一种黑曲霉菌株及其应用转让专利
申请号 : CN201310259902.2
文献号 : CN103305428B
文献日 : 2015-02-18
发明人 : 徐维烈 , 葛向阳 , 杨涛 , 赵述淼 , 杨亭 , 陈仕伟 , 傅家炜
申请人 : 武汉合缘绿色生物工程有限公司
摘要 :
本发明公开了一种黑曲霉菌株及其应用，通过从稻草秸秆上分离、纯化，采用离子束和60钴诱变，通过初筛、复筛、遗传稳定试验筛选本发明涉及一株专用于秸秆腐熟剂的高产木聚糖酶的黑曲霉菌株，黑曲霉HY-001CCTCCNO:M2013162，该菌株在28℃固体发酵培养72小时，黑曲霉HY-001的木聚糖酶活可达25000U/g；在28℃固体培养100小时，黑曲霉HY-001孢子数达到15×108CFU/g；黑曲霉HY-001具有很好的木聚糖酶活性，生长速度快，产孢子能力强，具有很好的生产性能。因此该黑曲霉在降低秸秆腐熟剂产品成本，提高产品稳定性，强化腐熟效果上有很好的应用前景。
权利要求 :
1.一种黑曲霉菌株，其特征在于：所述的黑曲霉菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)HY-001，保藏号为CCTCC NO:M 2013162。
2.权利要求1所述的黑曲霉菌株在制备秸秆腐熟剂中的应用。
说明书 :
一种黑曲霉菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种黑曲霉菌株，还涉及一种黑曲霉菌株在制备秸秆腐熟剂中的应用，本发明所述的黑曲霉具备高产木聚糖酶的能力，可用于制备秸秆的腐熟剂。
背景技术
[0002] 半纤维素是植物组织中与纤维素相伴生的一种低分子量（其平均聚合度50～200）的无定型结构物质，是由两种或两种以上的单糖组成的不均一聚糖，大多数带有侧链；
绝大部分位于纤维素细胞的胞间层和细胞壁上，也可认为是纤维素细胞间的填料和黏结物质。不同于纤维素只有葡萄糖一种残基，半纤维素可以由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等残基缩聚而成。在由这些残基组成的聚糖中，木聚糖是最常见的半纤维素，通过木糖残基以β-1，4-糖苷键连接而来，细胞壁中木聚糖的含量因细胞类型的不同而不同，最高可占细胞干重35%，是自然界中除纤维素以外数量最大的多糖，广泛存在于阔叶材以及农作物秸秆等禾本科植物中，其在饲料行业、肥料行业、造纸业、酿造业等诸多领域都有应用。
鉴于该类物质资源丰富，成本低廉，所得到的产品附加值高，有必要选育出木聚糖酶高产菌株以加强对木聚糖资源的开发利用，对解决当前的环境问题、能源问题、粮食问题有重要意义。
绝大部分位于纤维素细胞的胞间层和细胞壁上，也可认为是纤维素细胞间的填料和黏结物质。不同于纤维素只有葡萄糖一种残基，半纤维素可以由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等残基缩聚而成。在由这些残基组成的聚糖中，木聚糖是最常见的半纤维素，通过木糖残基以β-1，4-糖苷键连接而来，细胞壁中木聚糖的含量因细胞类型的不同而不同，最高可占细胞干重35%，是自然界中除纤维素以外数量最大的多糖，广泛存在于阔叶材以及农作物秸秆等禾本科植物中，其在饲料行业、肥料行业、造纸业、酿造业等诸多领域都有应用。
鉴于该类物质资源丰富，成本低廉，所得到的产品附加值高，有必要选育出木聚糖酶高产菌株以加强对木聚糖资源的开发利用，对解决当前的环境问题、能源问题、粮食问题有重要意义。
[0003] 为获得木聚糖酶高产菌株主要从三个方向开展工作。第一是通过特殊培养基或从特殊环境中筛选木聚糖酶酶活高产菌株；第二是通过物理化学诱变等对菌株进行诱变选育，目前常用的诱变剂或诱变方式有亚硝基胍、氯化锂、硫酸二乙酯、紫外线诱变诱变、微波诱变、离子束诱变、60钴诱变等；第三则是通过基因工程技术来获得木聚糖酶高产工程菌。其中，离子束诱变、60钴诱变以其安全无害、效果突出而被广泛采用。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供了一种黑曲霉菌株，该菌株具备高产木聚糖酶的特点，可用于分解木聚糖，该菌株已于2013年4月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黑曲霉（Aspergillus niger）HY-001，保藏编号：CCTCC NO:M2013162，地址：中国武汉武汉大学。
