一种拟堇花兰快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种堇花兰快速繁殖方法：以拟堇花兰花梗为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌10min，接种于初始诱导培养基上，30d后获得丛生芽，丛生芽分切后在生根培养基上，30d后获得无菌生根苗；无菌苗叶片接种至胚状体诱导培养基，培养35d后，叶片切口处诱导出胚状体；将诱导出的胚状体转接至胚状体增殖分化培养基，分化形成类圆球茎及小植株；将类原球茎以及小植株接种到丛生芽增殖培养基上；丛生芽分切后接种至生根培养基上，30d后获得拟堇花兰无菌生根苗；待无菌苗长有2～3条根时，进行炼苗移栽。

权利要求

1.一种拟堇花兰快速繁殖方法，其特征在于，以拟堇花兰花梗为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌10min，接种于初始诱导培养基上，其成分为：3g/L花宝1号+2mg/L6-BA+0.5-1mg/L NAA，30d后获得丛生芽，丛生芽分切后在成分为：3g/L花宝1号+1.5mg/L NAA+蔗糖20g/L的生根培养基中培养，30d后获得拟堇花兰无菌生根苗；

挑选高度约2.5cm生长状态良好的拟堇花兰无菌生根苗作为胚状体诱导的材料，在无菌条件下取生根苗第3-4片叶，将叶片切成长约1cm的段，接种至胚状体诱导培养基，其成分为：3g/L花宝1号+2mg/LTDZ+0.5～1.5mg/L NAA；培养35d后，叶片切口处诱导出胚状体；将诱导出胚状体的叶片转接至胚状体增殖分化培养基，其成分为：3g/L花宝1号+1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA；培养30d，此时胚状体已分化出类原球茎及小植株；将类原球茎以及小植株接种到丛生芽增殖培养基上，其成分为：3g/L花宝1号+2mg/L6-BA+0.5～1mg/L NAA；

每20d继代一次，类原球茎逐渐分化为小植株，并以丛生芽的形式不断增殖；丛生芽分切后接种至生根培养基上，其成分为2mg/L花宝1号+1.5mg/L NAA+蔗糖20g/L，30d后获得拟堇花兰无菌生根苗；除生根培养基外，所有培养基均添加蔗糖30g/L，固体培养基添加琼脂粉7g/L，pH值均为6.5；培养条件为温度25℃，光照16h/d，光强3000Lux待无菌苗长有2～

3条根时，进行炼苗移栽，揭开培养瓶的瓶盖，于室内自然光下炼苗5-7d后，小心取出瓶苗，洗净根部附着的培养基，稍晾干，当根部变白时用湿水苔包裹种植，温度控制在24-26℃，湿度保持在90％。

说明书

一种拟堇花兰快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本专利涉及植物细胞工程技术领域，特别是涉及拟堇花兰(Ionopsis utricularioides)叶片胚状体诱导及培养技术，应用于组培快繁、遗传转化、诱变育种等研究。

背景技术

[0002] 拟堇花兰原产于墨西哥、巴西、巴拉圭和西印度群岛等地，近几年从国外引进的新奇花卉。拟堇花兰花多美丽、色泽艳丽、花期长，在国外作为盆花广泛栽培。拟堇花兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，繁殖方式主要是以分株繁殖为主，繁殖率低。

发明内容

[0003] 本发明以拟堇花兰花梗为外植体建立无菌操作体系，诱导无菌苗叶片获得胚状体，将胚状体进一步培养，获得完整植株，从而快速繁殖拟堇花兰。

[0004] 本发明的技术方案如下：

[0005] 以拟堇花兰花梗为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌10min，接种于初始诱导培养基上，其成分为：3g/L花宝1号(美国花宝公司HYPONeX，下同)+2mg/L6-BA+0.5-1mg/L NAA，30d后获得丛生芽，丛生芽分切后在生根培养基上，成分为：3g/L花宝1号+1.5mg/L NAA+蔗糖20g/L中培养，30d后获得拟堇花兰无菌生根苗。

[0006] 挑选高度约2.5cm生长状态良好的拟堇花兰无菌生根苗作为胚状体诱导的材料，在无菌条件下取生根苗第3-4片叶(将顶芽附近长度超过1.5cm的叶片记为第1片叶)，将叶片切成长约1cm的段，接种至胚状体诱导培养基，该诱导培养基成分为：3g/L花宝1号+2mg/L TDZ+0.5～1.5mg/L NAA。培养35d后，叶片切口处诱导出胚状体。将诱导出胚状体的叶片外植体转接至胚状体增殖分化培养基。培养基成分为：3g/L花宝1号+1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA。培养30d，此时胚状体已分化出类原球茎及小植株。将类原球茎以及小植株接种到丛生芽增殖培养基上，丛生芽增殖培养基成分为：3g/L花宝1号+2mg/L6-BA+0.5～1mg/L NAA。每20d继代一次，类原球茎逐渐分化为小植株，并以丛生芽的形式不断增殖。丛生芽分切后接种于生根培养基上，生根培养基成分为2mg/L花宝1号+1.5mg/LNAA+蔗糖20g/L中培养，30d后获得获得拟堇花兰无菌生根苗。待无菌苗长有2～3条根时，进行炼苗移栽，揭开培养瓶的瓶盖，于室内自然光下炼苗5-7d后，小心取出瓶苗，洗净根部附着的培养基，稍晾干，当根部变白时用湿水苔包裹种植，温度控制在24-26℃，湿度保持在90％左右，成活率在85％以上。移栽6个月后，即可开花。本发明所有培养基未经特殊说明的均添加蔗糖30g/L，固体培养基添加琼脂粉7g/L，pH值均为6.5；培养条件为温度25℃，光照16h/d，光强3000Lux。

