10天的时间中观察到治疗益处，这可能归因于由两种细胞分泌的因子，所述因子增加血管新生并且减弱炎症反应。我们的结果显示当共培养两种细胞时，仅分泌细胞因子IL-10和IL-17。IL-10是单核细胞/巨噬细胞功能的强效免疫抑制剂，抑制促炎细胞因子的产生。我们的许多结果还显示TNF-α（一种促炎细胞因子）的水平在利用CD34+细胞与EC处理的或仅用包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞处理的损伤中更低。

[0009] 关于现有技术，在再生医学领域中有若干使用本发明的一些组分，但提供明显不同的方法和组合物的专利。例如，标题为“Using of scaffold comprising fibrin for delivery of stem cells”的专利申请(US2010/0028311A1)部分地提供了用于治疗有此需要的受试者的缺血的组合物和方法。所述方法在于施用包含干细胞(CD34+细胞)的纤维蛋白支架或纤维蛋白凝块。然而，该发明没有描述改善CD34+细胞的存 活性、血管分化和疗效的方法。

[0010] 概述

[0011] “损伤”是指对可基于各种基础分类的生物体的损害。其包括创伤性损伤、感染引起的损伤、代谢损伤（糖尿病的并发症）、由缺血和血管疾病引起的损伤以及来自毒素或作为药物的有害作用的损伤、因自身免疫、癌症和疾病引起的损伤。此外，包括损伤(wound)、脑损伤、脊髓损伤、神经损伤和细胞损伤(damage)。

[0012] “CD34+细胞”是指表达CD34抗原的细胞。该抗原是在几种细胞（包括人造血干细胞和祖细胞、血管内皮细胞、胚胎成纤维细胞以及胎儿和成人神经组织中的一些细胞）中表达的单链跨膜糖蛋白。本发明中描述的CD34+细胞是通过使用磁珠（其包含识别CD34抗原的III类表位的抗体抗-人CD34克隆AC136）从人脐带血分离的。随后将此类细胞分化成内皮细胞。

[0013] "生长因子"是指调节细胞代谢和细胞内信号转导过程，包括但不限于分化、增殖、各种细胞产物的合成以及其它代谢活动的化学品。生长因子可包括几个家族的化学品，包括但不限于细胞因子、类花生酸类和分化因子。

[0014] “内皮细胞”是指具有典型的鹅卵石形态的细胞。此类细胞可与其它细胞通过下列内皮细胞标志物的一种或多种的表达而区分开：CD31、CD34、KDR/Flk-1、血管内皮钙粘蛋白(VE-CAD)和血管性血友病因子(vWF)。此类细胞还具有当接种在由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物例如MatrigelTM3D基质上时形成血管网络以及掺入Dil-标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)的能力。

[0015] “胎牛血清”或FBS是指在血液凝固后保留的血浆的部分，在该过程中血浆蛋白纤维蛋白原被转化成纤维蛋白并且在凝块中保留下来。

[0016] 本发明涉及组合物，其包含:

[0017] ○来源于人脐带血的表达下列标志物之一的细胞的群体： CD34+、CD45和CD31;

[0018] ○ CD34+衍生的内皮细胞的群体，其表达下列标志物的至少一种：vWF、Flk-1/KDR、CD31、血管内皮钙粘蛋白，代谢Ac-LDL;

[0019] ○仿生胶;

[0020] 治疗有效量的所有先前的组分。在优选实施方案中，组合物还可包括足够量的赋形剂。

[0021] 在本发明公开的组合物的优选实施方案中，仿生胶是下列物质的至少之一：纤维蛋白、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、胶原或PEG衍生物。在更优选实施方案中，纤维蛋白凝胶包含终浓度为1-100mg/ml的纤维蛋白原和终浓度为1-500U/ml的凝血酶，在更优选实施方案中，纤维蛋白凝胶包含浓度为10-30mg/ml的纤维蛋白原和终浓度为2-50U/ml的凝血酶。

[0022] 在本发明公开的组合物的更优选实施方案中，所述CD34+的群体包含自体细胞、同种异基因细胞或其混合物。

[0023] 本发明公开的组合物的另一个优选实施方案，上述组合物包含：

[0024] ○浓度为每1mL纤维蛋白凝胶10×102至10×106个细胞的CD34+细胞,

[0025] ○并且CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为10:1至5:1。

[0026] 更优选地，CD34+细胞以每1mL纤维蛋白凝胶4.0×106个细胞的浓度存在。

[0027] 本发明公开的组合物的另一个更优选实施方案，上述组合物中CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为0.5:1至1:1，更优选3:1。

[0028] 在本发明公开的组合物的其它更优选实施方案中，上述组合物还包含由胶原I、胶原IV、层粘连蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白水解酶、胶原酶、趋化性试剂、生长因子等等组成的组的成员。在更优选方面，生长因子可选自VEGF、VEGF165、PDGF、血管生成素–Ang、ephrin-Eph、成纤维细胞生长因子-FGF、胎盘生长因子-PIGF、转化生长因子β-1[(TGF)-β1]、细胞因子、红细胞生成素、血小板生成素、转铁蛋白、胰岛素、干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以形成混合物并将混合物植入动物，或其混合物等等。在更优选方面，VEGF165的浓度可以是30-100ng/mL，优选50ng/mL。

[0029] 本发明公开的组合物的另一个优选实施方案，可从患者的血液样品分离上述组合物的纤维蛋白凝胶的纤维蛋白原。

[0030] 本发明的组合物的另一个更优选实施方案可以是药物组合物、医用组合物或化妆品组合物，其可用于医药或化妆品工业。更具体地，用于糖尿病哺乳动物的损伤的治疗或用于缺血性和血管性疾病的治疗。在更优选实施方案中，组合物可以是局部制剂或注射制剂。

[0031] 本发明的另一个方面描述了通过下列步骤获得上述组合物的方法:

[0032] o包括从脐带血单核细胞分离CD34+细胞；

[0033] o使用从脐带血分离的CD34+细胞在充足培养基(adequate medium)，即包含内皮生长培养基-2-EGM-2、Lonza、FBS和VEGF165的培养基中进行内皮分化；更优选其中培养基中的细胞接种密度是10×104个细胞/cm2；

[0034] o将CD34+细胞与从CD34+分化的内皮细胞组合在仿生胶，优选纤维蛋白中。

[0035] 在优选实施方案中,以50×103至20×104个细胞/cm2，优选10×104至15×104个细胞/cm2的细胞密度进行CD34+细胞至CD34+衍生的内皮细胞的分化。

[0036] 在本发明公开的组合物的其它优选实施方案中，将CD34+细胞的群体在暴露于范围为约20ng/mL至100ng/mL的浓度的VEGF165后分化成内皮细胞。

[0037] 在本发明公开的组合物的更优选实施方案中，将CD34+细胞的群体在暴露于VEGF165和15%至20%(v/v)，优选18%(v/v)的FBS的浓缩物后分化成内皮细胞。

