一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法和鉴定方法

摘要

本发明提供了一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法，其特征在于：采用sox-2基因从11～12天鼠胚颌突组织中分选所述颅神经嵴源性干细胞。本发明获得的颅神经嵴源性干细胞具有较好的生长活性和增殖潜能，在体外持续传代过程中，干细胞特性、细胞表型稳定表达，细胞增殖效率无明显差异。获得的颅神经嵴源性干细胞具有外胚来源干细胞和中胚来源干细胞双重特性，可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经元样细胞，显示了其作为胚胎早期干细胞的多潜能性。

权利要求

1.一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)原代细胞获取与培养：在无菌条件下，切取妊娠11～12天鼠胚的颌突组织，剪碎后用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA，消化5～10分钟，DMEM/F12培养基终止消化后吹打使组织分散成细胞悬液，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入含10%FBS的DMEM/F12培养基使细胞重悬后通过75μm细胞筛，将过滤后细胞悬液分装入培养瓶中；沿培养皿边缘加入10%FBS的DMEM/F12培养基，置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液;(2)sox-2+细胞的分选：细胞铺满瓶底时，0.25%胰酶/0.1 mM的EDTA消化30秒，

10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入0.01 M的PBS洗涤，800～1000rpm离心3～5分钟；加入1：50的带荧光sox-2+抗体标记和PBS共500μm，在5%CO2 、37℃培养箱乳化1 h；PBS洗涤，在流式细胞细胞仪上进行分选，将获取sox -2+细胞继续培养传代。

说明书

一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法和鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于干细胞生物技术领域，涉及颅神经嵴源性干细胞的培养、纯化与鉴定。

背景技术

[0002] 神经嵴源性干细胞是胚胎发育过程中的一种重要细胞类型，起源于胚胎发育早期的颅神经嵴在胚胎早期神经管闭合之前，颅神经嵴干细胞发生广泛迁移，其定位于上、下颌突内的神经嵴源性干细胞又称为外胚间充质干细胞外胚间充质干细胞属于胚胎发育时期过渡细胞，在牙发育中进一步分化形成牙周膜干细胞、牙髓干细胞，这些干细胞一并也称为神经嵴源性干细胞。

[0003] 神经嵴细胞的迁移可以根据嵴细胞的显著形态学特征进行观察;在明显表达表型之前，神经嵴细胞就广泛地迁移并精确定位于在胚胎各处，可分为颅神经嵴细胞和躯干神经嵴细胞。嵴细胞的多向分化潜能以及胚胎环境对嵴细胞迁移、定位和表型表达影响的研究证实，颅神经嵴细胞参与了颌面部各组织器官的发育。在神经褶形成时或神经管形成之后，颅神经嵴细胞向侧腹方迁移到第一和第二咽囊之间的细胞，形成舌弓;眼前方的颅神经嵴细胞参与颅骨的形成;上、下颌突组织内的颅神经嵴细胞参与了牙齿的发育。

[0004] 近印来，颅神经嵴干细胞因其具有自我复制和多向分化潜能、参与多种组织修复再生等优点，并在颌面部组织器官发育中起着重要作用，而受到研究者的普遍关注。迄今为止，国内外研究者一直通过不同途径了解神经嵴源性干细胞的生物学特性。由于神经嵴组织量小，采用常规显微手术方式分离神经嵴组织获取该类细胞，还存在相当的技术操作难度和进一步纯化问题。目前，神经嵴源干细胞的特异性表面分子仍在探寻中，这也给神经嵴源性细胞的分离、纯化的实际应用带来了一定的困难。专利公开号为CN101717750A及CN101717751A采用间叶系干细胞特异性标志物stro-1和CD146作为牙周膜干细胞及牙髓干细胞的标记物仅能证实其间充质源性，对于神经嵴源性却无法证实。专利公开号为CN1590537采用特异性抗体HNK-1/CD57获得的细胞需要用牛垂体提取物及白细胞抑制因子维持外胚间充质干细胞的增殖及生物学稳定性，细胞获取操作复杂，在体外培养容易分化，且HNK-1/CD57主要集中表达于牙源性外胚间充质细胞，其它颌突组织并无特异性。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法。

