一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法。涉及一种支架材料的制备加工技术领域。包括由菌株发酵产生的细菌纤维素经纯化处理、切割、冷冻干燥得到细菌纤维素支架。采用计算机断层扫描技术构建细菌纤维素支架三维结构的数字模型，利用数字模型设计特定的三维陈列微孔结构。将所需细菌纤维素三维陈列微孔结构的数字模型导入二氧化碳激光打孔机中，在-5～10℃环境下进行加工，加工后的细菌纤维素支架经二次蒸馏水清洗，冷冻干燥得到细菌纤维素三维陈列微孔支架。本发明工艺简单，操作方便，可通过控制工艺参数等方法调控支架的微孔尺寸和三维陈列孔的结构，制备的三维陈列微孔支架可应用于构建皮肤、骨、软骨、血管等组织工程领域。

权利要求

1.一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：

（1）由菌株发酵产生的细菌纤维素经纯化处理、切割、冷冻干燥得到细菌纤维素支架；

（2）采用计算机断层扫描技术构建细菌纤维素支架三维结构的数字模型，以数字模型重心为原点，细菌纤维素支架接种细胞时的接种面向下投影为XY平面建立三维坐标系，利用数字模型设计特定的三维陈列微孔结构；

（3）将所需的细菌纤维素三维陈列微孔结构数字模型导入二氧化碳激光打孔机中，在-5～10℃环境下进行加工，加工后的细菌纤维素支架经二次蒸馏水清洗，冷冻干燥得到细菌纤维素三维陈列微孔支架，所述的冷冻干燥温度为：-40～-10℃条件下。

2.如权利要求1的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：所述的能发酵产生细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

3.如权利要求1的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：所述的经纯化处理、切割、冷冻干燥得到细菌纤维素支架其外形为：圆柱体、正方体、长方体、或不规则体。

4. 如权利要求1的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：设计的三维陈列微孔结构具有三个加工平面，分别对应细菌纤维素支架三维结构的数字模型的XY平面、XY平面、YZ平面。

5.如权利要求1的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：三维陈列微孔结构：每5mm×5mm的加工平面上呈n×n阵列式的微孔，微孔直径为100～300µm，微孔间距不小于200µm，且接种面上的微孔与XY平面呈45～80°的夹角。

6.如权利要求1的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：三维陈列微孔垂直于径向的截面为：圆形或多边形。

7.如权利要求6的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，其特征是：所述的多边形是三角形或正方形。

说明书

一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物支架材料的制备加工技术领域。特别涉及一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法。

背景技术

[0002] 组织工程支架材料是组织工程三大要素之一，由于人体组织均具有特定的宏观形貌，需要用于组织工程修复的支架材料也具备相应的宏观形貌。并且由于大量研究表明用于组织工程修复的支架材料微观（纳米级、微米级）结构可以影响细胞的生长及蛋白表达。因此，组织工程支架材料制备过程中，在控制宏观形貌的同时，还需控制微观结构。理想的组织工程支架材料应具有良好的组织相容性、生物可降解性、降解无毒性、良好的机械强度以及高孔隙率的三维立体结构。其中组织工程支架材料的高孔隙率、高比表面积和适宜的孔径往往取决于支架材料的制备方法。目前组织工程支架材料的制备方法主要有：静电纺丝法、相分离法、气体发泡发、溶液浇注法、沥滤法等。这些方法虽然可以获得成功的组织工程支架，但是所得到的组织工程支架缺乏力学强度、孔隙的相互贯通程度低、孔隙率与孔分布的可控性差，孔径变化随机，从而影响细胞的长入、组织的血管化、养分的传输和代谢产物的排放。

[0003] 激光打孔是最早达到实用化的激光加工技术，已广泛应用于金属材料、无机材料和高分子材料的加工。激光打孔技术具有：非接触性；打孔速度快、效率高；孔径微小、可调；适合数量多、高密度的陈列孔加工等特点。激光微孔孔径可达到数十至数百微米，采用该技术制备的组织工程三维微孔支架可有利于细胞进入支架内部，方便蛋白质等营养成分通过，并且便于微血管的重建。

[0004] 本发明采用二氧化碳激光打孔技术，制备一种细菌纤维素三维陈列微孔支架。在具有宏观形貌的细菌纤维素支架上制备出了特定三维阵列排列的细菌纤维素微孔支架。该支架材料增加了细胞培养时的细胞粘附率，并提高了细胞的增殖速率。本发明制备快捷，操作方便，可通过控制工艺参数等方法精确调控支架的微孔尺寸、形状和三维陈列孔的结构。制备的细菌纤维素三维陈列微孔支架具有良好的力学强度、良好的结构稳定性、高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高，可作为组织工程支架材料，应用于皮肤、骨、软骨、血管等组织修复和重建。

发明内容

[0005] 本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法。涉及一种支架材料的制备加工技术领域。本发明工艺简单，操作方便，可通过控制工艺参数等方法调控支架的微孔尺寸和三维陈列孔的结构，制备的三维陈列微孔支架可应用于构建皮肤、骨、软骨、血管等组织工程领域。

[0006] 本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法。包括，[0007] （1）由菌株发酵产生的细菌纤维素经纯化处理、切割、冷冻干燥得到细菌纤维素支架。

[0008] （2）采用计算机断层扫描技术构建细菌纤维素支架三维结构的数字模型。以数字模型重心为原点，细菌纤维素支架接种细胞时的接种面向下投影为XY平面建立三维坐标系。利用数字模型设计特定的三维陈列微孔结构。

[0009] （3）将所需的细菌纤维素三维陈列微孔结构数字模型导入二氧化碳激光打孔机中，在-5～10℃环境下进行加工，加工后的细菌纤维素支架经二次蒸馏水清洗，冷冻干燥得到细菌纤维素三维陈列微孔支架。