[0038] 本发明的另一个方面还描述了在不存在CD34+-衍生的内皮细胞的情况下获得上述组合物的方法，包括在补充有IL-10、IL-17，以及充足的能够活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径的生物分子或其混合物的培养基中从脐带血单核细胞分离CD34+细胞。

[0039] 本发明的一般描述

[0040] 本发明涉及用于损伤治疗的组合物和方法。该组合物包括包裹在仿生胶中的脐带血(UCB)来源的CD34+细胞的共培养物，以促进愈合例如糖尿病损伤和缺失性及血管性疾病的损伤的愈合。为了增强CD34+细胞的疗效，将它们与从CD34+细胞衍生的内皮细胞（EC）共培养。与CD34+细胞共培养的CD34+衍生的EC令人惊讶地改善了细胞存活并且促成CD34+细胞至EC的分化。我们还显示共培养系统（但非单独的CD34+细胞或CD34+衍生的EC）可改善糖尿病动物模型的愈合动力学。此外，该共培养方法可能用于其它情况来增强干细胞的功效。

[0041] 本方法由两个步骤形成：第一，将干细胞(CD34+细胞)分化成内皮细胞；第二，将CD34+来源的内皮细胞与干细胞(CD34+细胞)在纤维蛋白凝胶前体溶液中混合。随后可体内注射、原位胶凝化（gelify）该细胞悬浮液，所述细胞悬浮液有助于缺血组织的再生。

[0042] 附图概述

[0043] 下列附图提供了用于举例说明本说明书的优选实施方案并且不应当被视为限制本发明的范围。

[0044] 图1A–血管标志物在未分化的CD34+细胞及其内皮后代中的表达。A)未分化的CD34+细胞的免疫荧光结果。比例尺相应于20μm。

[0045] 图1B-血管标志物在未分化的CD34+细胞及其内皮后代中的表达。B)第1次传代(第1P)和第3次传代(第3P)的CD34+衍生的EC的FACS分析。阳性细胞的百分比基于同种型对照（灰色曲线）来计算 并且示于直方图中。

[0046] 图2A-CD34+衍生的EC的表征。A)免疫荧光分析。比例尺相应于40μm。

[0047] 图2B-CD34+衍生的EC的表征。B)定量RT-PCR分析。结果为平均值±SD,n=4。

[0048] 图2C-CD34+衍生的EC的表征。C)在48小时时，索状结构长度和肉芽的数目的定量。使用10倍的物镜进行计数。结果为平均值±SD,n=3。*、**、***表示统计显著性(分别是P<
0.05、P<0.01、P<0.001)。

[0049] 图2D-CD34+衍生的EC的表征。D)当置于由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠内瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物-MatrigelTM中进行24小时时，CD34+衍生的EC（红色)和CD34+细胞(绿色)形成索状结构。比例尺相应于40μm。

[0050] 图3-CD34+细胞至不同基底的附着。将CD34+细胞涂铺在用纤维蛋白凝胶、I型胶原凝胶(2.5mg/mL)和纤连蛋白（50μg/mL)包被的24孔板上。将聚苯乙烯培养孔用作对照。结果为平均值±SD,n=6。*和**表示统计显著性(分别地，P<0.05和P<0.01)。

[0051] 图4-包裹的细胞的存活性。A)包裹的细胞的存活性，如通过LIVE/DEAD测定法测定的。结果为平均值±SD，n=3。B)包裹的细胞的线粒体代谢活性。结果为平均值±SD，n=6。将每一个540nm处的吸光度针对第2天的吸光度进行标准化。C)包裹的细胞的存活性，如通过LIVE/DEAD测定法定量的。结果为平均值±SD，n=3。在全部附图中，*表示时间组内的统计显著性：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。#表示比较各对照/处理组的时间组间的统计显著性：#P<0.05、##P<0.01。D)通过Bio-Plex磷蛋白检测测定法估量的磷酸化Akt/总Akt和磷酸化ERK/总ERK比率。结果为平均值±SD，n=3。

[0052] 图5–多重细胞因子分析。由(A)在组织培养聚苯乙烯上生长或包裹在纤维蛋白凝胶中2或10天的CD34+来源的EC，(B)在组织培养聚苯乙烯上生长或包裹在纤维蛋白凝胶中2或10天的CD34+细胞和(C)包裹在纤维蛋白凝胶中2或10天的CD34+与CD34+衍生的EC的共培 养物分泌的细胞因子的分析。在与细胞接触2天后收集细胞培养基。结果为平均值±SD，n=3。

[0053] 图6–培养在纤维蛋白凝胶的顶部的CD34+细胞的存活性和分化。A)培养在纤维蛋白凝胶顶部、EGM-2培养基或利用CD34+衍生的EC条件化的EGM-2培养基中的CD34+细胞的细胞凋亡和坏死。结果为平均值±SD，n=3(使用10倍的物镜)。B)在CD34+衍生的EC的不存在(B.1)或存在(B.2)的情况下在纤维蛋白凝胶的顶部进行7天的CD34+细胞的分化。B.3显示能够摄取Ac-LDL的细胞的百分比。C)CD34+、CD34+衍生的EC或两种细胞的共培养物的定量RT-PCR分析。结果为平均值±SD，n=4。在全部附图中，*表示统计显著性：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

[0054] 图7A-包裹的CD34+和CD34+衍生的EC对糖尿病损伤的再生作用。A)通过局部施用15 + 5 + + +
×10 个CD34细胞和0.35×10 个CD34衍生的EC(A.1)、CD34细胞(A.2)或CD34 衍生的EC(A.3)处理的糖尿病小鼠的损伤闭合（相对于初始损伤区域）。对照损伤仅接受盐溶液(PBS)。结果为平均值±SEM，n=6。*表示统计显著性(P<0.05)。

[0055] 图7B-包裹的CD34+和CD34+衍生的EC对糖尿病损伤的再生作用。B)vWF免疫染色的2
代表性图像。比例尺代表50μm。C)基于vWF免疫染色结果的每mm的损伤毛细血管的定量。结果为平均值±SEM，n=3。**表示统计显著性(P<0.001)。D)损伤后3天切取的小鼠创伤样品上的细胞因子表达，如利用Bio-Plex小鼠细胞因子测定法测定的。损伤已通过局部施用包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞或CD34+衍生的EC来进行处理。对照损伤仅接受纤维蛋白凝胶。结果是平均值±SD，n=3。

[0056] 图8-利用免疫荧光对HUVEC的表征。细胞表达高水平的CD31、vWF和VE-CAD，低水平的CD34，具有摄取Ac-LDL的能力并且不表达常见的平滑肌细胞标志物例如α-SMA和SM-MHC。比例尺相应于20μm。