[0006] 本发明的目的是通过以下措施实现的:

[0007] 一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法，其特征在于:采用sox-2基因从11～12天鼠胚颌突组织中分选所述颅神经嵴源性干细胞。优选为11.5天的鼠胚颌突组织。该时期颅神经嵴干细胞游走至颌突组织，形成特定的细胞凝聚区。该时间节点的细胞仍保持颅神经嵴源性多能干细胞特性，尚未受局部微环境诱导，参与颌面组织器官发育及成牙分化的基因尚未启动，有利于通过体外培养研究神经嵴细胞基本特。

[0008] 在颅神经嵴发育期，sox-2沿神经外胚层表达，呈带状分布。在胚胎发生中，sox-2基因表现出多样、动态的表达模式，在各种发育事件中起着重要作用。sox-2在颅面部组织中提取的神经嵴源性干细胞均为强表达，而在躯干神经嵴中不表达或呈弱表达。sox-2主要表达于早期鼠胚的多能性干细胞，成熟细胞无表达，sox-2与终末分化细胞的标记基因以相互排斥的方式表达，有利于神经嵴源性干细胞的筛选与纯化。

[0009] 上述采用sox-2基因分选是指采用带荧光sox-2+抗体标记细胞，在流式细胞仪上分选，获取sox-2+细胞。可以去除原代细胞中非神经嵴源性杂细胞，使细胞得到高度纯化。

[0010] 上述原代细胞的培养基为DMEM/F12培养基，添加以下成分:10%胎牛血清(FBS)，5g/L碳酸氢钠，0.15g/LL-谷氨酰胺，100IU/L青霉素。在该条件下维持稳定的细胞表型细胞并保持较快的增殖活性具有显著优势。

[0011] 上述原代细胞获取与培养，包括以下步骤:消化所述鼠胚颌突组织，使组织分散成细胞悬液，细胞筛过滤得到原代细胞并培养，其特征在于:所述细胞筛的孔径为75μm滤网。该滤网作为细胞筛，可去除组织碎片及未能成功消化的细胞团块。

[0012] 上述颅神经嵴源性干细胞的培养方法，还包括以下步骤:将上述细胞悬液离心后，弃上清，加入上述培养基，使细胞重悬后通入细胞筛，其特征在于:离心的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5分钟。可有效地进行细胞沉淀，去除消化酶，并保证细胞活性。

[0013] 上述颅神经嵴源性干细胞的培养方法:所述原代细胞的培养条件为将所述原代细胞置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液。该条件为体外模拟细胞生长的体内环境，保持细胞的生物学特性。

[0014] 具体的，上述颅神经嵴源性干细胞的培养方法，包括以下步骤:

[0015] （1）原代细胞获取与培养:在无菌条件下，切取妊娠11～12天鼠胚的颌突组织，剪碎后用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA，消化5～10分钟，DMEM/F12培养基终止消化后吹打使组织分散成细胞悬液，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清;加入含1O%FBS的DMEM/F12培养基使细胞重悬后通过75μm细胞筛，将过滤后细胞悬液分装入培养瓶中;沿培养皿边缘加入1O%FBS的DMEM/F12培养基，置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液;

[0016] (2)sox-2+细胞的分选:细胞铺满瓶底时，0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化30秒，1O%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清;加入0.01M的PBS洗涤，800～1000rpm离心3～5分钟;加入1:50的带荧光
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sox-2+抗体标记和PBS共500μm(细胞量约为1×1O)，在5%CO2、37℃培养箱乳化1h;PBS洗涤，在流式细胞细胞仪上进行分选，将获取sox-2+细胞继续培养传代。

[0017] 本发明的另一目的在于提供上述颅神经嵴源性干细胞的鉴定方法。此目的是通过以下措施实现的:

[0018] 一种颅神经嵴源性干细胞的鉴定方法，采用p75NTR鉴定细胞的神经嵴源性，采用CD29，CD44，CD90，CD105，Stro-1鉴定细胞的干细胞特性，并诱导脂肪、诱导成骨、诱导成软骨和诱导神经分化鉴定细胞多向分化特性。本发明不仅对常规体外鉴定的3代细胞进行鉴定，还对体外至第9代的细胞进行了鉴定，进一步评介了该细胞体外传代时其生物学特性NTR NTR的稳定性。sox-2基因分选后，采用p75 基因进行鉴定，p75 属于发育早期的全神经标记基因，是用于追溯神经嵴干细胞游走与衍化的经典标记物，可进一步从分子基因水平证实细胞的神经嵴源性。

[0019] 上述颅神经嵴源性干细胞的鉴定方法，包括以下步骤:

[0020] (1)颅神经嵴源性干细胞的神经嵴源性鉴定:待鉴定细胞铺满瓶底时，采用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化30秒，1O%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清;加入PBS洗涤，再次离心，弃上清，4%多聚甲醛固定20分钟，加入PBS洗涤，离心，弃上清;1%BSA-PBS封闭30分钟，PBS洗涤，离心，弃NTR上清;采用带荧光p75 抗体(1:100)标记细胞，过夜，在流式细胞仪上根据不同象限计算细胞阳性率。

[0021] (2)颅神经嵴源性干细胞的间充质干细胞源性鉴定和体外稳定性鉴定:步骤(1)NTR得到的p75 阳性颅神经嵴源性干细胞，铺满瓶底时，采用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化
30秒，1O%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～
5分钟，弃上清;加入PBS洗涤，再次离心，弃上清，4%多聚甲醛固定20分钟，加入PBS洗涤，离心，弃上清;1%BSA-PBS封闭30分钟，PBS洗涤，离心，弃上清;加入CD29，CD44，CD90，CD105，Stro-1，p75一抗(1∶100)过夜，加入PBS洗涤，再次离心，弃上清;加入荧光2抗(1∶800)乳化1小时，流式细胞仪检测阳性率。

[0022] (3)颅神经嵴源性干细胞的间充质干细胞多向分化特性鉴定步骤(2)得到的阳性5
颅神经嵴源性干细胞以1×10接种至6孔板内，分别加入脂肪诱导培养液、成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和神经分化诱导液，观察干细胞的多系谱分化特性。

[0023] 有益效果

[0024] (1)本发明方法获得的颅神经嵴源性干细胞来源于胚胎早期的特定组织，该时期神经嵴干细胞迁移至颌突组织后处于高度聚集状态，还未向其它系谱细胞进一步分化。

[0025] (2)本发明方法获得的颅神经嵴源性干细胞具有较好的生长活性和增殖潜能，培养过程中无需添加牛垂体提取物促进细胞增殖，也无需添加白血病抑制因子抑制干细胞分化。在体外持续传代过程中，细胞表型稳定，细胞增殖活性无明显差异，表明所分选的sox-2+颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的体外干细胞特性(即自我增殖与多向分化潜能)稳定，未出现自然分化现象。

[0026] (3)本发明获得的颅神经嵴源性干细胞具有外胚来源干细胞和中胚来源干细胞双NTR重特性。其中p75 主要用于外胚来源特性的鉴定，CD29、CD44、CD90、CD105主要用于中胚来源间充质干细胞特性的鉴定，Stro-1主要用于牙来源特性的鉴定。

[0027] 在发育过程中，颌面部的外胚间充质干细胞(即颅神经嵴源性干细胞)可进一步向成牙本质细胞、牙髓细胞、成骨细胞、成肌细胞、胶质细胞、神经元等多个谱系细胞分化，参与多种组织的发育。牙发育基因的启动是牙源性上皮与颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的相互诱导结果，成牙分化过程中外胚间充质干细胞的神经嵴源性具有不可替代性。

[0028] (4)本发明方法获得的颅神经嵴源性干细胞可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经元样细胞，显示了其作为胚胎早期干细胞的多潜能性。