[0005] 本发明还有一个目的是提供了一种黑曲霉菌株在制备秸秆腐熟剂中的应用，在缩短秸秆腐熟时间，提高腐熟效果上有显著作用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] 一种黑曲霉HY-001，其筛选过程如下：
[0008] 1）利用初筛培养基分离废弃秸秆中的黑曲霉，经形态学鉴定，确认为黑曲霉。
[0009] 2）对该黑曲霉依次进行2×1016cm-2剂量离子束诱变和395Gy剂量60钴诱变，经初筛培养基初筛、产酶培养基复筛、遗传稳定实验后，得到了一种高产木聚糖酶的黑曲霉菌株，该菌株已于2013年4月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黑曲霉HY-001Aspergillus niger HY-001，保藏编号：CCTCC NO:M2013162，地址：中国武汉武汉大学。
[0010] 黑曲霉HY-001形态特征：1）在察氏培养基上生长快，经24小时，即有菌落出现，72小时后，孢子丰富；菌落黑色，呈丝绒状，中心略凸起，菌落反面略带黄色。2）显微镜下菌丛呈黑褐色，菌丝发达，分生孢子头状如“菊花”，具有两层孢子小梗，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色。
[0011] 该菌株能很好利用纤维素、淀粉或糖类为碳源，利用豆粕、硫酸铵等为氮源快速生长，最适生长温度为28～32℃，最适pH为5.0～6.5，在高产木聚糖酶的同时，能产生较高的果胶酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等，具有一定的产酸能力。
[0012] 黑曲霉HY-001具有很高的产木聚糖酶的能力，在产酶培养基中28℃培养72小时，其木聚糖酶活可达25000U/g。
[0013] 黑曲霉HY-001具有很好的生长特性，在28℃产酶培养基中培养120小时，孢子数8
大于15×10CFU/g。
大于15×10CFU/g。
[0014] 黑曲霉HY-001在产酶培养基中所产木聚糖酶，最适作用温度为50℃,最适作用2+ 2+
pH为5.4，在4℃-40℃时酶热稳定性较好，pH5.4-pH10之间酶稳定性较好，Mg 、Ca 、吐温
2+ 2+ 2+
80、Cu 对该酶有促进作用，Co 、Mn 有较大抑制作用。
pH为5.4，在4℃-40℃时酶热稳定性较好，pH5.4-pH10之间酶稳定性较好，Mg 、Ca 、吐温
2+ 2+ 2+
80、Cu 对该酶有促进作用，Co 、Mn 有较大抑制作用。
[0015] 所述的初筛培养基为：葡萄糖0.3g,NH4NO30.15g,木聚糖0.2g,NaCl0.6g,K2HPO40.2g,MgSO40.01g,FeSO40.01g,CaCl20.01g,琼脂2g，水100mL；
[0016] 所述的产酶培养基为：稻草粉5.0g，麸皮4.0g，豆粕1.0g，水27mL。
[0017] 一种黑曲霉菌株在制备木聚糖分解剂中的应用，其应用步骤为
[0018] 将黑曲霉HY-001的孢子配成孢子悬液，以接种量为0.5×105-2×105个/g接种至稻草粉中（稻草粉过40目筛，含水率70%，加入相当于秸秆粉质量4%的尿素），经过28℃下20天培养，秸秆粉残留仅69%。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0020] 1)本发明的黑曲霉HY-001，生长速度快，产孢子能力强，具有很好的生产性能；
[0021] 2）本发明黑曲霉HY-001在秸秆自然环境中竞争力强，可以抗杂菌生长，在稳定产品品质，提高产品安全性上有积极作用。
[0022] 3）本发明黑曲霉HY-001具有很好的木聚糖酶活性，能高效促使秸秆原料分解，20天内使得秸秆粉失重31%，能增加腐植酸，以助于植物吸收利用。因此该黑曲霉在降低秸秆腐熟剂产品成本，提高产品稳定性，强化腐熟效果上有很好的应用前景。
附图说明
[0023] 图1为一种黑曲霉HY-001在察氏培养基上的菌落形态示意图。
[0024] 图2为一种黑曲霉HY-001在40×显微镜下的形态示意图。
[0025] 图3为一种黑曲霉HY-001固态培养产木聚糖酶和产孢子曲线示意图。
[0026] 图4为一种黑曲霉HY-001在稻草秸秆中腐熟效果对比示意图。
[0027] A：秸秆腐熟前的效果；
[0028] B：未接黑曲霉HY-001的腐熟35天的效果；
[0029] C：接黑曲霉HY-001的腐熟35天的效果。