[0057] 图9-血管细胞在由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞 分泌的凝胶状蛋白质混合物-MatrigelTM中形成网络的能力。当接种在所述MatrigelTM中进行48小时时，CD34+来源的EC以及HUVEC形成索状结构。比例尺相应于40μm。

[0058] 图10-细胞数目对凝胶收缩以及包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞的存活性的作用。A)对于具有确定数目的CD34+细胞的构建物，随时间的凝胶直径的变化。对于所有实验组，10天后观察到低凝胶收缩。B)包裹的CD34+细胞的存活性，如通过LIVE/DEAD测定法测定的。在第2、6和10天进行的测定。细胞存活性受凝胶中包裹的细胞的数目影响。结果为平均值±SD，n=3(每构建物3个读数)。

[0059] 图11-包含细胞的纤维蛋白凝胶的降解。A)包含1×105个CD34+细胞或0.35×105CD34+衍生的EC、或这些数目的两种细胞的共培养物的荧光标记的纤维蛋白凝胶的降解。
对于所有实验组观察到低的纤维蛋白凝胶的降解。B)随时间的凝胶直径的变化。10天后观察到低的凝胶收缩。结果为平均值±SD，n=3。*表示时间组内的统计显著性：**P<0.01。#表示比较各对照/处理组的时间组间的统计显著性：#P<0.05，##P<0.01。

[0060] 图12–在第3天通过定量RT-PCR对小鼠损伤皮肤活检组织进行的炎症相关基因的表达。损伤已通过局部施用包含1×105个CD34+细胞和0.35×105个CD34+衍生的EC的纤维蛋白进行了处理。对照损伤仅用凝胶覆盖。结果为平均值±SD,n=9。

[0061] 图13-包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞对糖尿病损伤的再生作用。通过局部施5 +
用包裹在纤维蛋白凝胶中的1.35×10个CD34 细胞处理的糖尿病小鼠的损伤闭合（相对于初始损伤区域）。对照损伤仅接受盐溶液(PBS)。结果为平均值±SEM,n=5。

[0062] 图14-通过局部施用单独的纤维蛋白凝胶或包含CD34+细胞或CD34+细胞+CD34+衍生的EC的纤维蛋白凝胶处理的损伤的组织学分析。第10天的小鼠损伤的代表性亮视野照片，利用苏木精/伊红染色的。标尺（Bar）相应于100μm。

[0063] 图15-在第3天通过定量RT-PCR对小鼠损伤皮肤活检组织进行 的炎症相关基因的表达。损伤已通过局部施用包含1×105个CD34+细胞和0.35×105个CD34+衍生的EC的纤维蛋白凝胶进行了处理。对照损伤仅覆盖凝胶。结果为平均数±SD,n=9。

[0064] 图16-用于qPCR的引物序列。

[0065] 发明详述

[0066] 本发明公开了通过使用包裹在仿生胶，优选纤维蛋白中的脐带血(UCB)来源的CD34+细胞的共培养物获得的促进愈合例如糖尿病损伤和损伤引起的缺血性及血管性疾病的愈合的疗效。

[0067] 本发明基于可从UCB分离或来源于UCB的3种组分：造血干细胞(CD34+细胞)、改善+干细胞存活并且指导它们向血管细胞分化的CD34衍生的内皮细胞（EC)和在植入位置上保留这两种细胞的纤维蛋白凝胶。

[0068] 本发明包括两个步骤：第一，将干细胞(CD34+细胞)分化成内皮细胞(EC)；第二，将CD34+衍生的内皮细胞与干细胞(CD34+细胞)在纤维蛋白凝胶前体溶液中混合。

[0069] 在细胞分化之前，从UCB分离CD34+细胞。将样品贮存在装有35mL柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖抗凝剂溶液的无菌袋中。在Ficoll密度梯度分离后从获自单个或混合的UCB样品的单核细胞分离CD34+细胞。使用mini-MACS免疫磁化分离系统阳性地选择CD34+细胞（2次）。

[0070] 关于内皮细胞(EC)分化，将分离的CD34+细胞转移至1%(w/v)明胶包被的24孔板(2x105个细胞/孔)并且在5%CO2,37°C下于补充有18%(v/v)胎牛血清(FBS)和50ng/mL血管内皮生长因子(VEGF165)的内皮生长培养基(EGM-2)中进行温育。5天后并且随后每隔一天，用新鲜培养基替换一半体积的培养基。在分化测定结束时，利用荧光激活细胞分选术(FACS)和免疫荧光染色评估EC标志物的表达。细胞的功能性通过用乙酰化的低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)温育细胞来进行评估。

[0071] 本方法还可包括纤维蛋白凝胶制备程序。将细胞[CD34+细胞(0.5×105与3×105之间)、与CD34+衍生的EC(0.35×105)共培养的CD34+细胞(1×105或CD34+衍生的EC(0.35×105)]重悬浮于纤维蛋白凝胶前体溶液（50μL)（优选在1mL的具有切割针头的无菌注射器中）中。在37°C下开始聚合，使聚合进行超过30分钟。聚合后，从注射器取出细胞构建物，将其置于包含特定培养基的24孔板中，进行达10天。

[0072] 在本发明的另一个实施方案中，通过在凝血酶存在的情况下交联商购获得的纤维蛋白原来制备纤维蛋白凝胶。在其它情况下，可从患者血液样品分离纤维蛋白原。在两种情况下，纤维蛋白凝胶包含终浓度为约1mg/mL至约100mg/mL的纤维蛋白原和终浓度为约1U/mL至约500U/mL的凝血酶。在优选实施方案中，纤维蛋白凝胶包含终浓度为10mg/mL的纤维蛋白原和终浓度为2U/mL的凝血酶。在其它情况下，纤维蛋白凝胶获自商购可得的纤维蛋白密封剂（fibrin sealant），包括 Tisseel 或

[0073] 在本发明的另一个实施方案中，干细胞来自自体来源。在本发明的另一个实施方+案中，干细胞来自同种异基因来源。在另一个方面，干细胞对于CD34抗原是阳性的-CD34 细胞。

[0074] 在另一个方面，内皮细胞衍生自CD34+细胞。在不同的方面，CD34+细胞以1mL纤维蛋白凝胶中约10×102至约10×106个细胞的浓度存在，并且CD34+细胞对CD34+衍生的内皮细胞的比率为10:1至0.5:1。在本发明的其它方面，在CD34+衍生的内皮细胞不存在但在CD34+衍生的内皮细胞条件化培养基存在的情况下，CD34+细胞以1mL纤维蛋白凝胶中约10×102至约10×106细胞的浓度存在。

[0075] 在本发明的方面，将包含CD34+细胞和CD34+衍生的内皮细胞的纤维蛋白凝胶前体溶液用于处理由于血流损失的缺血组织。缺血可作为心血管疾病、糖尿病、中风、脑损伤、黄斑变性、慢性损伤等等的结果发生。在本发明的另一个方面，将包含CD34+细胞和CD34+衍生的内皮细胞的纤维蛋白凝胶前体溶液用于治疗糖尿病损伤。