[0010] 作为优选的技术方案：

[0011] 其中，如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的能发酵产生细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。所述的纯化处理方法可以是，发酵产物在重量百分比为1～8%的NaOH水溶液中，在30～100℃的温度下加热3～6h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。

[0012] 如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的冷冻干燥温度为：-40～-10℃条件下。细菌纤维素是由三维纳米网络结构的纤维素纳米纤维构成，只有采用冷冻干燥法才能在干燥过程中保持其原有的三维网络结构。同理，加工后的细菌纤维素支架也需要采用冷冻干燥法以保持加工后得到的三维阵列微孔结构。

[0013] 如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的经纯化处理、切割、冷冻干燥得到细菌纤维素支架其外形为：圆柱体、正方体、长方体、膜状或不规则体。具有一定外形的细菌纤维素支架可以是在培养过程中形成的，也可以是经过机械切割加工形成。

[0014] 如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的设计的三维陈列微孔结构具有三个加工平面，分别对应细菌纤维素支架三维结构的数字模型的XY平面、XY平面、YZ平面。可通过改变激光打孔机上细菌纤维素材料在夹具的位置来实现不同加工平面的阵列打孔加工。

[0015] 如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的三维陈列微孔结构：每5mm×5mm的加工平面上呈n×n阵列式的微孔，微孔直径为100～300µm，微孔间距不小于200µm，且接种面上的微孔与XY平面呈45～80°的夹角。在组织工程的细胞与支架材料复合过程中，细胞接种是通过细胞悬液滴加在支架材料上并通过材料的三维微孔进入支架材料内部。在这一过程中，细胞进入支架材料的数量以及细胞与支架材料接触的时间均影响细胞在支架材料上的粘附率。为了增加细胞进入支架材料的数量，在支架材料微孔结构设计时需提高孔隙间的相互贯通程度，可以通过调节三维陈列孔的数量和位置，使三个加工平面的孔道两两相交或者三个加工平面的孔道同时相交。同时，为了延长细胞与支架材料接触的时间，本专利的三维陈列微孔结构使接种面上的微孔与XY平面呈一定的夹角。这种具有一定倾斜角度的陈列微孔设计可防止细胞悬液通过孔道直接漏出支架材料，也不影响细胞悬液进入支架材料内部。

[0016] 如上所述的一种细菌纤维素三维陈列微孔支架的制备方法，所述的三维陈列微孔垂直于径向的截面为：圆形、正方形、三角形或多边形。

[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用二氧化碳激光打孔技术，制备一种细菌纤维素三维陈列微孔支架。制备过程可控制细菌纤维素支架材料的宏观形貌和微观结构，且该细菌纤维素微孔支架的三维阵列排列，有利于细胞进入支架材料内部，并提高了细胞粘附率。可通过控制工艺参数等方法精确调控支架的微孔尺寸、形状和三维陈列孔的结构。制备的细菌纤维素三维陈列微孔支架具有良好的力学强度、良好的结构稳定性、高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高，可作为组织工程支架材料，应用于皮肤、骨、软骨、血管等组织修复和重建。

具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0019] 实施例1：

[0020] 1、将由木醋杆菌发酵培养得到的细菌纤维素浸泡在重量百分比为8%的NaOH水溶液中，在30℃的温度下加热6h，再用二次蒸馏水反复冲洗至中性。除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。机械切割将其加工成2cm×2cm×2cm的正方体。在-40℃条件下，冷冻干燥得到细菌纤维素支架。

[0021] 2、采用计算机断层扫描技术获得细菌纤维素支架的断层图像，对各断层图像进行处理，经计算机模拟构建细菌纤维素支架三维结构的数字模型。以数字模型重心为原点，细菌纤维素支架接种细胞时的接种面向下投影为XY平面建立三维坐标系。利用数字模型设计三维陈列微孔结构。设计的三维陈列微孔结构具有三个加工平面，分别对应细菌纤维素支架三维结构数字模型的XY平面、XY平面、YZ平面。每5mm×5mm的加工平面上呈15×15阵列式的微孔，微孔直径为100µm，微孔间距不小于200µm，且接种面上的微孔与XY平面呈45°的夹角。三维陈列微孔垂直于径向的截面为圆形。

[0022] 3、将所需的细菌纤维素三维陈列微孔结构数字模型导入二氧化碳激光打孔机中，在-5℃环境下进行加工，加工后的细菌纤维素支架经二次蒸馏水清洗，冷冻干燥得到细菌纤维素三维陈列微孔支架。

[0023] 实施例2：

[0024] 将由八叠球菌属发酵培养得到的细菌纤维素浸泡在重量百分比为4%的NaOH水溶液中，在60℃的温度下加热5h，再用二次蒸馏水反复冲洗至中性。除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。机械切割将其加工成直径为1cm，高2cm的圆柱体。在-30℃条件下，冷冻干燥得到细菌纤维素支架。

[0025] 采用计算机断层扫描技术获得细菌纤维素支架的断层图像，对各断层图像进行处理，经计算机模拟构建细菌纤维素支架三维结构的数字模型。以数字模型重心为原点，细菌纤维素支架接种细胞时的接种面向下投影为XY平面建立三维坐标系。利用数字模型设计三维陈列微孔结构。设计的三维陈列微孔结构具有三个加工平面，分别对应细菌纤维素支架三维结构数字模型的XY平面、XY平面、YZ平面。每5mm×5mm的加工平面上呈9×9阵列式的微孔，微孔直径为300µm，微孔间距不小于200µm，且接种面上的微孔与XY平面呈60°的夹角。三维陈列微孔垂直于径向的截面为正方形。