[0007] 本发明为拟堇花兰组织培养提供了新途径；为研究揭示拟堇花兰细胞分化、形态发生及个体发育等理论问题开拓了一个新领域。

附图说明

[0008] 图1为拟堇花兰Ionopsis utricularioides离体再生，a拟堇花兰Ionopsis utricularioides花照片，b经表面灭菌后接种到诱导培养基的花梗外植体，c花梗外植体诱导得到的丛生芽，d、继代培养的丛生芽，e生根培养，f出瓶6个月的开花植株；

[0009] 图2为胚状体诱导阶段体视显微镜观察，a培养中的叶片外植体，b、c、d叶片外植体切口处形成的球形体细胞胚。

[0010] 图3为胚状体增殖阶段发育为类原球茎并分化成植株，a外植体切口处直径约700μm的类原球茎，b外植体切口处径约1200μm的类原球茎，c外植体切口处的部分类原球茎开始分化，d已分化完成的小植株。

[0011] 图4为类原球茎分化过程，a尚未分化的类原球茎，b类原球茎开始分化出叶原基，c类原球茎分化出第一片叶，d分化完成的植株。

具体实施方式

[0012] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0013] 以拟堇花兰花梗为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌10min，接种于初始诱导培养基上(图1-b)，其成分为：3g/L花宝1号+2mg/L6-BA+0.5-1mg/LNAA，处理接种30个外植体，并重复3次。30d诱导产生丛生芽(图1-c、d)，丛生芽诱导率为81.11±4.01。

[0014] 丛生芽诱导率＝诱导出不定芽的外植体数/未污染外植体数×100％[0015] 丛生芽分切后在生根培养基上，成分为：3g/L花宝1号+1.5mg/L NAA+蔗糖20g/L中培养，处理接种30个外植体，并重复3次。30d后产生不定根(图1-e)，其生根率为81.11±2.94，平均根长为2.74±0.04，平均根数为2.74±0.03，生根系数为6.10±0.27。
待无菌苗长有2～3条根时，进行炼苗移栽，揭开培养瓶的瓶盖，于室内自然光下炼苗5-7d后，小心取出瓶苗，洗净根部附着的培养基，稍晾干，当根部变白时用湿水苔包裹种植，温度控制在24-26℃，湿度保持在90％左右，成活率在85％以上。移栽6个月后，即可开花(图
1-f)。

[0016] 生根率＝生根苗数/接种数×100％

[0017] 平均根数＝生根条数/生根苗数

[0018] 平均根长＝总根长/生根条数

[0019] 生根系数＝生根率×平均根数×平均根长

[0020] 挑选高度约2.5cm生长状态良好的拟堇花兰无菌生根苗作为胚状体诱导的材料，在无菌条件下取生根苗第3-4片叶(将顶芽附近长度超过1.5cm的叶片记为第1片叶)，将叶片切成长约1cm的段，接种至胚状体诱导培养基上(图2-a)。诱导培养基成分为：3g/L花宝1号+2mg/L TDZ+0.5～1.5mg/L NAA。，处理接种30个外植体，并重复3次。培养35d，诱导产生球形胚状体(图2-b、c、d)，其诱导率(％)为87.78±2.94，平均胚状体个数(个/外植体)为26.16±2.33。

[0021] 胚状体诱导率＝诱导出胚状体的外植体个数/接种外植体个数×100％[0022] 平均胚状体个数＝胚状体总数/诱导出胚状体的外植体个数

[0023] 将诱导出胚状体的叶片外植体转接至胚状体增殖分化培养基中。成分为：3g/L花宝1号+1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA。每个处理接种10个外植体，并重复3次。接种完成后，将材料置于25℃，3000Lux光照16h/d条件下培养30d，胚状体不断增大形成类原球茎(图3-a、b)，并逐步分化(图3-c)，最终分化形成小植株(图3-d)。统计数据，PLBs鲜重(mg/外植体)为37.28±1.67，已分化植株数(株/外植体)为11.53±1.11。

[0024] PLBs鲜重＝PLBs总鲜重/外植体总数

[0025] 已分化植株数＝已分化植株总数/外植体总数

[0026] 将类原球茎以及小植株接种到丛生芽增殖培养基中，成分为：3g/L花宝1号+2mg/L6-BA+0.5～1mg/L NAA。接种完成后，将培养材料置于25℃，3000Lux光照16h/d条件下培养，每20d继代一次，类原球茎逐渐分化为小植株，其分化过程是类原球茎开始分化出叶原基，培养一段时间后类原球茎分化出第一片叶，继而分化完成的植株如图4(图4-a、b、c、d)。并以丛生芽的形式不断增殖，60d后统计增殖系数及丛生芽长势，增殖系数
2.50±0.06，丛生芽长势良好。

[0027] 增殖系数＝增殖的有效芽数/接种数

[0028] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。