[0076] 与CD34+细胞共培养的CD34+衍生的EC使细胞存活最大化并且 促成CD34+细胞至EC的分化，从而增强组合物的愈合潜能。共培养系统，但非单独的CD34+细胞或CD34+衍生的EC，可改善糖尿病动物模型的愈合动力学。再生作用由抗炎和促血管生成过程二者介导。该共培养方法可能在其它情况下被用于增强干细胞的功效和改善不同类型的损伤的再生。

[0077] 该令人惊讶的作用包括新型细胞因子、包括白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-10（IL-10)的分泌，以及CD34+细胞的ERK1/2途径的活化。本发明还显示与CD34+衍生的EC共培养的CD34+细胞的内皮分化由可溶性和不溶性因子的组合介导。该共培养系统的再生+ +潜能在慢性损伤糖尿病动物模型中得到证明。CD34 细胞与CD34衍生的EC的共移植通过减少炎症反应和增加损伤的血管新生来改善损伤愈合（相对于对照）。

[0078] 可对任何患者（无论年龄或性别）进行本发明的方法，虽然预期较老的受试者可特别获益。如本文中所用，较老的患者是60岁或更老的患者。在本说明书中应理解，优选受试者是哺乳动物，更优选人受试者。

[0079] UCB来源的CD34+细胞至EC的分化

[0080] 通过免疫细胞化学获得的结果显示未分化的CD34+细胞表达高水平的CD34(100%)和CD31标志物(85.46±17.0%,n=8)，掺入中等水平的Ac-LDL(12.86±10.4%,n=13)，并且未显示决定性内皮标志物vWF的表达(1A)。FACS分析确认了它们的CD34和CD31标志物的高表达、CD45（造血细胞的典型标志物）的高表达以及Flk-1/KDR和CD14(主要由巨噬细胞表达的标志物)的无表达(1B)。类似地，在基因水平上未观察到vWF表达，但观察到高CD34表达(2B)。因此，本研究中使用的UCB来源的CD34+群体是CD34+CD45+CD31+KDR2-vWF-CD14-。

[0081] 为了将CD34+细胞分化成EC，我们在明胶包被的平皿中将CD34+细胞(10×104细胞/cm2)培养在含有20%(v/v)的FBS和50ng/mL的VEGF165的EGM-2培养基中。通常地在15-20天的培养后，CD34+细 胞以鹅卵石样形态附着至培养皿并且随时间表达高水平的EC标志物，包括CD31、CD34和Flk-1/KDR(1C)。此外，分化的CD34+细胞对于CD31和细胞间粘附连接（adherent junction）上的VE-钙粘蛋白呈阳性染色，产生vWF并且能够掺入Ac-LDL(2A)(Ac-LDL是在EC中发现的典型标志物(8))。与EC表型一致，此类细胞不表达α-SMA，一种平滑肌细胞标志物(2A)。定量RT-PCR(qRT-PCR)分析显示CD34+衍生的EC表达EC标志物CD34和vWF，并且产生血管生成性生长因子，包括VEGF、PlGF和bFGF(2B)。PlGF生长因子在CD34+衍生的EC上的表达高于在CD34+细胞上的表达，然而对于bFGF观察到相反的情况。此外，qRT-+PCR结果显示血管生成性生长因子在CD34衍生的EC上的表达高于在HUVEC上的表达。

[0082] CD34+衍生的EC形成索状结构的能力也通过在由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶样蛋白质混合物-MatrigelTM的基膜中培养此类细胞来进行估量。与HUVEC类似，当在培养物中维持15小时时，CD34+衍生的EC能够自发地重组织成索状结构(9)。然而，CD34+衍生的EC的血管生成潜能高于HUVEC的血管生成潜能，如通过更多的肉芽（sprouts）数目和网络长度(2C)确认的。

[0083] 已显示纤维蛋白凝胶提供了进行内皮细胞粘着、迁移和三维组织的许可环境(Bieche I等人,2004,Hughes CG,2008)。然而，还不清楚纤维蛋白凝胶是否是CD34+细胞附着的有效基底。为此目的，将CD34+细胞涂铺在纤维蛋白凝胶或不同基底包被的24孔板上，通过显微镜术，通过计数3小时后附着的细胞数目来评估细胞附着。CD34+细胞对于纤维蛋白凝胶相较于对于聚苯乙烯平皿、胶原和纤连蛋白显示出更大的初始附着(3)。附着至纤维蛋白的CD34+细胞的数目分别为附着至胶原、聚苯乙烯和纤连蛋白的2.0倍(P,0.05)、4.0倍(P,0.01)和3.0倍(P,0.01)。

[0084] 随后，我们使用纤维蛋白凝胶包裹CD34+细胞。最初，我们就最佳的细胞存活研究细胞数目与凝胶体积之比的作用。10天后对于测试 的不同细胞密度，细胞存活性没有显著改变(10)。因此，将每50mL纤维蛋白凝胶中10×104个CD34+细胞用于随后的测试。纤维蛋白凝胶抵抗由CD34+细胞或CD34+衍生的EC(3.5×104细胞)或CD34+细胞与CD34+衍生的EC的共培养物(分别地10×104:3.5×104细胞)释放的金属蛋白酶引发的降解10天(11)。此外，在所有实验组中，细胞牵引没有随时间显著地减小凝胶直径(11)。

[0085] 通过共培养CD34+细胞与CD34+衍生的EC改善了细胞存活

[0086] 包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞在第2和第10天具有60-70%的存活性，在统计上低于(n=6,P,0.001)对于CD34+衍生的EC观察到的存活性(4A)。使用MTT测定法来测定包裹在凝胶中的细胞的代谢活性(4B)。CD34+细胞在第10天的代谢活性约为初始活性（第2天）的90%，从而表明细胞处于非增殖状态。

[0087] 定量LIVE/DEAD和MTT分析显示与CD34+衍生的EC共培养的CD34+细胞的细胞存活和增殖的明显增加(n=6，P，0.01或P，0.001)(4A、4B)。对于第6和第10天观察到该作用，虽然就代谢活性而言在第10天更显著。相反地，HUVEC不影响CD34+细胞的存活性(n=6，P>0.05)(4C)，这表明促存活作用明确地由CD34+衍生的EC介导。重要地，CD34+衍生的EC条件化培养基向由CD34+细胞形成的细胞构建物的添加导致细胞存活的明显增加(n=6，P<0.001)(4C)。