[0029] (5)sox-2有效地分离、纯化颅神经嵴源性干细胞，为进一步深入研究其表型特征NTR和干细胞特性提供良好的体外干细胞模型。由于p75 是神经嵴干细胞的经典特异性标记NTR
物，二者的基因表达谱具有延续演变性，获得的sox-2+干细胞同时采用p75 进行验证，可进一步明确该细胞的颅神经嵴源性。本发明采用的分离技术结合干细胞具有直径较小的特点，获取的细胞纯度更高，在阐明牙发育机制及外周神经再生方面更具有优势。
附图说明:

[0030] 图1sox-2+颅神经嵴源性干细胞的分离与纯化:sox-2+颅神经嵴源性干细胞获取与分离后细胞的原代培养，免疫荧光显示p75阳性率为82.3%。

[0031] 图2sox-2+颅神经嵴源性干细胞的增殖活性:sox-2+颅神经嵴源性干细胞体外培养第3代和第9代细胞的增殖活性、细胞周期比较分析。

[0032] 图3sox-2+颅神经嵴源性干细胞体外培养第3代和第9代细胞、以及未分选前原代细胞的CD29，CD44，CD90，CD105，Stro-1，p75抗原表达的流式细胞术分析图。三种细胞表面标志物的表达对比研究(分选前原代颅神经嵴源性干细胞:A-F；第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞:G-L;第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞:M-R)。

[0033] 图4sox-2+颅神经嵴源性干细胞的成脂诱导分化:诱导脂肪分化后油红O染色、LPL及ppARc2mRNA表达。

[0034] 图5sox-2+颅神经嵴源性干细胞的成骨诱导分化:诱导成骨分化后茜素红染色、OCN及ColImRNA表达。

[0035] 图6sox-2+颅神经习作性干细胞的成软骨诱导分化:诱导软骨细胞分化后阿利辛蓝染色、AGG及Col IImRNA表达。

[0036] 图7sox-2+颅神经嵴源性干细胞的成神经诱导分化:诱导神经细胞分化后p75及NF-M免疫共聚焦荧光染色、NF-M及MAP-2mRNA表达。具体实施方式:

[0037] 本发明结合实施例和附图作进一步说明。

[0038] 实施例1

[0039] sox-2+颅神经嵴源性干细胞的分离与纯化

[0040] 取出11.5天SD孕鼠，脱颈处死，酒精浸泡l5min，超净台下解剖胚胎并切取颌突组织(解剖过程见图1-A)，0.01MPBS漂洗，尽量剪碎组织块，加入0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化5-10分钟，等体积的DMEM/F12培养基中和，轻轻吹打离散细胞因块，将形成的单细胞悬液。经孔径为70μm细胞筛过滤，800r/min离心5分钟，去上清，再加入0.01MPBS液重悬5
细胞再次离心，如此反复2次。收集细胞以1×10的密度接种至50ml培养瓶中，培养液为含10%FBS的DMEM/F12(100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素)培养基，置37℃含5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱培养。次日是传代(1：3传代)。

[0041] 待细胞长至70-80%时，采用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清;加入0.01M的PBS洗涤，800～1000rpm离心3～5分钟;加入1:50的带荧光sox-2+抗体标记和PBS共500μm，在5%CO2、37℃培养箱乳化1h。PBS洗涤，在流式细胞细胞仪上进行分选，将获取sox-2+细胞继续培养传代。分选后细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、辐射状。培养7天贴壁细胞80%-90%融合(培养过程见图1-B)。获取的sox-2+细胞，其分选结果及p75表达结果见图1-C，分选后sox-2+细胞的p75阳性率为82.3%。

[0042] 实施例2

[0043] sox-2+颅神经嵴源性干细胞表型特征鉴定

[0044] 取分选后第3代细胞和体外培养第9代细胞sox-2+颅神经嵴源性干细胞，以4
lXlO/孔接种于24孔板，每组设3个复孔。每日取1组，0.25%胰酶消化、计数，共计9天，绘制生长曲线。细胞群体倍增时间以TD＝txlog2/(logNt-logNO)计算，其中t为细胞生长天数，Nt为第t天细胞数量，NO为细胞接种数量。培养具有以下共性特征:细胞具有很好的增殖活性，第2天细胞完全伸展，保持梭形的细胞形态;第7-8天基本铺满并达到生长曲线高峰。sox-2+细胞第3代和第9代群体倍增时间分别为31.75小时和34.09小时。(图
2-A)。

