本发明涉及一种利用滇池金线鲃嗅囊组织建立细胞系和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以滇池金线鲃嗅囊组织为材料，采用组织块法，在含有胎牛血清，pH值为7.0-7.2 的L-15培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行继代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、原代培养耗时短，细胞量大，能用于染色体分析；2、构建的滇池金线鲃嗅囊细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对滇池金线鲃种质资源保存和理论研究及应用的需要；3、该构建方法也适用于其它鱼类构建嗅囊的细胞系。
1.一种滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的步骤如下：(1)制备HBSS消毒液和细胞培养液
HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为100μg/ml，庆大霉素浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml；
基础培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10％；
原代培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的20％，硫酸卡那霉素浓度为100μg/ml，庆大霉素浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为
传代培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的
20％，硫酸卡那霉素浓度为50μg/ml，庆大霉素浓度为10μg/ml，两性霉素B浓度为10μg/ml；
调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；
先用8mg/L高锰酸钾浸泡滇池金线鲃10min，对鱼进行整体消毒后，再次以75％酒精消毒鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其嗅囊，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡嗅囊组织，浸泡15min后，将嗅囊组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成组织小块，并将其接2
种于25cm 细胞培养瓶中，在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3ml，在20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第4天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层；
原代嗅囊细胞铺满瓶底80％后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.13％的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液1ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；
(a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按9:1的体积比混合，现用现配；
(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8min，6
弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为1×10 个/ml，将
1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；
(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，1000rpm离心
8min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，7天细胞即长成单层。
一种滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建和超低温冷冻保存方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及一种利用滇池金线鲃嗅囊组织建立细胞系和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。背景技术：
[0002] 鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今形成了一套包括培养基、抗生素、原代培养和传代培养方法等相对完善的细胞培养体系，截止目前，已建立了280余株细胞系。我国鱼类细胞培养历经30余年，也只建立了50余株鱼类细胞系，涉及的种类有约30种，主要以海洋种类为主。从以上事例可以看出，一套成熟的细胞培养技术流程并不是一株细胞系建立成功的必备条件，成熟的技术流程并不能使细胞培养获得成功，细胞培养仍然需要从提供原代细胞物种本身的生物学特性入手，对细胞培养体系的培养条件进行调整，经过艰苦的野外调查和大量的室内实验，找到最优的培养条件，才能使细胞培养获得成功。云南土著淡水鱼类近600种，占中国淡水鱼类的50%，因此，云南土著鱼类种质资源保存显得尤为重要，但细胞培养研究鲜见报道。
[0003] 滇 池 金 线 鲃Sinocyclocheilus grahami（Regan，1904）隶 属 于 鲤 形 目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）金线鲃属（Sinocyclocheilus），是滇池流域的特有种，国家II级保护动物。目前滇池金线鲃在滇池湖体已经消失，现仅存于入湖溪流及龙潭中。尽管滇池金线鲃人工繁殖技术已研发成功，并有计划的放流回滇池，但由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养以用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量，保证放流个体的成活率和繁殖率。而对于滇池金线鲃这种个体相对较小，血液量较少的鱼类而言，传统的血液短期培养不能满足核型分析的需要；另一方面，由于滇池金线鲃的最适生存温度在22℃左右，决定了细胞的培养温度不高，而温度是影响细胞生长速度的关键因素，故滇池金线鲃鳍条细胞系的原代培养持续将近两个月，因此有必要寻找能快速获得细胞的方法，以满足滇池金线鲃细胞的短期培养用于核型分析。
[0004] 经文献检索，未见与本发明的相同报道。发明内容：
[0005] 本发明的目的是提供一种操作简便易行的滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建方法，以满足对滇池金线鲃快速核型分析、种质资源保存和理论研究的需要。
[0006] 本发明的滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建方法，步骤如下：
[0007] 1 制备HBSS消毒液和细胞培养液
[0008] HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为100µg/ml，庆大霉素浓度为20 µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；
[0009] 基础培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；
[0010] 原代培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的20%，硫酸卡那霉素浓度为100µg/ml，庆大霉素浓度为20 µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；
[0011] 传代培养液：向L-15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的20%，硫酸卡那霉素浓度为50µg/ml，庆大霉素浓度为10 µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml；
[0012] 调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存备用。
[0013] 2 原代培养
[0014] 先用8 mg/L高锰酸钾浸泡滇池金线鲃10 min，对鱼进行整体消毒后，再次以75%酒精消毒鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其嗅囊，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡嗅囊组织；浸泡15 min后，将嗅囊组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成组织小块，并2
将其接种于25 cm 细胞培养瓶中，在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3 ml，在20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第4天细胞开始从组织块中迁移，
20天长成细胞单层。
[0015] 3 传代培养
[0016] 原代嗅囊细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.13%的胰蛋白酶-EDTA溶液1 ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至30代。
[0017] 4 细胞冻存与复苏
[0018] （a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按9:1的体积比混合，现用现配。
[0019] （b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心6
8 min，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存。
[0020] （c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1000 rpm离心8 min，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，7天细胞即长成单层。
[0021] 本发明的显著效果在于：
[0022] 1、操作简便易行。
[0023] 2、相对于用于核型分析的血液短期培养，嗅囊组织块中刚迁移出来的细胞具有活性，且细胞量大，能用于染色体分析。
[0024] 3、与鳍条细胞系相比，嗅囊细胞系原代培养耗时短，且不需要生长因子。
[0025] 4、构建的滇池金线鲃嗅囊细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对滇池金线鲃种质资源保存和理论研究及应用的需要；
[0026] 5、该构建方法也适用于其它鱼类构建嗅囊的细胞系。