[0088] 这些结果表明CD34+衍生的EC对CD34+细胞的促存活作用至少部分由从EC释放的生物活性因子介导。

[0089] 磷酸肌醇酯-3激酶(PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径调节数个细胞过程，包括细胞存活。因此，我们分析了Akt和ERK途径对在无血清培养基中培养19小时、随后分别用EC或CD34+细胞条件化培养基处理的CD34+细胞或CD34+衍生的EC的活化。磷酸化蛋白质与总蛋白质之间的比率通过多重测定法(4D)来进+行测定。有趣地，ERK但非Akt途径在CD34细胞中被EC条件化培养基活化。因此，EC条件化培养基在CD34+细胞中的促存活作用似乎通过ERK途径的活化来介导。在另一个方 面，与对照相比较，未观察到CD34+条件化培养基对EC的ERK和Akt途径的显著活化。

[0090] 为了理解两种细胞之间的对话，我们使用细胞因子珠粒测定(5)来分析由包裹在+ +纤维蛋白凝胶中的CD34细胞、CD34衍生的EC或这两种细胞分泌的细胞因子。包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+衍生的EC分泌高水平(>100pg/mL)的IL-6、IL-8、IL-13和单核细胞趋化激活因子(MCAF)(5A)。在另一方面，包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞分泌高水平(>100pg/mL)的IL-8、IL-13和MCAF(5B)。令人惊讶地，当两种细胞被一起包裹在纤维蛋白凝胶中时，它们分泌高水平的前述细胞因子(IL-6、IL-8、IL-13和MCAF)以及另外的两种细胞因子IL-
10和IL-17(5C)。

[0091] CD34+细胞至纤维蛋白凝胶的附着在CD34+衍生的EC或EC条件化培养基存在的情况下得到增强

[0092] 为了研究共培养系统在支持CD34+细胞附着中的作用，将分离的CD34+细胞(10×104个细胞/孔)在(i)CD34+衍生的EC(3.5×104个细胞/细胞)存在的情况下，(ii)在EC不存在的情况下，或(iii)在EC不存在但EC条件化培养基存在的情况下培养在纤维蛋白凝胶的顶部。在培养7天后，通过洗涤除去非附着细胞，通过相差显微镜计数附着的细胞。当在EC不存在的情况下，在EC存在的情况下或在EC不存在但在EC条件化培养基存在的情况下培养时，分别有5.5±10.4%(n=17)、22.4±20.9%(n=15)和44.2±33.2%(n=18)的CD34+细胞附着+
至凝胶。CD34细胞回收的差异不能通过细胞凋亡/坏死的差异来解释，因为只有小部分(低于10%)的细胞受到细胞凋亡/坏死影响(6A)。然而，当将细胞培养在EC条件化培养基而非基础培养基中时，细胞凋亡和坏死被显著阻碍(P<0.05)。

[0093] CD34+细胞至EC的分化在CD34+衍生的EC存在的情况下得到增强

[0094] 随后，我们评估了共培养系统支持CD34+细胞至EC分化的潜能。为了该目的，(i)在CD34+衍生的EC(3.5×104个细胞/孔)存在的情况下， (ii)在EC不存在的情况下或(iii)在EC不存在但在EC条件化培养基存在的情况下，将CD34+细胞(10×104个细胞/孔)培养在纤维蛋白的顶部。在培养7天后，利用荧光显微镜术(6B)评估细胞摄取Ac-LDL（一种内皮标志物）的能力。DiI-标记的Ac-LDL的摄取从分离的CD34+细胞上的12%增加至在CD34+衍生的EC存在的情况下分化后的70%(P<0.001)。在培养在无细胞的纤维蛋白(基础培养基，7天)上的CD34+细胞上相较于原始CD34+细胞(时间0点)未观察到Ac-LDL表达的统计学上显著的增加。因此，结果表明CD34+细胞至EC的分化在CD34+衍生的EC存在的情况下得到显著改善。因为未观察到培养在EC条件化培养基中的CD34+细胞的Ac-LDL摄取的统计上的增加，因此CD34+细胞的内皮分化可能由可溶性与不溶性因子的组合介导。我们还通过qRT-PCR评估了与EC共培养并且包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞(6C)的分化。EC标志物(vWF和CD34)的表达与包裹在纤维蛋白凝胶中的EC或CD34+细胞相似或高于它，表明凝胶中的大部分细胞表达内皮标志物。

[0095] CD34+细胞与CD34+衍生的EC的共移植促进糖尿病小鼠的损伤愈合

[0096] 在慢性创伤动物模型中进一步评估了我们的组织工程方法的疗效。在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的前背侧和后背侧区域产生损伤。利用单独的纤维蛋白凝胶覆盖损伤之一以用作内部对照，利用含有1×105个CD34+细胞或1×105个CD34+细胞与0.35×105个从CD34++细胞衍生的EC的凝胶(7A)覆盖其它损伤。在创伤后3天，利用含有CD34 细胞与EC的共培养物的凝胶处理的损伤相较于利用PBS处理的损伤的损伤面积在统计学上更低(P<0.05，n=
6)，从而显示了改善的闭合动力学。对于其余实验组，相对于对照未观察到统计上的差异(P>0.05，n=6)。在第10天，尽管统计上没有差异，但利用含有细胞的共培养物的凝胶处理的损伤显示了与利用PBS处理的损伤相比较更大的面积减小。对于其余组未观察到实验组与对照组之间的此类差异。

[0097] 我们随后使用非侵袭性实时荧光成像术(CellVizio)评估了移植的 细胞的存活。第3天，在利用CD34+和CD34+衍生的EC的共培养物处理的小鼠中细胞存活低(8.9±11.7%，n=
4)。第10天，切取的损伤物的qRT-PCR分析显示不存在人细胞(数据未显示)。这表明细胞共培养物的疗效可能在愈合过程的早期产生。

[0098] CD34+细胞与CD34+衍生的EC的共移植增加早期血管新生并且减少炎症过程[0099] 因为干细胞和后代可通过血管新生促进组织的再生，所以在第3天，我们使用vWF作为血管标志物通过免疫荧光评估了毛细血管密度(7B)。对于包含干细胞的实验组，相对于单独的凝胶的组，观察到微血管的密度的显著增加(P<0.001)。这表明再生作用的一部分可能通过血管新生过程来介导。

[0100] 干细胞及其后代的再生作用还可能通过创伤位置上的炎症的减少来介导。因此，利用qRT-PCR评估了炎症标志物的表达。髓过氧化物酶(MPO)、CD3ε和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分别是嗜中性粒细胞、T细胞和炎症细胞因子存在的标志物。虽然是统计学上不显著的(P+ +>0.05,n=9)，但利用含有CD34 细胞与CD34 衍生的EC的共培养物的凝胶(12)处理的损伤的炎症反应（考虑全部3个标志）相较于对照即利用单独的凝胶处理的损伤获得减少。该作用在蛋白质水平上通过多重测定(7)得到进一步确认。与先前的研究一致(May WS,2000)，IL-
1β、TNF-α、IL-6和GM-CSF在愈合过程中在早期阶段在所有实验组中表达。然而，TNF-α的分+ +
泌在利用单独的凝胶处理的损伤中相较于利用凝胶包裹的CD34 和CD34衍生的EC或单独的CD34+细胞(7B)处理的损伤中在统计上(P<0.05)更高。这些结果表明干细胞及其后代能够在损伤的位置减轻炎症过程，促进愈合进展。