具体实施方式
[0030] 实施例1：
[0031] 一种黑曲霉HY-001，其筛选过程如下：
[0032] 1）从华中农业大学水稻试验田里取废弃秸秆作为样品，经初筛培养基初筛和产酶培养基复筛，从中各挑选一株酶活最高、生长性能优良的菌株，保存至PDA斜面上。
[0033] 2）经PDA斜面30℃培养5天，挑取孢子，用无菌水制成107个/mL孢子悬液。
[0034] 3）用该黑曲霉的新鲜孢子悬液在能量为20keV、离子剂量分别为1×1016/cm2、16 2 16 2 16 2
1.7×10 /cm、3×10 /cm、4×10 /cm 下进行诱变，利用初筛培养基初筛，产酶培养基复
60
筛，对复筛所得菌株的新鲜孢子悬液在185Gy、395Gy、605Gy、815Gy的剂量下进行 钴诱变，利用初筛培养基初筛，产酶培养基复筛，经过遗传稳定实验，得到一种高木聚糖酶活的黑曲霉，命名为黑曲霉HY-001，该菌株已于2013年4月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黑曲霉（Aspergillus niger）HY-001，保藏编号：CCTCC NO:M2013162，地址：中国武汉武汉大学。
1.7×10 /cm、3×10 /cm、4×10 /cm 下进行诱变，利用初筛培养基初筛，产酶培养基复
60
筛，对复筛所得菌株的新鲜孢子悬液在185Gy、395Gy、605Gy、815Gy的剂量下进行 钴诱变，利用初筛培养基初筛，产酶培养基复筛，经过遗传稳定实验，得到一种高木聚糖酶活的黑曲霉，命名为黑曲霉HY-001，该菌株已于2013年4月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黑曲霉（Aspergillus niger）HY-001，保藏编号：CCTCC NO:M2013162，地址：中国武汉武汉大学。
[0035] 该菌菌落形态及显微镜下菌丝形态见图1和图2。
[0036] 所述的初筛培养基配方为：葡萄糖0.3g,NH4NO30.15g,木聚糖0.2g,NaCl0.6g,K2HPO40.2g,MgSO40.01g,FeSO40.01g,CaCl20.01g,琼脂2g，水100mL。
[0037] 所述的产酶复筛培养基配方为：稻草粉5.0g，麸皮4.0g，豆粕1.0g，水27mL。
[0038] 实施例2：
[0039] 黑曲霉HY-001的培养方法，其步骤如下：
[0040] 将黑曲霉HY-001孢子粉按1%（重量比）接种于产酶培养基（稻草粉5.0g，麸皮4.0g，豆粕1.0g，水27mL），28℃下培养，24小时候后，菌丝生长，物料结块，打散翻料一次；
继续培养，等孢子生长变黑，扣瓶倒置继续培养，120小时后培养结束。测定酶活力及孢子
8
数，木聚糖酶活力达到25000U/g，孢子数大于15×10CFU/g。（木聚糖酶活力及孢子数曲线见图3）
继续培养，等孢子生长变黑，扣瓶倒置继续培养，120小时后培养结束。测定酶活力及孢子
8
数，木聚糖酶活力达到25000U/g，孢子数大于15×10CFU/g。（木聚糖酶活力及孢子数曲线见图3）
[0041] 实施例3：
[0042] 一种黑曲霉菌株在制备秸秆腐熟剂中的应用，其应用步骤如下：
[0043] 将本发明黑曲霉HY-001的孢子配成孢子悬液，以接种量为0.5×105-2×105个/g接种至稻草粉中（稻草粉过40目筛，含水率70%，加入相当于稻草粉质量4%的尿素），经过28℃下20天培养，秸秆粉残留率为69%。（对稻草的腐熟结果见图4）
[0044] 实施例4：
[0045] 木聚糖酶的活力测定，其步骤如下：
[0046] 将本发明黑曲霉HY-001孢子粉按1%（重量比）接种于产酶培养基中28℃培养72小时。
[0047] 称取上述培养物10g，加pH5.4缓冲液100mL，于40℃水浴中浸提60min，滤纸过滤得抽提液。
[0048] 在作用温度为50℃,作用pH为5.4条件下测定，其木聚糖酶活可达25000U/g。
[0049] 该酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为5.4，在4℃-40℃时酶热稳定性较好，2+ 2+ 2+ 2+ 2+
pH5.4-pH10之间酶稳定性较好，Mg 、Ca 、吐温80、Cu 对该酶有促进作用，Co 、Mn 有较大抑制作用。
pH5.4-pH10之间酶稳定性较好，Mg 、Ca 、吐温80、Cu 对该酶有促进作用，Co 、Mn 有较大抑制作用。