直接分离CD4+和CD8+淋巴细胞的方法转让专利
申请号 : CN201310219459.6
文献号 : CN103305464B
文献日 : 2015-04-15
发明人 : 许恒毅 , 熊勇华 , 魏华 , 赖卫华
申请人 : 南昌大学
摘要 :
权利要求 :
+ +
1.直接分离CD4 和CD8 淋巴细胞的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M,pH 6.5磷酸缓冲液PBS,加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS,0.4 mg 乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐EDC,室温置+于混匀仪上搅拌,活化15 min;取2.2 mg 鼠抗人CD4 单克隆抗体加入上述反应液中,室温置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中+透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-CD4 抗体复合物;(2)每取1.0 mg臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M,pH 6.5磷酸缓冲液PBS,加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS,0.4 mg 乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐EDC,室温置于混匀仪上搅+拌,活化15 min;取2.2 mg鼠抗人CD8 单克隆抗体加入上述反应液中,室温置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析+结束将得到的溶液冷冻干燥多臂井星聚合物-CD8 抗体复合物;(3)每取15 mg 长链生物素,3.6 mg NHSS,2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中;将0.1 mg多臂井+ +星聚合物-CD4 或CD8 抗体复合物加入到上述溶液中,室温置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物;(4)富集捕获:取待测样品溶+液1mL,加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD4 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 +rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD4 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,常规磁力架充分分离;所述修饰有链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm;磁+分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD4 细胞;将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤,离心300 rpm/min,20℃ 10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重悬细胞;加入+0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD8 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速+室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD8 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,常+规磁力架充分分离;磁分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD8 细胞;(5)去离子+ +水轻轻清洗后,用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD4 或CD8 细胞的复合物即纳米磁珠-链+ +霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD4 或CD8 细胞抗原。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺,其分子量为 70000 Da。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为30 nm。
说明书 :
+ +
直接分离CD4 和CD8 淋巴细胞的方法
技术领域
背景技术
黏附分子,通过与其他免疫细胞直接或间接的接触,发挥免疫调节作用。在正常机体内各淋
巴细胞亚群相互作用,维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生
+ +
异常时,可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。外周血CD4 和CD8 淋巴细胞作
为淋巴细胞亚群中最重要的细胞,其与肿瘤的发生发展以及机体的免疫功能之间有着密切
+ +
的关系。因此,对CD4 和CD8 T淋巴细胞的发育、分化及活化的机制研究显得越来越重要。
+ +
然而,正常人外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞的含量很低,现有方法还无法对外周血中痕
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量CD4 和CD8 T淋巴细胞直接分离和采集。因此,建立一种高效分离和纯化人外周血CD4
+ + +
和CD8 T淋巴细胞的方法,并对其进行表型及生物学功能鉴定,为进一步研究CD4 和CD8
+ +
T淋巴细胞在免疫应答中的作用提供较高纯度CD4 和CD8 T淋巴细胞。
免疫磁分离法(IMS)将抗体连接到磁珠上,然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细
胞进行捕获、富集,磁分离(具体原理见图2A)。然而,目前该基于微米级免疫磁珠的分离技
术存在诸多局限性:1)微米磁珠的比表面积相对较小,降低了磁珠捕获效率;2)由于微米
磁珠自身的颗粒性质,其与细胞之间通过多相反应(multiphase reaction)结合,通常需要
更长的时间去特异性捕获食品基质中的细胞;3)微米磁珠单分散性较差,在外周血基质中
容易发生自身聚集或形成沉淀;4)传统的免疫磁分离技术,往往是将抗体直接偶联于免疫
磁珠上,此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大
+
了抗体间的空间位阻效应,从而降低了抗体的捕获效率5)血液粘稠度高并且其中非CD4 和
+ +
CD8 淋巴细胞的血细胞浓度大,微米磁珠容易产生非特异性吸附,难以实现对血液中CD4
+ + +
和CD8 淋巴细胞的特异性分离;6)微米磁珠的浓度过高会造成CD4 和CD8 淋巴细胞的破
损(磁场导致细胞表面磁珠互相吸引,使细胞受到挤压甚至破裂),导致分离的失败;7)磁珠
偶联抗体时,一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体
与磁珠表面距离太近,磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间
构象发生改变,导致抗体生物活性下降。
发明内容
梯度磁场下(小于30 T/m)复杂的外周血基质中CD4 和CD8 淋巴细胞特异性快速分离的方
法。
+
酸盐EDC,室温置于混匀仪上搅拌,活化15 min;取2.2 mg 鼠抗人CD4 单克隆抗体加入上
述反应液中,室温置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在