[0045] 取分选后第3代细胞和体外培养第9代细胞sox-2+颅神经嵴源性干细胞，细胞消3
化后按1×10个细胞/孔的密度接种于96孔培养板内进行持续培养，加入10%FBS的DMEM/F12培养基培养，每组设3个复孔，分别1、3、5、7、9、11和13天进行检测。具体步骤如下:
每孔加入20μl0.5%MTT溶液和90μl1%FBS的DMEM/F12，继续培养4h;小心吸除液体，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶;设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基业砜)，在酶联免疫检测仪征490nm处测量各孔的吸光值(OD值)。sox-2+细胞第3代和第9代细胞在细胞存活和生长能力趋势一致。(图2-B)

[0046] 消化收集第3代细胞和体外培养第9代细胞sox-2+颅神经嵴源性干细胞，PBS漂洗2次，70%的酒精固定，4℃过夜;PBS漂洗2次，100mg/ml碘化丙啶和2mg/ml核糖核酸酶A染色，4℃下孵育30min。流式细胞仪分析细胞周期。细胞周期分析显示两种细胞中处于S期细胞具有相似的百分率(33.02%vs32.72%)(图2-C，D)，表明细胞经长期持续培养仍维持较高的细胞表型稳定性。

[0047] 待细胞长至70-80%时，采用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA消化收集分选原代颅神经嵴源性干细胞、第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞和第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清;加入0.01M的PBS洗涤，800～1000rpm离心;
轻轻吸除上清，PBS漂洗、离心2次。1%BSA室温封闭1h，PBS漂洗、离心2次。滴加按一定比例稀释(1∶100)的一抗工作液:CD29，CD44，CD90，CD105，Stro-1、p75过夜。PBS漂洗、离心2次，滴加绿色荧光二抗(1∶800)，37℃孵育30min。PBS漂洗、离心2次，送流式细胞仪检测。结果显示:sox-2+颅神经嵴源性干细胞的p75表达较分选前显著提高，表明流式分选可以进一步纯化神经嵴源性干细胞；sox-2+颅神经嵴源性干细胞在体外传代后其CD29，CD44，CD90，CD105，Stro-1、p75表达无明显变化(图3)。以上结果提示，本方法分选的sox-2+颅神经嵴源性干细胞具有间充质来源干细胞特性，且在体外传代生物学特性稳定。

[0048] 实施例3

[0049] sox-2+颅神经嵴源性干细胞多向分化潜能

[0050] 成脂诱导:取生长良好的第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞接种到载有盖玻片的6孔板内，成脂诱导液培养(1μmol/L地塞米松，200μmol/L吲哚美辛，0.5μmol/LIBMX，10mg/L胰岛素，10%FBS，DMEM/F12培养基)，每3天换1次液。10天后，4%多聚甲醛液固定
45min，PBS漂洗。油红O的工作液中浸15分钟，蒸馏水洗25分钟，苏木精复染15分钟，自来水洗5分钟。甘油明胶封固，显微镜下观擦察，摄片。RT-PCR检测:收集经成脂诱导的sox-2+颅神经嵴源性干细胞，PBS浦洗2次;每个培养皿加入1mlTrizol，放置5min，吹打，移入1.5ml离心管;加入200μl氯仿，使劲摇晃，然后在室温下放置5min;12000rpm，4℃，离心15min;转移上层水相到另一个离心管内(约400～500μl);加入等量异丙醇，混匀，室温下放置10min;12000rpm，4℃，离心10min，弃上清;75%乙醇1ml清洗沉淀物;7500rpm，
4℃，离心5min，弃上清;加入约15～25μl的DEPC处理水融解沉淀物;检测提取的RNA浓度。引物设计(见表1)，RT反应条件为:30℃10min，42℃3Omin，85℃5min，5℃5min，
4℃保存。PCR扩增条件为:94℃下预变性2min，94℃变性30s，58℃下退火30s，72℃下延长
45s，35个循环，72℃延伸10min。终产物进行0.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳，凝胶成像仪扫描图像。