[0101] 本发明基于可从UCB分离或来源于其的3种组分：造血干细胞(CD34+细胞)，改善干细胞存活并且指导它们至血管细胞的分化的CD34+衍生的EC，和在植入位置上保留这两种细胞的纤维蛋白凝胶。我们显示利用包裹在纤维蛋白凝胶中的这两种类型的细胞的组合处理的糖尿病慢性损伤相较于利用仅包含干细胞的凝胶处理的损伤具有改 善的愈合。

[0102] 我们的结果显示纤维蛋白凝胶相较于胶原凝胶、纤连蛋白或组织培养聚苯乙烯支持更高的CD34+细胞附着。通过利用凝血酶交联纤维蛋白原（两种血浆来源的组分）获得的纤维蛋白凝胶具有它们通过其可与细胞整联蛋白相互作用的RGD和AGDV位点。

[0103] 从UCB来源的CD34+细胞分化的EC具有优于原代EC(HUVEC)的血管生成性质。这通过它们分泌更高水平的血管生成因子、包括VEGF、PlGF和bFGF，以及在由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物-MatrigelTM中产生更多数目的肉芽和更大的网络的能力(2)来确认。这似乎特异于来源于脐带血的EC，因为外周血来源的人内皮祖细胞具有与HUVEC相似的血管生成性质。

[0104] 当将CD34+细胞和CD34+衍生的EC包裹在纤维蛋白凝胶中时，它们对话，如通过特异性细胞因子的分泌确认的。包裹在纤维蛋白凝胶中的单独CD34+衍生的EC分泌高水平的IL-+6、IL-8、IL-13和MCAF，而包裹在纤维蛋白凝胶中的单独CD34 细胞产生高水平的IL-8、Il-
13和MCAF。

[0105] 当将这两种类型的细胞同时包裹在纤维蛋白凝胶中时，除了由每一个细胞类型分泌的细胞因子外，它们还分泌两种新的细胞因子：细胞因子IL-17和IL-10。IL-17是已报导+由T淋巴细胞和单核细胞(CD14细胞)产生的细胞因子。

[0106] IL-17在EC中的结合刺激IL-6、IL-8、转化生长因子β(TGF-β)和MCAF的产生并且刺激EC迁移和管形成。IL-10是由不同细胞群体包括CD34+细胞和EC产生的细胞因子。IL-10活性通过其与在多种细胞、包括CD34+细胞和EC上表达的IL-10受体相互作用介导。在我们的研究中，还不清楚IL-10是由CD34+细胞分泌的还是由CD34+衍生的EC分泌的，不清楚IL-10是作用于两种细胞还是仅作用于一种类型的细胞。重要地，已报导IL-10增加CD34+细胞的Bcl-2表达和存活。在本研究中，我们显示纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞的附着、 存活性、增殖和血管分化得到改善，以通过共培养此类细胞与CD34+衍生的EC来增强例如损伤愈合。重要地，促存活作用特异于CD34+衍生的EC，因为原代EC(HUVEC)不具有这样的作用。我们的结果还显示CD34+细胞的存活、增殖和至纤维蛋白凝胶的附着最可能由CD34+衍生的EC分泌的+生物分子介导，因为从此类细胞收集的条件化培养基具有类似的诱导效应。然而，CD34 细胞至EC的分化可能由可溶性因子与不溶性因子的组合介导，因为单独的CD34+衍生的EC条件化培养基不促进CD34+细胞的分化。

[0107] 在CD34+衍生的EC存在的情况下，CD34+细胞的改善的附着和存活性可能由生长因+子和细胞因子介导。已报导VEGF、IL-3、IGF-I和IL-10参与CD34 细胞的存活。我们显示VEGF在包裹在纤维蛋白凝胶中的CD34+细胞和CD34+衍生的EC(7)中在基因水平上高度表达，从而可能解释CD34+细胞的改善的存活。可能促进CD34+细胞的存活的另一种因子是IL-10(参见上文)。在本发明中，我们发现在EC存在的情况下CD34+细胞的改善的附着由可溶性因子介+
导。已显示由EC表达的可溶性P-选择蛋白对于由CD34细胞表达的P-选择蛋白糖蛋白配体-
1(PSGL-1)的结合激活CD34+细胞上的细胞粘附分子，特别是αvβ5整联蛋白。此类整联蛋白的表达有利于对纤维蛋白原的附着(Weisel JW,2009)。类似机制可能解释我们的共培养系统中的改善的细胞附着。

[0108] CD34+衍生的EC但非由此类细胞条件化的培养基快速诱导CD34+细胞至EC的分化。在CD34+衍生的EC存在的情况下培养7天的CD34+细胞能够摄取DiI标记的Ac-LDL(70%的细胞（) EC的功能特征）。

[0109] 这些结果表明细胞间相互作用或由EC合成的细胞外基质早期参与血管分化的诱导。然而，诱导机制仍然不清楚。有趣地，最近已针对间充质干细胞描述了由EC产生的细胞外基质对血管分化的诱导(Vellenga E等人,2009)。实施方案

[0110] 材料和方法

[0111] 利用荧光染料对活细胞的染色

[0112] 将细胞以1×106细胞/mL的密度悬浮于无血清培养基(M199)，每mL细胞悬浮液添加5-10μL染料[5(6)-二醋酸羧基荧光素N-琥珀酰亚胺酯(CFSE;Sigma-Aldrich)或DiD细胞标记溶液（优选来自Invitrogen）]，通过轻轻地用移液器吸打充分混合。在于37°C下温育达30分钟后，离心标记的细胞悬浮液，除去上清液，将细胞重悬浮于温(37°C)M199培养基中。随后在温培养基中洗涤细胞2次，最终重悬浮于选择的培养基。对于附着至培养板或瓶的细胞，进行类似方法（按需要进行调整的）。CFSE在脱乙酰基作用后形成绿色荧光缀合物，而DiD标记的细胞显示红色荧光。

[0113] 由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物-MatrigelTM测定

[0114] 利用每孔0.4mL的由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋TM白质混合物-如例如Matrigel（来自BDBiosciences）包被24孔板，在37°C下温育30分钟。将CD34+衍生的内皮细胞(第4次传代)或HUVEC以每300μL EGM-2培养基中1×105个细胞的浓度接种在聚合的所述MatrigelTM的顶部。细胞未被标记或先前已用CFSE或 DiD进
行了标记。在于37°C下进行1小时的温育后，添加1mL的EGM-2。在细胞接种后15或48小时，利用相差显微镜术，优选来自Carl Zeiss International的Zeiss Axiovert40C评估索状结构的形成。