+
PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-CD4 抗体
复合物;(2)每取1.0 mg氨基化的多臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M,pH 6.5磷酸缓冲
液PBS,加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS,0.4 mg 乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐
+
酸盐EDC,室温置于混匀仪上搅拌,活化15 min;取2.2 mg鼠抗人CD8 单克隆抗体加入上
述反应液中,室温置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在
+
PBS和去离子水中透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥多臂井星聚合物-CD8 抗体复
合物;(3)每取15 mg 长链生物素,3.6 mg NHSS,2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5
+ +
PBS缓冲液中;将0.1 mg多臂井星聚合物-CD4 或CD8 抗体复合物加入到上述溶液中,室温
置于混匀仪上搅拌30 min;将上述溶液减压旋干溶剂,去离子水溶解,在PBS和去离子水中
透析1 d;透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物;
+
(4)富集捕获:取待测样品溶液1mL,加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD4 抗体
复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合
+
物-抗体-CD4 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪
上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,常规磁力架充分分离;磁分离后,用等体积的PBS
+
溶液重悬细胞,即为CD4 细胞;将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤,离心300rpm/
min,20℃ 10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重悬细胞;加入0.1 mg 长链生物素-多
+
臂井星聚合物-CD8 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长
+
链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD8 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素
的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,常规磁力架充分分离。磁
+
分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD8 细胞;(5)去离子水轻轻清洗后,用PBS缓
+ +
冲液混重悬即得富集有CD4 或CD8 细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多
+ +
臂井星聚合物-抗体-CD4 或CD8 细胞抗原。
法相比,分离到目的细胞能力更强,特别适用于复杂样品的分离,如外周血样品等。针对单
纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的细胞速度慢、磁场要求
高的缺陷,采用多臂井星聚合物实现纳米磁珠磁信号的放大,从而提高了复杂基质样品中
目的细胞分离效率,实现了在低梯度磁场下(小于30 T/m)复杂的食品基质中目的细胞特异
性快速分离。
链生物素分子,可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠,从而使多臂井星聚合物上结合大量
的纳米磁珠,实现了磁细胞信号的级联放大,有利于缩短磁细胞的分离时间。
覆盖的细胞可以保持正常的形状,纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性,因
此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。
识别,从而使多臂井星聚合物上结合大量的纳米磁珠,大大增加了靶细胞表面结合的磁珠
数量,实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细胞。与传统的细胞磁分离方法相比,因加入的
是在基质中更为稳定的纳米磁珠,该方法更适用于在复杂基质中对细胞进行磁分离,提高
了复杂基质样品中目的细胞分离效率。
易引起抗体空间构象发生改变,导致抗体生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引
入多臂井星聚合物,其具有一定的空间大小,从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面,避免了
磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时,引入的多臂井星聚合物却不会影响抗
体空间构象,从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。
附图说明
具体实施方式
以1/1000(V/V)的体积比加入Tween 20,即获得0.1%PBST。
碳二亚胺盐酸盐EDC,室温置于混匀仪上搅拌,活化15 min;
酸盐EDC,室温置于混匀仪上搅拌,活化15 min;
物-CD4 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多
+
臂井星聚合物-抗体-CD4 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置
于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,将离心管插入常规磁力架充分分离。磁
+
分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD4 细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS
溶液洗涤,离心(300rpm/min,20℃)10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重悬细胞。加
+
入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD8 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转
+
速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD8 细胞抗原复合物;加入
0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,
+
将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD8 细
胞。
合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD4 或CD8 细胞抗原。
共修饰的多臂井星聚合物组)、CD4 或CD8 细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组、CD4 或CD8
细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组富集靶细胞。