[0051] 经脂肪诱导培养后，细胞形态由梭形变成椭圆形，细胞排列无序，体积增大;胞浆中出现高折光性的小脂滴，油红O染色显示脂滴为橙红色;RT-PCR结果证实LPL及ppARc2mRNA高表达(图4)。

[0052] 表1.RT-PCR引物

[0053]

[0054]

[0055] 成骨诱导:取生长良好的第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞接种到载有盖玻片的6孔板内，成骨诱导液培养(10μmol/L地塞米松，50μmol/L维生素C，10mmol/Lβ磷酸甘油钠，10%FBS，DMEM/F12培养基)，每3天换1次液。2周后，4％多聚甲醛液固定45min，PBS漂洗。茜素红的工作液中浸15分钟，蒸馏水洗25分钟，自来水洗5分钟，显微镜下观察，摄片。RT-PCR检测具体方法同上。sox-2+颅神经嵴源性干细胞经成骨诱导培养后由细胞形态由梭形开始变成立方型或多角型，细胞排列更加紧密，并逐渐出现钙化斑点;持续培养后茜素红染色显示细胞外基质钙盐沉积形成矿化结节;RT-PCR结果证实OCN及ColImRNA高表达(图5)。

[0056] 成软骨诱导:取生长良好的第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞接种到载有盖玻片的6孔板内，成软骨诱导液培养(10ng/mLTGF、10mmol/mL地塞米松、50mg/mL维生素C，10%FBS，高糖DMEM培养基)，每3天换1次液。2周后，4％多聚甲醛液固定45min，PBS漂洗。阿新蓝的工作液中浸15分钟，蒸馏水洗25分钟，自来水洗5分钟，显微镜下观察，摄片。
RT-PCR检测具体方法同上。sox-2+颅神经嵴源性干细胞经成软骨诱导培养后细胞形态明显增大，由梭形开始变成扁平或多边形，阿利辛蓝染色可见大量软骨样基质形成，RT-PCR结果证实AGG及Col IImRNA高表达(图6)

[0057] 成神经诱导:取生长良好的第3代sox-2+颅神经嵴源性干细胞接种到载有盖玻片的6孔板内，加入1mMβ-疏基乙醇DMEM/F12培养基(含10%FBS)预诱导24小时，再加入2%DMSO，200μM叔丁基-4-羟基苯甲醚，25mMKCl,2mM丙戊酸，10μM佛司可林，1μM氢化可的松，and5μg/ml胰岛素诱导。每2天换1次液。5天后，终止培养;取出载玻片，用PBS漂洗2次，3%多聚甲醛固定细胞30min;滴加含0.1%TritonX-100的PBS缓冲液使细胞透化15min;然后用滤纸将涂片周围水分擦干，1%BSA室温封闭1h;滴加NF-M一抗工作液，为1∶100;4℃冰箱过夜，PBS漂洗5min×3次;滴加有特殊荧光标记的二抗工作液(绿色)，37℃孵育1h。然后，用PBS漂洗5min×3次，将玻片冲洗干净;Hochest33258标记细胞核，激光共聚焦显微镜下观擦，摄片。RT-PCR检测具体方法同上。sox-2+颅神经嵴源性干细胞经成神经诱导培养后细胞突起明显变细、变长，核周胞浆出现皱缩，大多数细胞可变为典型的神经元样细胞，简单的双级细胞和复杂的多级细胞均有出现，多个神经元样细胞突起可相互延伸并形成网状。共聚焦免疫荧光染色分析证实神经元标志物p75与NF-M共表达阳性、RT-PCR结果证实NF-M及MAP-2mRNA高表达(图7)。

[0058] 综上所述，从SD大鼠胚胎颌突组织中分离和扩增、并通过流式分选的sox-2+颅神经嵴源性干细胞，具有神经嵴源性和间充质干细胞特性，体外扩增无需添加分化抑制物仍能保持干细胞特性，细胞表型稳定，并在特定体外分化诱导液中向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和神经元样细胞分化，是很好的研究神经嵴细胞的体外细胞模型。