[0115] 纤维蛋白凝胶的制备

[0116] 通过在凝血酶存在的情况下交联纤维蛋白原（优选两者来自Sigma-Aldrich）来形成纤维蛋白凝胶。通过将人纤维蛋白原溶解在Tris缓冲盐溶液(TBS),pH7.4(20mg/mL)中，随后通过0.22μm注射器式过滤器（优选Acrodisc的）过滤进行灭菌来制备纤维蛋白原溶液。 通过将人凝血酶以50U/mL的浓度溶解在pH7.4的TBS中来制备新鲜凝血酶溶液。通过将3种不同的组分：纤维蛋白原(10mg/mL)、CaCl2，优选来自Merck(2.5mM)和凝血酶(2U/mL)混合来制备纤维蛋白凝胶(50μL，除非另外指明)。使该溶液在37°C和100%相对湿度下胶化。

[0117] 纤维蛋白凝胶的降解

[0118] 通过将优选Alexa 488人纤维蛋白原缀合物（优选来自Invitrogen）(0.156mg)与未标记的纤维蛋白原(9.844mg)在1mL TBS中混合来制备凝胶前体溶液。通过它们的荧光的减少来间接估量具有或不具有细胞的纤维蛋白凝胶随时间的降解速率。立即在时间零点上和在期望的时间点上测量它们的荧光。通过用200μL的TBS中的人纤溶酶（plasmin）（优选来自Sigma-Aldrich）溶液(0.006U/凝胶)在37°C下过夜温育来诱导凝胶的完全降解。离心后，在SPECTRAmaxGemini EM荧光微量板读数器（优选来自Molecular Devices）中在520nm处测量上清液级分的荧光。

[0119] 细胞构建物的存活性和代谢活性

[0120] 使用LIVE/DEAD试剂盒（优选来自Invitrogen）测量细胞构建物的细胞存活性。将包含包裹的细胞的凝胶于PBS中洗涤，在37°C下浸没在工作溶液（PBS中的2μg/mL钙黄绿素AM和4μg/mL乙啡啶同质二聚体-1）中进行30分钟，在Zeiss Axiovert200M荧光倒置显微镜下进行显现。

[0121] 在2、6和10天的培养后，通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，优选来自Sigma-Aldrich的MTT测定法测量细胞构建物的代谢活性。将MTT溶液(1mL,0.5mg/mL，于其中已培养了细胞的相同类型的培养基中)添加至含有细胞构建物的每一个孔中，在37°C下温育4小时。在该时间后，将细胞构建物置于1.5mL聚丙烯管中，添加0.15mL的二甲基亚砜，优选来自Merck的DMSO。使用组织匀浆器将构建物打散，以释放由呈现线粒体代谢活性的细胞形成的甲臜晶体。将甲臜晶体溶解在DMSO中，在微量板分光光度计优选来自 BioTek的PowerWave XS中在540nm处通过分光光度计测量它们的吸光度。

[0122] FACS分析

[0123] 通过暴露于细胞解离缓冲液（优选来自Invitrogen）中5-10分钟并且轻轻地用移液器吸打从培养板分离细胞，将细胞离心，最终重悬浮于补充有5%(v/v)FBS的PBS中。将单细胞悬浮液等分(1.25-2.5×105细胞/条件)，用同种型对照或抗原特异性抗体：抗人PECAM1-FITC（优选来自BD Biosciences Pharmingen）、CD14-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（优选全部来自Miltenyi Biotec）和KDR/Flk1-PE（优选来自R&D Systems）进行染色。在不固定的情况下在FC500流式细胞仪（优选来自Coulter）上，使用碘化丙啶(7-AAD存活性染色溶液；优选来自bioNova )分析细胞以排除死亡细胞。使用Coulter FC分析软件进行数据分析。

[0124] 免疫染色

[0125] 在室温下利用4%(v/v)多聚甲醛（优选来自EMS）固定细胞15-20分钟。在利用0.1%(v/v)Triton X-100（优选来自Sigma-Aldrich）透化细胞10分钟（每当需要时）和利用1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液（优选来自Sigma-Aldrich）封闭30分钟后，利用下列第一小鼠抗人单克隆抗体：PECAM1、CD34、von Willebrand因子(vWF)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC（) 优选全部来自Dako）和VE-钙粘蛋白(VE-CAD（) 优选来自Santa Cruz Biotechnology）对细胞染色，进行1小时。在每一个免疫荧光实验中，使用同种型匹配的IgG对照。利用抗-小鼠IgG Cy3缀合物（优选来自Sigma-Aldrich）来检测一抗对特定细胞的结合。利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（优选来自Sigma-Aldrich）对细胞的细胞核进行染色。在间接标记后，利用Zeiss荧光显微镜检查细胞。

[0126] 关于DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的摄取，用10μg/mL DiI标记的Ac-LDL在37°C下温育细胞4小时。在温育后，将细胞在EGM-2中洗涤3次，利用4%(v/v)多聚甲醛固定30分钟， 在荧光显微镜下进行显现。

[0127] 定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析

[0128] 将细胞构建物冷冻，随后在冷研钵中，在液氮下研磨成细粉，转移至在聚丙烯管，在Trizol试剂（优选来自Invitrogen）中均化，按照制造商的说明书，使用RNeasy Mini试剂盒（优选来自Qiagen）提取总RNA。当起始材料是冷冻的小鼠皮肤时，将组织样品在TissueLyser II装置（优选来自Qiagen）的装有5mm直径的不锈钢珠粒（优选来自Qiagen）的2mL管中于Trizol中以30Hz破碎2分钟（2次）。当始于细胞悬浮液时，在Trizol中离心和匀化细胞。在所有情况下，使用Taqman逆转录试剂（优选来自Applied Biosystems）从1μg总RNA制备cDNA。使用Power SYBR Green PCR预混合物（优选来自Applied Biosystems）进行定量PCR(qPCR)，在7500Fast Real-Time PCR系统（优选来自Applied Biosystems）中进行检测。
相对于参照(人或小鼠，取决于被分析的细胞的类型)GAPDH基因进行靶基因的定量:相对表达=2[-(Ct样品-CtGADPH)]。从4个独立反应计算平均最小循环阈值(Ct)。作为支持信息公布引物序列(16)。

[0129] 细胞因子分泌分析

[0130] 按照制造商的说明书，在Bio-Plex200系统（优选来自Bio-Rad）中，使用Bio-Plex Pro人细胞因子17-Plex Panel测定或Bio-Plex Pro小鼠细胞因子8-Plex测定（优选两者来自Bio-Rad,Hercules,CA,USA）评估细胞培养上清液和蛋白质分离物。人组I17-Plex Panel由下列分析物组成：白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8;IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白质(单核细胞趋化激活因子[MCP-1(MCAF)]、巨噬细胞炎症蛋白质-β(MIP-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。小鼠组I8-Plex Panel包含下列分析物：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。将小鼠Singleplex/x-Plex IL-6珠粒区域与这些分析物组合。收集上清液培养基样品，离心以除去沉淀，然后 冷冻。按照制造商的推荐，使用Bio-Plex细胞裂解试剂盒（优选来自Bio-Rad），在TissueLyser II装置（优选来自Qiagen）中以30Hz(两次)破碎2分钟的冷冻小鼠皮肤组织样品分离蛋白质。使用0.2至3.200pg/mL的标准范围。以一式三份运行样品和对照，以一式二份运行标准物和空白。