次。各组捕获效率的计算公式如下:(被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数)×100%。
15 min。然后加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速
再室温孵育15 min。最后,将离心管插入常规磁力架分离充分分离。磁分离后,用等体积
+
的PBS溶液重悬细胞,即为CD4 细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤,离心
(300rpm/min,20℃)10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg 长链
+
生物素-多臂井星聚合物-CD8 抗体复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15
+
min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD8 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有
链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,将离心管插入
+
常规磁力架充分分离。磁分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD8 细胞。
+
3 min。磁分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD4 细胞。将分离后的上清液用等
体积的PBS溶液洗涤,离心(300rpm/min,20℃)10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重
+
悬细胞。加入0.1 mg CD8 细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的
转速室温孵育15 min,将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后,用等体积的PBS溶液
+
重悬细胞,即为CD8 细胞。
pH 4.0)洗三次,无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg,EDC 0.35 mg,置于混匀仪上保持磁珠
悬浮,37℃活化2 h。(2)磁力架回收磁珠,PBS(0.02 M,pH 4.0)洗涤三次后,磁珠重悬于
+ +
无菌PBS中,按每mg磁珠加入80 μg CD4 或CD8 细胞特异性抗体,置于混匀仪上37℃偶
联2 h。(3)加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠,PBS 洗涤三次,10 ml PBS(含0.05%
NaN3, 0.5% BSA,pH 7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
+
3 min。磁分离后,用等体积的PBS溶液重悬细胞,即为CD4 细胞。将分离后的上清液用等
体积的PBS溶液洗涤,离心(300rpm/min,20℃)10 min,弃去上清,用等体积的PBS溶液重
+
悬细胞。加入0.1 mg CD8 细胞特异性抗体修饰的微米磁珠,置于混匀仪上,以30 rpm的
转速室温孵育15 min,将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后,用等体积的PBS溶液
+
重悬细胞,即为CD8 细胞。
M,pH 4.0)洗三次,无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg,EDC 0.35 mg,置于混匀仪上保持磁
珠悬浮,37℃活化2 h。(2)磁力架回收磁珠,PBS(0.02 M,pH 4.0)洗涤三次后,磁珠重悬
+ +
于无菌PBS中,按每mg磁珠加入80 μg CD4 或CD8 细胞特异性抗体,置于混匀仪上37℃
偶联2 h。(3)加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠,PBS 洗涤三次,10 ml PBS(含
0.05% NaN3, 0.5% BSA,pH 7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
52.1% 20.8% 87.6%
CD8+细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率 CD8+细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率 CD8+细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
49.8% 19.5% 88.3%
+
间内就能分离富集较多的靶细胞。但是,本发明技术方案组的捕获效率又远远大于CD4 或
+
CD8 细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组,这表明本发明技术方案借助多臂井星聚合物可以
增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率,从而使磁性大大提高,进而实现了在短时间内(3min)高
+ +
效分离富集CD4 或CD8 细胞。
51.7% 38.1% 89.8%
CD8+细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率 CD8+细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率 CD8+细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
50.9% 36.9% 88.7%
效率都得到了提高,特别是CD4 或CD8 细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高
最为明显,这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率,但是其还是低于
+ +
短时间分离(3min)时CD4 或CD8 细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组的捕
+ +
获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内(3min)高效分离富集CD4 或CD8 细胞。
7 7
min,20℃)10 min,弃去上清,重悬细胞,每80 µL PBS含细胞数10 个,每10个细胞加0.1mg
+
长链生物素-多臂井星聚合物-鼠抗人CD4 抗体复合物,充分混匀,在4-8℃孵育15 min。
将分离后的细胞悬液用等体积的PBS溶液洗涤,离心(300rpm/min,20℃)10 min,弃去上
+
清,用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD8 抗体
复合物,置于混匀仪上,以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合
+
物-抗体-CD8 细胞抗原复合物;加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠,置于混匀仪
上,以30 rpm的转速再室温孵育15 min,将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后,将
+ +
上清液倒入无菌离心管中,而分离出来捕获有CD4 或CD8 细胞的免疫磁珠则用PBST清洗
两次,混合均匀,并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。捕获率如实施例2方法获得,其余
+ +
同实施例2。结果见表1,表明本方案能高效富集分离样品中的CD4 或CD8 细胞。