[0131] 总的和磷酸化的Akt和ERK蛋白水平的分析

[0132] 通过在无血清M199培养基（具有Earle's盐、L-谷氨酰胺（优选来自Sigma-Aldrich））中饥饿细胞19小时，随后处理它们10分钟（通过用细胞条件化的M199或新鲜的M199替换培养基来进行），来促进CD34+细胞和CD34+衍生的EC的Akt和细胞外信号调节的激酶(ERK)的激活。已通过将EC在M199中培养24小时(每mL培养基0.75×105个细胞)、取出培+养基、然后对其过滤灭菌来获得用于CD34 细胞处理的条件化M199。已通过在M199中培养CD34+细胞24小时(每mL培养基2×105个细胞)、取出培养基，然后对其过滤灭菌来获得用于EC处理的条件化M199。在处理后，按照制造商的推荐，使用Bio-Plex细胞裂解试剂盒（优选来自Bio-Rad）从附着至板或悬浮的细胞分离蛋白质。按照制造商的说明书，使用来自Bio-Rad的Bio-Plex试剂盒测定Akt和ERK磷酸化的水平。

[0133] CD34+细胞的细胞凋亡和坏死的测定

[0134] 为了测定CD34+的细胞凋亡和坏死，将0.30×105个CD34+细胞在24孔板中于EGM-2培养基或被EC条件化的EGM-2中培养在500μL纤维蛋白凝胶的顶部。在7天的培养后，按照制造商的推荐，使用  Apoptosis Assay试剂盒#3(FITC膜联蛋白V/碘化丙啶（优选来自Invitrogen）评估细胞凋亡/坏死。该测定检测细凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸的外化（externalization）。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的胞质表面。碘化丙啶将坏死细胞染成红色荧光。

[0135] 动物

[0136] 本研究的所有方案都由University of Coimbra的医学院的伦理委员会批准。将购自Charles River（优选来自Wilmington)的重量为20 至30g的雄性C57BL/6野生型小鼠(10-12周龄)圈养在常规动物设施中，采用12小时光照/12小时黑暗的方案，随意取食普通饲料。

[0137] 1-糖尿病和皮肤损伤的诱导

[0138] 通过单次腹膜内注射200μL pH4.2柠檬酸盐缓冲液中的150mg/kg的链脲霉素（优选来自Sigma-Aldrich）来诱导小鼠的糖尿病，在糖尿病代谢状态诱导后6-8周使用动物。在STZ处理后，使用利用葡萄糖测试条的血糖测计仪（优选Accu-Chek Aviva,Roche）每周监测血糖，在本研究中只使用具有高于300mg/dL的血糖水平的动物。注射胰岛素(16-32U/Kg或0.4-0.8U/小鼠，Sigma-Aldrich)，仅为了维持体重。

[0139] 为了评估对利用支架中的干细胞的处理的损伤愈合反应，在糖尿病诱导后6-8周，使小鼠经历皮肤损伤的产生。通过赛拉嗪/氯胺酮溶液[盐酸氯胺酮，10mg/mL，优选Imalgene,50mg/kg的体重，和盐酸赛拉嗪，2mg/mL，优选来自 10mg/kg的体重]的肌内注射麻醉动物，使动物在热垫(37°C)上恢复。剃除腰背侧皮肤上的毛发，在用聚维酮碘溶液、优选 对该区域消毒后利用无菌活检穿孔器产生两处延伸至脂肪
组织的6mm直径的全层厚度的切除损伤。损伤在纵向上是对齐的，并且相隔足够量的非创伤皮肤。

[0140] 2-损伤处理

[0141] 通过在损伤产生后，立即在其上单次局部施用选择的处理来评估包裹在纤维蛋白凝胶中的干细胞及其后代对损伤愈合的假定疗效。在每一只动物中，将25μL包含1×105个人脐带血CD34+细胞（单独地或与0.35×105CD34+衍生的内皮细胞或0.35×105个CD34+衍生的EC组合地）的纤维蛋白凝胶前体在顶部（在动物的一半中）或底部位置施用在损伤之一上，让其聚合，而在另一个损伤上，仅施用不具有细胞的纤维蛋白凝胶(在相同实验组中)或PBS(在其余组中)作为内部对照。所有细胞先前已用CFSE标记。

[0142] 通过测量损伤面积监测损伤闭合的进展。为了测定损伤闭合的速率，在具有毫米标度的透明纸上描迹切除损伤，使用计算机成像分析 优选AxioVision4.8估计损伤面积，将损伤面积的变化计算为已愈合的损伤面积的百分比。在创伤后立即以及在之后1、3、5、8和10天进行测量。在相同的时间点上对损伤进行拍照。

[0143] 利用基于纤维的非侵袭性共聚焦显微镜，优选 监测第0天和第3天的细胞体内分布。用于图像采集的S-1500光学探针具有1.5mm的直径，提供了恰好低于生物组织表面的图像，层面厚度为15μm，侧向分辨率为5μm。在至少3只小鼠中定量位于损伤中的荧光标记的细胞。

[0144] 3-切除损伤的分析

[0145] 在创伤后第3或第10天麻醉动物，通过颈椎脱位术处死动物，收集位于损伤中央并且包含损伤边缘的直径10mm的皮肤活检样本。

[0146] 将每一个活检样品切成两半，将其之一包埋在充满O.C.T.优选Tissue /Shandon （来自Thermo Fisher Scientific,Waltham）的冷冻切片包埋模具中，在干冰中冷冻，在-70°C下冷藏保存，而将另一半在液氮中快速冷冻，也在-70°C下保存。在冷却至-20°C的Leica CM3050S低温恒温器、优选Leica,Wetzlar中将O.C.T.包埋的样品连续切成7μm切片，对一些切片进行针对vWF的免疫染色以测定总毛细血管密度(人和小鼠)。利用兔抗vWF(1:300;优选来自Dako)染色，随后利用缀合有山羊Cy3的抗-兔IgG(1:60;
优选来自Sigma-Aldrich)进行染色。对其余皮肤活检样品进行qPCR分析，以测定人细胞的总数。利用苏木精和伊红(H&E)对其它切片进行组织学染色。

[0147] 本发明当然绝不限定于描述的实施方案，并且本领域技术人员在不背离所附权利要求确定的本发明的基本思想的情况下将预见许多其变动的可能性。

[0148] 下列权利要求展示了本发明的具体实施方案。